INTRODUCCIÓN

El metano (CH₄), producido por los rumiantes domésticos representa una pérdida del 2 al 12 % de la ingesta de energía bruta (EB) (^{Hristov et al., 2015}, ^{Moumen et al., 2016}), ineficiencia importante en los sistemas de producción de estos (^{Moss et al., 2000}, ^{Moumen et al., 2016}). Un mol de CH_4, tiene la misma EB como para eliminar acetato; es decir 0.88 MJ mol^-1, así la energía metabolizable neta de cualquier dieta aumenta el poder reductor de la formación CH₄ en los productos finales que son utilizables por el rumiante. Un ovino adulto consume 22 Kg materia seca (MS), con pérdida promedio de energía bruta (EB) del 6 %, y produce alrededor de 27 mol CH_4, que equivale a 2.5 kg de glucosa fermentada a 27 mol de acetato (^{Johnson et al., 1991}, ^{Moss et al., 2000}).

La fermentación y degradación ruminal es principalmente el resultado de la actividad de bacterias, protozoos y hongos que habitan en el rumen del animal, los cuales actúan sobre las diferentes fracciones que componen el alimento. De manera particular, esta microflora ruminal hace posible que la fracción fibrosa ingerida que no puede ser enzimáticamente digerida por el animal, sea degradada y fermentada hacia ácidos grasos volátiles, gases de fermentación y calor; o incorporada a la materia microbiana digestible (^{Alejos et al., 2018}).

^{Galicia et al. (2017)}, señalan que la capacidad de adaptarse rápidamente a los cambios del entorno es una de las principales características de la célula bacteriana; el rumen es un entorno altamente dinámico, y ninguno de los cambios es permanente, debido a las diversas especies microbianas que se encuentran en el rumen. Redes de transducción de señales, son las vías de procesamiento de información que reconocen diversos estímulos físicos y químicos, amplificación, procesamiento de señales y que desencadenan las respuestas de adaptación de la célula bacterianas.

^{Getachew et al. (2005)} y ^{Tapio (2017)}, mencionan que la fermentación microbiana que ocurre en el rumen, genera productos que pueden ser aprovechables por el animal; tales como los ácidos grasos volátiles, proteína microbiana y otro tipo de productos que se consideran desechos, como el dióxido de carbono y el metano. La fermentación microbiana de la fibra comprende varias acciones secuenciales, las cuales son señaladas por ^{France (2005)} y éstas son: hidratación, adherencia de los microorganismos apropiados, liberación de una mezcla de enzimas hidrolíticas y finalmente hidrólisis. La liberación resultante de monómeros es seguida por su posterior degradación intracelular en ácidos grasos volátiles (AGV) y gases de fermentación.

Debe considerarse que, junto a los carbohidratos, la fermentación de los lípidos y proteína de la ración también contribuyen en la producción de ácidos grasos volátiles; siendo menor para los lípidos y considerable para las proteínas cuando las dietas tienen alto contenido de proteína degradable en el rumen (^{Popova et al., 2017}). Para la población microbiana, la mayoría de estos AGV constituyen productos de desecho; pero para el rumiante representan la principal fuente de energía absorbida, lo que corresponde de un 50 a 70 % de la energía digestible (^{Zhang, 2017}). Se reporta que del 6 al 10 % de la energía bruta consumida por una vaca se convierte a metano, y se elimina por vía respiratoria (^{Eckard et al., 2010}). El exceso de dihidrógeno (H₂) generado durante la conversión de glucosa a ácido acético o butírico, y el CO₂ producido por la descarboxilación de metabolitos durante la fermentación, son utilizados por arqueas metanogénicas; las cuales los utilizan como sustratos para formar metano (^{Alayón et al., 2018}). Cabe resaltar la relevancia de los protozoos en los procesos de formación de metano, pues ellos mantienen una relación simbiótica con las arqueas metanogénicas, con quienes están asociados intra y extracelularmente y realizar la transferencia de este hidrógeno (^{Hook et al., 2010}).

