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Introducción
El zinc es un elemento traza que interviene en más de 2700 enzimas, principalmente con funciones catalíticas en el 70% de los casos; también es parte estructural, actúa como sustrato o como regulador de la actividad enzimática (Andreini y Bertini, 2012); presenta características antioxidantes (Bray y Bettger, 1990; Zago y Oteiza, 2001), protegiendo al esperma, al igual que a otras células, contra el daño oxidativo y la oxidación de lípidos, inhibiendo la fosfolipasa (Eggert et al., 2002), mejorando la calidad espermática (Rolf et al., 1999).
La producción de espermatozoides pasa por muchas divisiones celulares y esto requiere grandes cantidades de zinc, ya que está involucrado en el metabolismo del ácido nucleico y de las proteínas, por lo que es esencial en la diferenciación y replicación celular (Underwood, 1981). En los túbulos seminíferos activa y mantiene el epitelio germinativo (Wong at al., 2002); ayuda a codificar los factores de transcripción involucrados en la espermatogénesis (Bedwal y Bahuguna, 1994). En la motilidad espermática controla la utilización de la energía por el sistema del ATP (El-Masry y Kamal, 1994). Además es esencial en la producción de muchas hormonas sexuales, incluyendo la testosterona, gonadotropinas y hormonas relacionadas (Hambidge et al., 1986; Wong et al., 2002).
El presente estudio se realizó con el objetivo de evaluar la respuesta al consumo adicional de diferentes niveles de zinc orgánico en la calidad seminal de ovinos de pelo.
Material y Métodos
Diseño experimental. El trabajo se realizó en las instalaciones de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa, ubicada en el municipio de Culiacán, Sinaloa. Se utilizaron 9 machos ovinos de pelo, pre púberes (entre los 3 ½ a 4 ½ meses de edad), con un peso promedio de 13 kg, los que fueron asignados a uno de 3 tratamientos en un diseño experimental completamente al azar. Los tratamientos consistieron en: 1) Testigo (T; n = 3); los borregos recibieron una dieta a base de maíz-soya-forraje (Cuadro 1) sin adición de zinc; 2) ZnMet35 (n = 3); dieta similar al testigo más la adición de 35 ppm de Zn a partir de metionina de zinc (MRZipro Corporation); y 3) ZnMet70 (n = 3); dieta similar al testigo con adición de 70 ppm de Zn a partir de metionina de zinc (ZnMet). Los animales se alojaron en tres corrales totalmente techados, cada corral alojó a 3 animales; tuvieron acceso permanente a agua de bebida. El alimento se dio en dos porciones (mañana y tarde).
Cuadro 1: Composición de dieta (BH) proporcionada a los borregos durante el experimento
| Ingredientes | Inclusión en base humedad (Kg) | |
|---|---|---|
| Base húmeda | Base seca | |
| Rastrojo de maíz | 15.0 | 15.14 |
| Maíz | 59.2 | 59.72 |
| Pasta de soya | 18.5 | 18.67 |
| Melaza de caña | 6.0 | 5.05 |
| Acid- Phos1 | 0.5 | 0.53 |
| Piedra caliza | 0.8 | 0.89 |
| Total | 100 % | 100% |
| Análisis Calculado (en base seca)2 | ||
| Proteína cruda % | 13.66 | |
| Energía neta de mantenimiento. Mcal/Kg. | 1.907 | |
| Calcio % | 0.50 | |
| Fósforo % | 0.34 | |
| Zinc mg/Kg | 19.66 | |
1Acid-Phos MR (Técnica Mineral Pecuaria, S.A. de C.V.) Premezcla preventiva para problemas de uriolitiasis. 2Calculado en base a valores publicados (NRC, 2007).
A la llegada de los animales se tomaron muestras de sangre y de excremento para determinar la presencia o no de hemoparásitos y parásitos gastrointestinales. Los animales recibieron tratamiento farmacológico, con Albendazol (0.075 gr/animal) y Doramectina (5 mg/animal) como tratamiento contra parásitos; fueron vacunados contra Clostridium y Haemophilus; se les aplicó vitamina ADE (.5 mL/animal; 250 000 UI de vitamina A, 37 000 UI de vitamina D3 y 25 UI de vitamina E), minerales y aminoácidos esenciales (5mL/animal). Tuvieron un periodo de adaptación de 15 días.
Mediciones: después del periodo de adaptación los animales recibieron la dieta alimenticia, de acuerdo al tratamiento asignado; en el día 1 (inicio) del experimento se midió la circunferencia escrotal, y posteriormente, ésta se realizó mensualmente. También se tomó una muestra sanguínea a cada borrego de los diferentes tratamientos, para medir los niveles de testosterona y los muestreos posteriores se realizaron cada mes. Las muestras de sangre, se tomaron por punción en la vena yugular.
El entrenamiento de los borregos para la eyaculación en vagina artificial se comenzó al inicio de la pubertad, alrededor de los 5 meses de edad, de acuerdo a lo recomendado por Méndez et al. (2005).
Entre los meses de marzo y abril de 2010, se tomaron muestras seminales semanalmente a cada uno de los borregos en estudio. En el semen recolectado se midieron los siguientes parámetros: volumen del eyaculado, concentración espermática, motilidad espermática, viabilidad espermática y morfología.
