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Abanico veterinario

versión On-line ISSN 2448-6132versión impresa ISSN 2007-428X

Abanico vet vol.10  Tepic ene./dic. 2020  Epub 30-Jun-2020

https://doi.org/10.21929/abavet2020.1 

Artículos originales

Efecto antibacteriano del extracto metanólico de Salix babylonica sobre bacterias de importancia en salud pública

Eddy González-Alamilla1 
http://orcid.org/0000-0001-7140-6698

Marco Rivas-Jacobo1 
http://orcid.org/0000-0003-3356-1499

Carolina Sosa-Gutiérrez2 
http://orcid.org/0000-0002-5109-4671

Lucía Delgadillo-Ruiz3 
http://orcid.org/0000-0002-6640-2753

Benjamín Valladares-Carranza4 
http://orcid.org/0000-0003-0306-3560

Carla Rosenfeld-Miranda5 
http://orcid.org/0000-0001-6120-2819

Adrián Zaragoza-Bastida2  * 
http://orcid.org/0000-0002-8537-5025

Nallely Rivero-Pérez2  * 
http://orcid.org/0000-0002-6154-9983

1Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Facultad de Agronomía y Veterinaria.

2Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Instituto de Ciencias Agropecuarias, Área Académica de Medicina Veterinaria y Zootecnia.

3Unidad Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Zacatecas. Zacatecas, México.

4Universidad Autónoma del Estado de México, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,

5Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Isla Teja s/n, Casilla 567, Valdivia, Chile


RESUMEN

El uso excesivo de antimicrobianos ha generado resistencia de los microorganismos a estos, se han buscado alternativas que sean eficaces para el tratamiento de enfermedades producidas por microorganismos resistentes o multirresistentes a antibióticos, dentro de estas alternativas están las plantas, las cuales por su contenido de compuesto secundarios presentan actividad antibacteriana. El objetivo del presente estudio fue caracterizar y determinar la actividad antibacteriana del extracto metanólico de Salix babylonica (SB) sobre bacterias de importancia en salud pública. Para la obtención del extracto se utilizó la técnica de maceración, se realizó una caracterización química cualitativa y cuantitativa por cromatografía de gases. Para determinar la actividad antibacteriana, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) y la caracterización del extracto permitió identificar compuestos fenólicos, cumarinas, lactonas, flavonoles, quinonas, saponinas, triterpenos y compuestos esteroidales, además de Timol (0.5319 mg/mL) y Carvacrol (0.4158 mg/ml). Con respecto a la actividad antibacteriana la mejor actividad se presentó contra Bacillus. subtillis (CMI: 12.5 mg/mL y CMB: 25 mg/mL), Listeria. monocytogenes y Staphylococcus. aureus (CMI: 25 mg/mL y CMB: 50 mg/mL). Se concluye que el extracto metanólico de SB puede ser una alternativa para el tratamiento de enfermedades producidas por bacterias resistentes o multirresistentes a antibióticos.

Palabras clave: Salix babylonica; caracterización; efecto antibacteriano

ABSTRACT

The excessive use of antibiotics, has generated resistance of microorganisms to these, have been searched effectives alternatives for treating diseases caused by resistant or multiresistant microorganism, and within of these alternatives are plants, which by its content of secondary compounds have antibacterial activity. The aim on the present experiment was characterize and determine the antibacterial activity of methanolic extract of Salix babylonica (SB) against important bacteria in public health. To obtain extract, the maceration technique was used, qualitative and quantitative (gas chromatography) chemical characterization was carried. For antibacterial activity, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) was determined, the characterization of the extract allowed the identification of phenolic compounds, coumarins, lactones, flavonols, quinones, saponins, triterpenes and steroidal compounds, also Thymol (0.5319 mg/mL) and Carvacrol (0.4158 mg/mL). The extract showed the best activity against Bacillus. subtilis (MIC: 12.5 mg/mL and WBC: 25 mg/mL), Listeria. monocytogenes and Staphylococcus. aureus (MIC: 25 mg/mL and MBC: 50 mg/mL). It is concluded that the methanolic extract of SB can be an alternative for the treatment of diseases produced by resistant or multiresistant bacteria to antibiotics.