Existen metodologías usadas para reducir la cantidad de CH₄ producido por los rumiantes; entre ellas la implementación de aditivos químicos en la alimentación del ganado; sin embargo, el uso de estos se ha visto limitado por la aparición residual en los productos de consumo humano, lo que originó su prohibición en algunas legislaciones, como la de la Unión Europea en enero de 2006 (^{Alejos et al., 2018}). Estas medidas dieron origen a la búsqueda de nuevas estrategias y alternativas orientadas al uso de aditivos naturales, como los extractos de plantas; los cuales son una opción en la alimentación del ganado para modificar su fermentación ruminal de manera positiva y mitigar las emisiones de CH₄ entérico (^{Wallace, 2004}).

Por ello, las prácticas orientadas a la mitigación de metano, pueden constituirse en factores importantes que impactan en la rentabilidad de un sistema de producción (^{Alayón et al., 2018}). En este sentido, es importante considerar que cualquier práctica de mitigación que requiera una inversión adicional y que no sea compensada por agentes externos, o que afecte a la productividad animal, o aumente los costos de producción; es muy probable que se ha rechazado por el productor (^{Gerber et al., 2013}).

Una alternativa de mitigación para evitar incrementos en la producción de metano, es el uso de extractos de plantas; los cuales contienen compuestos bioactivos que han sido investigados como alternativa en nutrición animal, cambiando la degradabilidad y fermentación del alimento; este efecto está relacionado con su actividad química y/o propiedades antimicrobianas de los extractos (^{Patra y Saxena, 2010}). Por lo tanto, el objetivo fue obtener y caracterizar los extractos de plantas (Larrea tridentata, Origanum vulgare, Artemisa ludoviciana y Ruta graveolens), para probarlas en la digestibilidad ruminal in vitro y cuantificar la producción de gas, AGV y producción de metano.

MATERIAL Y MÉTODOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados en rendimiento de los extractos L. tridentata, O. vulgaris, A. ludiviciana y R. graveolans (tabla 1), se deben al tiempo de concentración de la muestra en el equipo Soxleth, obteniendo el volumen del extracto (ml), equivalente al rendimiento en porcentaje (w/w), esto depende según el tiempo y modo de proceso, desde su recolección hasta su extracción. Los rendimientos de los extractos uno y dos de L. tridentata fueron de 11.6 % y 30 % respectivamente, esto se debe a el tiempo de concentración en el equipo Soxleth.

Para los extractos de O vulgaris, los rendimientos fueron de 13.8 % y 10 %. ^{Albado et al. (2001)}, informan diferentes rendimientos según el tiempo y modo de proceso, desde su recolección hasta su extracción. Para A. ludiviciana el mayor rendimiento fue en el extracto seis, con un 35 %, y el menor en el extracto cinco con un 12 %. Por último, el rendimiento del extracto de R. graveolans fue de 10.5 %.

Los extractos preparados se analizaron por cromatografía de gases para conocer su composición química. El tiempo de corrimiento de los estándares en el CG fue de 18 min. con un tiempo de retención para terpineno de 3.524 min., limoneno 3.62 min., linalol 4.218 min., timol 8.870 min. y carvacrol 9.456 min. El volumen de inyección tanto para estándares como para muestras fue de 2 µL. En la tabla 2 se muestran las concentraciones empleadas de los estándares para la determinación de la concentración en las muestras, lo que permitió realizar una curva de calibración de la señal medida en función de la concentración del análito. La calibración permitió estimar los parámetros para determinar la linealidad de esa curva, y en consecuencia la capacidad de un método analítico para obtener resultados, que fueran directamente proporcionales a la concentración del compuesto en la muestra. En la tabla 3 se muestra la composición química de los extractos de L. tridentata O. vulgare, A. ludoviciana y R. graveolens.

Para la composición química se determinaron carvacrol, timol, terpineno, linalool y limoneno. En los extractos uno, dos y tres de L. tridentata se encontraron los compuestos timol y carvacrol en concentraciones para timol de 4.30 mg ml^-1 y 0.30 mg ml^-1 respectivamente, obtenidos mediante el uso de la ecuación de la regresión lineal de los estándares utilizados. Mientras que carvacrol las concentraciones fueron 7.79 mg ml^-1 y 4.43 mg ml^-1, siendo mayor la concentración de este compuesto. Partes de las plantas medicinales (raíces, hojas, ramas, cortezas/tallos, flores y frutos) son comúnmente ricos en terpenos (carvacrol, citral, linalool y geraniol) y compuestos fenólicos (flavonoides y ácidos fenólicos), y estos han sido eficaces como aditivos alimentarios ( ^{Cai et al.,2004}).

En los extractos de O. vulgaris se encontró que el extracto tres, entre su composición está el limoneno (0.6 mg ml^-1), linalool (0.125 mg ml^-1), timol (4.18 mg ml^-1) y carvacrol (9.10 mg ml^-1); el extracto cuatro se encontró terpineno a una concentración de 0.063 mg ml^-1, pero no limoneno. ^{Albado et al. (2001)}, reporta en aceites de orégano la presencia de terpineoles, fenoles y compuestos relacionados metabólicamente con el carvacrol al 9 % y 12.19 % de terpineno.

En cuanto a la composición química de los extractos de A. ludoviciana, se encontró el extracto cinco: terpineno (0.051 mg ml^-1), linalool (0.288 mg ml^-1), timol (0.025 mg ml^-1) y carvacrol (0.049 mg ml^-1). Para el extracto seis los compuestos fueron linalool (0.116 mg ml^-1), timol (0.013 mg ml^-1) y carvacrol (0.023 mg ml^-1). ^{Kordali et al. (2005)} investigaron la composición química de A. ludoviciana, encontraron que el extracto contiene principalmente anetol (81 %), beta-ocimeno (6.5 %), limoneno (3.0 %) y metileugenol (1.8 %); ninguno de estos compuestos reportados fue identificados en el presente trabajo. En el extracto de R. graveolans se encontró limoneno. ^{De Feo et al. (2002)} reportan que los terpenoides constituyen 11.2 % del aceite de R. graveolans con α-pineno (1.3 %), limoneno (3.0 %) y cineole (2.9 %), como los principales constituyentes de monoterpenos. Los resultados coinciden con los autores en la determinación de limoneno, más no en la concentración.

En la figura 1 se observa la cinética de degradación ruminal aplicando para la modificación de la fermentación de extractos de las plantas L. tridentata O. vulgare, A. ludoviciana y R. graveolens. En la técnica de producción de gas in vitro se observó en el extracto de L. tridentata a 100 µL mayor producción de gas en el extracto uno (168.9 ml g^-1) (figura 1); pero conforme aumentó la concentración del extracto fue disminuyendo, siendo a 665 µL de 50 ml g^-1 (figura 3).

Figura 1 Digestibilidades de extractos a una dosis de 100 µL dL^-1 de líquido ruminal. 

En las digestibilidades para los extractos de O. vulgaris a 100 µL, la mayor producción de gas se reporta en el extracto tres (98.54 ml g^-1), pero conforme aumentó la concentración del extracto también se incrementó la producción de gas, a 665 µL de 180.06 ml g^-1. Para el extracto cuatro la producción de gas fue (665 µL), de 181.41 ml g^-1. Para las digestibilidades de los extractos de A. ludoviciana a 100 µL, 330 µL (figura 2) y 665 µL en producción de gas en los extractos cinco y seis fue muy similar 232 ± 27 ml g^-1; en estas digestibilidades no se ve un cambio si se adiciona más o menos volumen. Por último, el extracto siete de R. graveolans reporta a 100 µL un volumen de 222.39 ml g^-1, a 330 µL 219.19 ml g^-1 y a 665 µL 210.86 ml g^-1 siendo mayor que el control de alfalfa empleado (117.23 ml g^-1).

Figura 2 Digestibilidades de extractos a una dosis de 330 µL dL^-1 de líquido ruminal. 

Figura 3 Digestibilidades de extractos a una dosis de 665 µL dL^-1 de líquido ruminal. 

En la tabla 4 se puede observar las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos y las diferencias significativas que existen entre los diferentes extractos y las dosis aplicadas de cada uno de ellos; confirmando de forma estadística que el gas (mg/ml) que se produjo, mostró diferencia estadísticamente significativa (p<0.05), ya que la mayor producción de gas se obtuvo en la dosis de extracto (330 µL) de A. ludoviciana.

Los compuestos secundarios de plantas, son reconocidos como agentes antimicrobianos que actúan contra las bacterias, protozoos y hongos. Los compuestos fenólicos son los principales componentes activos (^{Dorman y Deans, 2000}, ^{Burt, 2004}), y la actividad antibacteriana se puede dar por una variedad de sustancias no fenólicas (^{Newton y Van 2002}; ^{Burt, 2004}).