Keywords: Salix babylonica; characterization; antibacterial effect

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades infecciosas provocadas por microorganismos, han sido unas de las causas más importantes de muerte en la humanidad (Lozano et al., 2012). Los agentes bacterianos incluyendo Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudonomas aeruginosa, Bacillus subtilis y Proteus vulgaris han provocado enfermedades infecciosas importantes dentro de la salud pública (Khan et al., 2013).

La introducción de agentes antimicrobianos en la medicina, ha sido una de las intervenciones más importantes para controlar y disminuir la prevalencia de las enfermedades infecciosas (Alós, 2015); sin embargo, una amenaza creciente en los últimos años que ha disminuido la eficacia de estos fármacos, es la resistencia bacteriana a los antibióticos; generada debido a que los microorganismos han adquirido la capacidad para evitar que un antimicrobiano actúe contra él. Como resultado, los tratamientos de elección se vuelven ineficaces, las infecciones persisten y pueden extenderse a otros individuos (WHO, 2017).

En la mayoría de las poblaciones de diferentes países en desarrollo, la humanidad ha usado plantas para tratar enfermedades infecciosas comunes, que podrían ser una alternativa potencial para producir nuevos fármacos de gran beneficio a la salud (Renisheya et al., 2011; Khan et al., 2013).

Una de las plantas considerada importantes para el estudio de sus propiedades fotoquímicas es Salix babylonica, conocido comúnmente como Sauce llorón. Esta especie pertenece al género Salix de la familia Salicáceas, Salix babylonica es una de las especies más conocidas dentro de los sauces, distribuido en algunas zonas de Asia, Europa y América; utilizada comúnmente como planta ornamental y medicinal (Wahab et al., 2018).

Existen reportes en los que se evidencian las propiedades farmacológicas asociadas a la evaluación de extractos de hojas, corteza y tallos; obtenidos a partir de Salix babylonica. Dentro de las propiedades fitoquímicas atribuibles a Salix babylonica, se encuentran: actividad antihelmíntica, antiséptica, antiartrítica, astringente, analgésica, anticancerígena, antipirética, antimalaria, antioxidante, antimicótica, antihelmíntica y antibacteriana; estas propiedades su asocian a su contenido de compuestos secundarios como fenólicos totales, flavonoides, terpenos y lignanos (Sulaiman et al., 2013; Wahab et al., 2018).

Con base en los planteamientos anteriormente mencionados, el objetivo del presente trabajo de investigación fue caracterizar y determinar la actividad antibacteriana del extracto metanólico de Salix babylonica, sobre bacterias de importancia en salud pública.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención del extracto

Para la obtención del extracto se recolectó aproximadamente 1 kg de material vegetal de Salix babylonica en diferentes etapas fenológicas, éstas fueron colectadas en el municipio de Tulancingo, Hidalgo. La parte aérea recolectada de Salix babylonica se llevó a secado a sombra a temperatura ambiente, posteriormente al secado se trituró y se realizó la técnica de maceración. Se maceraron 250 g del material seco en 1000 ml de metanol durante 48 horas a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Se obtuvo el extracto líquido de la maceración mediante una filtración con papel filtro (Whatman ® 42) y algodón. El extracto líquido obtenido fue concentrado a presión reducida en un evaporador rotatorio, con el fin de eliminar los solventes y concentrar los metabolitos secundarios, de acuerdo con la metodología descrita por Rivero et al., 2016.

Caracterización química del extracto metanólico de Salix babylonica

Perfil químico cualitativo: Al extracto se le realizó el perfil químico de acuerdo con el procedimiento descrito por Bañuelos-Valenzuela et al., 2018, para la de determinación de instauraciones, fenolicos, esteroles, triterpenos, cumarinas, sesquiterpenlactonas, flavonoides, alcaloides, tanidos, fluorataninos, esteroides y saponinas.