El modo de acción antimicrobiana, se considera principalmente por el potencial en la membrana de la célula bacteriana al desintegrar las estructuras de ésta, que provoca la fuga de iones; sus efectos sobre la actividad de los microorganismos ruminales depende de las especies de plantas consumidas y de su composición química. Monoterpenos particularmente alcoholes monoterpenos y aldehídos, inhiben fuertemente el crecimiento y el metabolismo de los microbios del rumen; mientras que los hidrocarburos monoterpenos inhiben ligeramente y, a veces estimulan la actividad microbiana del rumen (^{Benchaar et al., 2008}). Los efectos de estos compuestos son modulados por el pH del rumen, la dieta en la que se incluyen y por métodos de preparación y de extracción (^{Patra y Saxena, 2010}; ^{Patra y Yu, 2014}).

Se ha reportado que los extractos y aceites de plantas inhiben a las bacterias productoras de nitrógeno amoniacal, decreciendo así la desamimación de los aminoácidos, principalmente en dietas que contienen cantidades no muy altas de proteína (^{Patra y Saxena, 2010}). También se ha observado que el número total de bacterias viables no es afectado, es decir cambian solamente las proporciones de grupos bacterianos; pero en estudios in vitro donde se han incluido dosis altas, como por ejemplo 400 µg ml^-1 de timol en comparación con las comúnmente reportadas en la literatura, sí provocan descenso en el número total de microorganismos (^{McKay y Blumberg, 2006}). Las modificaciones en el total y proporción de los AGV impactan sobre los perfiles de producción de metano, sobre todo si reduce la proporción de acetato y se incrementa la de propionato; por lo tanto, cambios en estos repercutirán positiva o negativamente en la producción de metano.

En volumen de 100 µL por cada 100 ml de líquido ruminal, al final de la digestibilidad se tomó muestra para la determinación de AGV; los resultados se muestran en la tabla 5. Asimismo, se reporta la producción de metano obtenida por la ecuación estequiométrica; de ^{Moss et al. (2000)}, encontrando la mayor producción en metano con el extracto tres de O. vulgaris con 1.162 g L^-1, y la mínima en el extracto de A. ludoviciana 0.204 g L^-1.

Para la muestra donde se agregó 300 µL por cada 100 ml de líquido ruminal, los resultados encontrados son los siguientes, la mayor digestibilidad se reporta en las muestras cinco y seis correspondientes al extracto de A. ludoviciana. En la tabla 5 se observa los resultados de los AGV y la producción de metano, siendo los extractos seis de A. ludoviciana (1.030 g L^-1) y siete de R. graveolans (1.029 g L^-1) los de mayor producción generados en esta digestibilidad. Para la dosis de 665 µL los resultados obtenidos son los siguientes; mayor digestibilidad se reporta en las muestras cinco y seis correspondientes al extracto de A. ludoviciana. En la tabla 5 se observa las concentraciones de los AGV y la producción de metano, siendo mayor en el extracto cinco de A. ludoviciana (1.148 g L^-1) y la menor producción de metano se reporta en el extracto uno de L. tridentata generando 0.193 g L^-1.

En cuanto a la producción de AGV, la menor producción de ácido acético se reportó en el extracto uno con 665 µL, siendo de 0.680 g L^-1 (producción de gas 50 ml g^-1); mientras que el extracto dos presentó la mayor concentración a 100 µL (2.411 g L^-1); siendo éste el que menor cantidad de gas produjo a esta concentración (81.62 ml g^-1). Para ácido propiónico se inhibe la producción de este AGV, sólo encontrándose en el extracto dos a 100 µL (1.197 g L^-1), y en el extracto uno a 665 µL (0.436 g L^-1). El ácido butírico presentó concentración no mayor a 0.622 g L^-1 100 µL, 330 µL y 665 µL. En cuanto a la producción de metano calculada fue menor en el extracto uno a 330 µL (0.554 g L^-1) y a 665 µL (0.193 g L^-1) con respecto a el estándar de alfalfa que produjo 0.514 g L^-1 de metano; la mayor producción de metano se reporta a 665 µL en el extracto dos (1.002 g L^-1), siendo ésta la mayor producción de gas (126.94 ml g^-1) a este volumen de extracto. ^{Agarwal et al. (2009)} y ^{Cobellis et al. (2016)}, reportan que al adicionar extractos y aceites de plantas en la producción de AGV, éstos se modifican; ellos reportan que la relación de acetato-propionato se incrementa; aunque en otros estudios no se han encontrado diferencias al adicionar extractos (^{Ravindra et al., 2009}, ^{Wang et al., 2009}).

La menor producción de ácido acético se reportó en el extracto tres con 665 µL, siendo de 0.825 g L^-1 (producción de gas 180.54 ml g^-1); mientras que el extracto tres presentó la mayor concentración a 100 µL (2.145 g L^-1), siendo éste uno de los que menos gas produjo (98.54 ml g^-1).

Para ácido propiónico se inhibe la producción de este AGV, sólo encontrándose en el extracto cuatro a 330 µL (0.947 g L^-1) y una producción de gas de 143.32 mL g^-1. Mientras que el ácido butírico presentó la concentración mayor de 0.539 g L^-1 a 100 µL, y la menor concentración se reporta en el extracto cuatro a 330 µL (0.014 g L^-1). En cuanto a la producción de metano calculado fue menor en el extracto tres a 665 µL (0.536 g L^-1), y en el extracto cuatro a 665 µL (0.590 g L^-1), con respecto a el control de alfalfa que produjo 0.514 g L^-1 de metano. La mayor producción de metano se reporta a 100 µL en el extracto tres (1.162 g L^-1), siendo ésta una de la menor producción de gas (98.54 mL g^-1) a este volumen de extracto.

El extracto seis con 100 µL presentó una concentración de ácido acético de 0.625 g L^-1 (producción de gas 223.45 ml g^-1), mientras que el extracto cinco presentó la mayor concentración a 665 µL (1.997 g L^-1), con una producción de gas de 226.54 mL g^-1. Para ácido propiónico se inhibe la producción de este AGV. Mientras que el ácido butírico presentó concentraciones no mayores a 0.746 g L^-1 a 100 µL, 330 µL y 665 µ. La menor producción se observa a 100 µL en el extracto seis (0.076 g L^-1).

En cuanto a la producción de metano calculado, fue menor en el extracto cinco a 100 µL (0.204 g L^-1) y en el seis a 100 µL (0.312 g L^-1), con respecto al control de alfalfa que produjo 0.514 g L^-1 de metano. La mayor producción de metano se reporta a 665 µL en el extracto cinco (1.148 g L^-1), siendo ésta la mayor producción de gas (226.54 mL g^-1) a este volumen.

En el extracto de R. graveolans a 100 µL, la producción de ácido acético se reportó de 1.596 ml g^-1 (producción de gas 222.39 ml g^-1), a 330 µL de 1.869 g L^-1 (producción de gas 219.19 ml g^-1) y a 665 µL de 1.947 mL g^-1 (producción de gas 210.86 ml g^-1); mientras que el estándar de alfalfa reporta 0.923 ml g^-1 siendo mayor la encontrada en el extracto siete a 330 µL y a 665 µL. Para ácido propiónico la producción es a 100 µL de 0.746 g L^-1 y a 665 µL de 0.883 g L^-1; mientras que el ácido butírico presentó la concentración mayor de 0.469 g L^-1 a 330 µL; la menor producción se observa a 100 µL de 0.029 g L^-1. En cuanto a la producción de metano calculado, fue menor a 100 µL (0.525 g L^-1) (siendo donde se produjo la mayor cantidad de gas 222.39 ml g^-1) y a 330 µL se produjo 1.029 g L^-1; el estándar de alfalfa produjo 0.515 g L^-1 de metano, lo que nos indica que no hubo disminución de éste con el extracto de R. graveolans.

Debido a que del 40 al 60 % del total de los gases de efecto invernadero (GEI) de la ganadería provienen de la fermentación entérica, el manejo del estiércol y las diferentes actividades relacionadas con la obtención de alimentos para los animales (^{Sejian et al., 2015}); una estrategia a seguir y considerar para la mitigación de metano se deberá enfocar a la modificación de la fermentación ruminal sin alterar la producción animal, mejorando la conversión del alimento.

CONCLUSIÓN

El extracto de O. vulgaris con mayor concentración de timol y carvacrol presentó mejor digestibilidad de gas, menor producción de AGV y menor concentración de metano empleando los volúmenes 330 y 665 µL; por lo tanto, consideramos necesario continuar investigando el empleo de los extractos estudiados como aditivos en pruebas in vivo.