Cromatografía de gases: La composición química se determinó mediante una cromatografía de gases (CG; Agilent Tecnologías serie 6890N fabricado en U.S.A), con una columna polar DB_WAXetr, a 250 °C y 12.13 psi con un flujo de He 36.5 ml min-1 después de la inyección. Las condiciones para la columna fueron: temperatura inicial 50 °C de cero a dos min, aumentando de 10 en 10 °C hasta llegar a 250 °C, manteniendo la temperatura constante por 5 min para luego descender a 50 °C por dos min con un flujo de He de 1.6 ml min-1 a una presión de 12.13 psi y una velocidad promedio de 25 cm s-1, utilizando un detector de flama ionizante (FID), a una temperatura de 210 °C con un flujo de H2 de 40 ml min-1 y un flujo de aire de 450 ml min-1. Los estándares (Sigma-Aldrich), se utilizaron en concentraciones diferentes (cuadro1).

Cuadro 1.  Concentraciones de estándares empleados para la determinación química del extracto metanólico de Salix babylonica mediante cromatografía de gases. 

Estándar Compuesto mg/mL-1
Timol Carvacrol Linalol Terpineno Limoneno
1 10.373 8.284 7.744 7.154 8.496
2 5.186 4.142 3.872 3.577 4.248
3 2.593 2.071 1.936 1.789 2.124
4 1.297 1.035 0.968 0.894 1.062
5 0.648 0.518 0.484 0.447 0.531
6 0.324 0.259 0.242 0.224 0.265

Actividad antibacteriana

Para determinar la actividad antibacteriana del extracto metanólico de Salíx babylonica, se utilizaron los siguientes métodos: Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la concentración Mínima Bactericida (CMB), siguiendo las especificaciones del CLSI (CLSI, 2012).

La prueba de actividad antimicrobiana se llevó a cabo con las cepas ATCC 6538 de Staphylococcus aureus, 6633 de Bacillus subtilis, 35218 de Escherichia coli, 9027 de Pseudomonas aeruginosa, 14028 de Salmonella typhi, 10708 de Salmonella cholerasuis y 19113 de Listeria monocytogenes. Se inoculó una colonia de cada bacteria en caldo nutritivo (BD Bioxon), el cual fue incubado en agitación constante (70 rpm) por 24 horas a 37ºC. Trascurrido el tiempo de incubación, el inóculo se ajustó con caldo nutritivo al 0.5 del patrón de turbidez de Mc Farland, el cual corresponde a 150 x 106 cel/ml.

Para la determinación de la CMI se utilizó el método de microdilución en placa, utilizando concentraciones de 400, 200 100, 50, 25, 12.50, 6.25, 3.12 mg/ml, del extracto metanólico de Salix babylonica. Cada concentración fue preparada con caldo nutritivo (BD Bioxon). El procedimiento se realizó por triplicado en placas de 96 pozos, colocando 100 μl de cada una de las diluciones del extracto más 10 μl de la suspensión bacteriana, previamente ajustada a 0.5 de McFarland. Una vez realizada la inoculación la placa se incubó a 37°C durante 24 horas a 70 rpm en agitación constante, el control positivo fue Kanamicina (AppliChem 4K10421) a concentraciones de 64, 32, 16, 8.0, 4.0, 2.0, 1.0 y 0.5 µg/ml y el control negativo fue caldo nutritivo.

Para determinar la CMI se empleó un método colorimétrico, basado en el uso de sales de tetrazolium (Balouiri et al., 2016). Una vez transcurrido el tiempo de incubación se agregaron 20 μl de una solución al 0.04% (w/v) de p-iodonitrotetrazolium en cada pozo; se incubó por 30 minutos a 37°C y se procedió a hacer la lectura, determinándose como la concentración mínima inhibitoria, la concentración a la cual la solución vira a rosa (Kaewpiboon et al., 2012; Mothana et al., 2009).

Para determinar la CMB, previa adición del p-iodonitrotetrazolium, se inocularon 5 μl de cada pozo en agar Mueller Hinton, para posteriormente incubar a 37°C durante 24 horas. Trascurrido el tiempo de incubación se procedió a hacer la lectura para determinar la concentración mínima bactericida del extracto, es decir la concentración a la cual no se observó crecimiento bacteriano en la placa.

RESULTADOS

La caracterización cualitativa realizada al extracto metanólico de Salix babylonica, indican la presencia de insaturaciones, oxidrilos fenólicos, cumarinas, lactonas, flavonoles, quinonas, saponinas, aromaticidad y polifenoles; además de ser positivo a la prueba de Lieberman-Buchard, la cual indica la presencia de triterpenos y compuestos esteroidales. (Cuadro 2).

Cuadro 2 Pruebas cualitativas de perfil químico del extracto metanólico de Salix babylonica. 

Prueba Resultado
Insaturación +
Oxidrilos Fenolicos +
Cumarinas +
Lactonas +
Salkowski -
Flavonoles +
Flavonas -
Chalconas -
Quinonas +
Shinoda -
Sesquiterpenlactonas -
Agitación +
Bicarbonato -
Saponinas +
Aromaticidad +
Triterpenos +
Taninos -
Florataninos +
Esteroides +

Composición química

El análisis en el cromatógrafo de gases fue de 20 min con un tiempo de retención para terpineno de 6.40 min, limoneno 6.66 min, linalol 11.28 min, timol 18.04 min y carvacrol 18.37 min. Para calcular la concentración de las muestras se trabajó con cinco estándares con seis concentraciones cada uno (cuadro 1).

Una vez realizadas las curvas de calibración y teniendo las ecuaciones, se determinó que el extracto metanólico de Salix babylonica contiene Timol y Carvacrol en concentraciones de 0.5319 mg/ml, 0.4158 mg/ml respectivamente. Cuadro 3.

Cuadro 3 Composición química del extracto metanólico de Salix babylonica 

Estándar/ Extracto Compuesto mg/mL
Terpineno Limoneno Linalol Timol Carvacrol
1 10.373 8.284 7.744 7.154 8.496
2 5.186 4.142 3.872 3.577 4.248
3 2.593 2.071 1.936 1.789 2.124
4 1.297 1.035 0.968 0.894 1.062
5 0.648 0.518 0.484 0.447 0.531
6 0.324 0.259 0.242 0.224 0.265
Salix babylonica 0 0 0 0.5319 0.4158

Actividad antibacteriana

Concentración mínima inhibitoria

La concentración mínima inhibitoria del extracto metanólico de Sálix babylonica, fue de 100 mg/ml para Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis y Pseudomonas aeruginosa; 25 mg/ml para Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. La concentración más baja a la que el extracto tuvo actividad fue de 12.5 mg/ml, frente a Bacillus subtillis (cuadro 4).

Cuadro 4 Concentración Mínima Inhibitoria del extracto metanólico de Salix babylonica 

Bacteria Concentraciones (mg/mL)
400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12
Escherichia coli - - CMI + + + + +
Salmonella typhi - - CMI + + + + +
Salmonella cholerasuis - - CMI + + + + +
Pseudomonas aeruginosa - - CMI + + + + +
Staphylococcus aureus - - - - CMI + + +
Listeria monocytogenes - - - - CMI + + +
Bacillus subtillis - - - - - CMI + +

(-) Sin cambio de color, (+) Cambio de color

Concentración mínima bactericida

Se determinó que la concentración mínima bactericida del extracto metanólico de Sálix babylonica fue 200 mg/ml; para Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis y Pseudomonas aeruginosa, 50 mg/ml; y para Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus y de 25 mg/ml para Bacillus subtillis (cuadro 5).

Cuadro 5 Concentración Mínima Bactericida del extracto metanólico de Salix babylonica 

Bacteria Concentraciones (mg/mL)
400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12
Escherichia coli - CMB + + + + + +
Salmonella typhi - CMB + + + + + +
Salmonella cholerasuis - CMB + + + + + +
Pseudomonas aeruginosa - CMB + + + + + +
Staphylococcus aureus - - - CMB + + + +
Listeria monocytogenes - - - CMB + + + +
Bacillus subtillis - - - - CMB - - -

(-) Sin cambio de color, (+) Cambio de color

DISCUSIÓN

Por medio de las pruebas cualitativas se determinó la presencia de insaturaciones, oxidrilos fenólicos, cumarinas, lactonas, flavonoles, quinonas, fluorataninos, esteroides triterpenos y saponinas en el extracto metonólico de Salix babylonica. En estudios previos se han identificado compuestos como tritetracontano, 1,2,3-propanetriol éster ácido octadecanoico, éster metílico del ácido hexadecanoico y 1,3-dioxano-4-(hexadecil oxi)-2-pentadecilo; la mayoría de ellos clasificados como compuestos fenólicos, además de 7-O-β-D-glucopiranosido de luteolina, luteolina y crisoeriol; compuestos clasificados como flavonoides (Salem et al., 2011).

Se han reportado actividades biológicas como anticancerígena, antiulcerosa, antimalaria, antidiarreica, antimicótica, antitusígena, antinflamatoria, antihelmíntica y antibacteriana; en estudios realizados con compuestos fenólicos, alcaloides, glicósidos y terpenos (Hernández-Alvarado et al., 2018).

Por otro lado, la cromatografía de gases permitió identificar Timol y Carvacrol a concentraciones de 0.5319 mg/ml, 0.4158 mg/ml respectivamente. Estos compuestos están clasificados como aceites esenciales de naturaleza volátil, con algunas actividades biológicas reportadas como: expectorantes, antifúngicas, antiinflamatorias, analgésicas, antisépticas, antioxidantes, antirreumáticas, antiespasmódico, anti-hepatotoxicas y antibacterianas; tanto frente a bacterias Gram positivas como Gram negativas (Magi et al., 2015).

Al realizar la evaluación antibacteriana del extracto metanólico de Salix babylonica, se determinó que el extracto presenta mejor actividad frente a bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Bacillus subtilis); que contra bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis, Pseudomonas aeruginosa). Este efecto se fundamenta en la estructura propia de las bacterias Gram negativas, que al contar con una membrana fosfolipídica que impide que la pared celular sea penetrada por solutos lipofílicos; mientras las porinas constituyen una barrera selectiva para los solutos hidrofílicos, por lo que la bacteria está protegida de ser penetrada por compuestos como antibióticos o algunos metabolitos secundarios derivados de las plantas (Kaye et al., 2004; Ndhlala et al., 2015).

Para la determinacion de la actividad antibacteriana, es importante determinar Concentracion Minima Inhibitoria (CMI) y la Concentracion Minima Bactericida (CMB); definiéndose como CMI a la concentración más baja de agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento del microorganismo, detectados de forma visual (CLSI, 2012). En el presente experimento para determinar el punto final de la CMI, se empleó un método colorimétrico, basado en el uso de sales de tetrazolium (Balouiri et al., 2016); el cual permite observar un cambio de color de amarillo a rosa, provocado por la entrada de esta sal en la célula, la cual se reduce por las oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H y las deshidrogenasas de las células metabólicamente activas, produciendo el cambio de color a rosa (Berridge et al., 2005).

Sulaiman et al., en 2013, realizaron un estudio en el cual evaluaron la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de corteza de Sálix alba, perteneciente al género sálix y familia salicaeae; igual que Sálix babylonica. En dicho estudio determinaron que Sálix alba tiene mejor actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus; mediana actividad contra Pseudomonas aeruginosa y no presentó efecto contra Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. Las concentraciones evaluadas fueron 10, 20, 40, 60 y 80 mg/ml, utilizando la técnica de difusión en agar; observándose los mayores halos de inhibición a 80 mg/ml. Los resultados de dicho estudio correponden con los observados en el presente experimento, ya que el extracto tuvo mejor efecto contra las bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus, 25 mg/ml; Listeria monocytogenes, 25 mg/ml y Bacillus subtilis, 12.5 mg/ml), que contra las bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis y Pseudomonas aeruginosa, 100mg/ml, para cada una); sin embargo, el extracto se obtuvo de la corteza de Sálix alba. Las concentraciones cambian y la técnica también, por lo que los resultados no son 100% comparables, aunque las arbóreas pertenecen al mismo género y familia.

Por otro lado, en un estudio realizado por Wahab y colaboradores en 2018, quienes evaluaron los extractos metanólicos de las hojas y la corteza de Sálix babylonica; además de sus fracciones de éter de petróleo, cloruro de metileno y acetato de etilo (diluidos en dimetilsulfóxido), para determinar su actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa), utilizando la técnica de difusión en agar y el extracto a una concentracion de 100 µg. Los resultados mostraron que tanto el extracto metanólico de las hojas y de la corteza tienen actividad antimicrobiana de moderada o débil, contra los microorganismos desafiados; observándose los mayores halos de inhibición (10 mm) con Pseudomonas aeruginosa, seguida de Klebsiella pneumoniae (9 mm), finalmente Escherichia coli, Staphylococcus aureus (8 mm).

Debido a que en los estudios mencionados únicamente se aplican técnicas para determinar la sensibilidad del microorganismo a determinado compuesto por el método de difusión en agar; no es posible comparar los resultados con los obtenidos en el presente experimento, ya que en el presente se determinó la concentración mínima inhibitoria por el método de microdilución en placa; además de que en el estudio de Wahab y colaboradores, se utilizó dimetil sulfóxido, para diluir los extractos y fracciones; compuesto que se utiliza para incrementar la permeabilidad de la membrana bacteriana, incrementando la actividad de los compuestos y reduciendo las concentraciones de uso (Borges et al., 2013; Sulaiman et al., 2013; Wahab et al., 2018).

La Concentracion Minima Inhibitoria, se define como la concentración más baja de agente antimicrobiano-necesaria para matar el 99,9% del inóculo final, después de la incubación durante 24 h bajo un conjunto estandarizado de condiciones descrito por el CLSI (Balouiri et al., 2016). La determinacion de la CMI no es una opción viable para conocer al 100% la eficacia de un fármaco o compuesto, ya que dentro de cada pozo todavía puede haber células viables si el fármaco evaluado solo tuvo un efecto bacteriostático sobre las especies bacterianas en estudio (Wiegand et al., 2008).

En el presente experimento se determiaron las CMB del extracto metanólico, frente a Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis y Pseudomonas aeruginosa (200 mg/ml); Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus (50 mg/ml) y Bacillus subtillis (25 mg/ml); sin embargo, no existen estudios reportados con Sálix babylonica u otra especie del género Sálix, con el cual se haya reportado dicha actividad.

CONCLUSIÓN

En el presente estudio se demostró que el extracto metanólico de Sálix babylonica tiene actividad antibacteriana potencial sobre algunos patógenos bacterianos de importancia en salud pública; siendo una alternativa para el tratamiento de enfermedades producidas por bacterias resistentes o multirresistentes a antibióticos.

LITERATURA CITADA

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Recibido: 25 de Febrero de 2019; Aprobado: 16 de Septiembre de 2019

*Autor responsable y de correspondencia: Adrián Zaragoza-Bastida, Nallely Rivero-Perez. Rancho universitario Av. Universidad km. 1, Ex Hacienda de Aquetzalpa, Apartado Postal No. 32, Tulancingo de Bravo, Hidalgo, México. eddynglez24@gmail.com, marco.rivas@uaslp.mx, carolina_sosa@uaeh.edu.mx, delgadillolucia@gmail.com, crosenfe@uach.cl, adrian_zaragoza@uaeh.edu.mx, nallely_rivero@uaeh.edu.mx.

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