Recolección seminal. La técnica utilizada para la recolección seminal fue por medio de vagina artificial tipo francesa, la cual en su interior tuvo una temperatura de 40-42°C; el semen se contuvo en un tubo graduado de 10 mL (I.M.V. Technology); inmediatamente después de tener la muestra se colocó en una plantilla caliente a 37°C (MinitubeR).
Evaluación seminal
Volumen. El volumen del eyaculado se midió directamente en el tubo de recogida, de acuerdo a lo propuesto por Aisen (2004).
Motilidad en masa. Se determinó colocando una gota de semen en un portaobjeto (Pearl 25.4 x 76.2 mm) limpio y temperado a 37°C; y observándose con un aumento de 40x, de acuerdo con Mellishon y Gallegos (2006). Se realizó un estimado subjetivo de la motilidad basándose en el vigor de las ondas y su actividad; se cuantificó en una escala de 6 puntos (0 = sin movimiento a 5 = ondas vigorosas), según lo propuesto por Evans y Maxwell (1990).
Motilidad individual. Se determinó colocando una gota del diluyente y una gota pequeña de semen fresco en un portaobjeto templado a 37°C, para posteriormente homogeneizarlas; colocando un cubre-objeto y observando con un aumento de 100x. Se observaron varios campos sobre la laminilla y se determinó el porcentaje de espermatozoides que mostraron movimiento rectilíneo progresivo; los espermatozoides que giraron en círculo o avanzaron en forma oscilatoria, fueron considerados con movimientos anormales (Mellishon y Gallegos, 2006).
Concentración espermática. El conteo espermático se realizó por medio del método de fotocolorímetro, utilizando un fotómetro marca Spermacue.
Viabilidad y morfología. Para determinar el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos, así como la morfología, se utilizó la técnica de tinción eosina-nigrosina de acuerdo a lo descrito por Evans y Maxwell (1990).
Toma de muestra sanguínea. Las muestras sanguíneas se tomaron por punción yugular, utilizando tubos estériles sin anticoagulantes (Tyco healthcare group), y agujas para sistema bacutainer de roscado (Venojet, 0.8 x 40 mm). Para separar el plasma, las muestras de sangre fueron centrifugadas (centrifuga C-600, SOL-BAT S.A.), por 15 minutos a 1500 rpm; el plasma se depositó en micro tubos y se almacenaron a -20ºC hasta su análisis.
Determinación de la concentración plasmática de testosterona. Las muestras de plasma fueron enviadas al laboratorio de reproducción de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, donde se determinó la concentración plasmática de testosterona, utilizando la técnica de radio-inmuno-análisis en fase sólida, con un kit comercial (TKTT-2).
Medición de la circunferencia escrotal. La circunferencia escrotal se midió cada mes, utilizando una cinta métrica en la región de mayor circunferencia de ambos testículos (Méndez et al., 2005); cada una de las mediciones fue registrada.
Análisis estadístico. A los datos numéricos se les aplicó un análisis de varianza para un diseño completamente al azar (Steel y Torrie, 1985), utilizando el módulo de análisis de Varianza/covarianza del procedimiento para Modelos Lineales Generales de la Versión 8, del Paquete Estadístico Statistix®, se fijó un alfa máximo de 0.05 para aceptar diferencia estadística y se consideró a cada borrego como la unidad experimental. El modelo matemático utilizado fue: Yijk = Ϻ¡ +Ƭj + ɛijk; donde: Yijk = variable de respuesta, Ϻ¡ = media general de la característica estudiada, Ƭj = Efecto de los diferentes niveles de zinc y ɛijk= error experimental o aleatorio.
Resultados y Discusión
El consumo de dietas adicionadas con 70 ppm de zinc elevó (P < 0.05) el volumen del eyaculado (0.9696 vs. 0.7773 y 0.6864 mL) y la cantidad total de espermatozoides por eyaculado (1955.9 vs. 1463 y 1301.1 millones), mejoró (P<0.05) el porcentaje de espermatozoides con morfología normal (92.870 vs. 89.045 y 86.818 %) y elevó (P = 0.09) la concentración plasmática de testosterona (403.87 vs. 332.12 y 264.59 ng/dL). Respecto de los borregos que consumieron dietas adicionadas con 35 ppm de zinc orgánico y los del grupo control respectivamente; la información resumida se presenta en el Cuadro 2.
Cuadro 2: Efecto del consumo adicional de diferentes niveles de zinc orgánico, la calidad seminal, concentración sérica de testosterona y desarrollo testicular en ovinos de pelo
| Variable | Tratamientos | EEM1 | Valor de P | ||
|---|---|---|---|---|---|
| I Testigo | II 35 ppm ZnMet | III 70 ppm ZnMet | |||
| Semental, n | 3 | 3 | 3 | ||
| Muestra seminal, n | 22 | 22 | 23 | ||
| Volumen, mL | 0.6864b | 0.7773b | 0.9696a | 0.0399 | 0.05 |
| Espermatozoides totales por colección, mill. | 1301.1b | 1463.0ab | 1955.9a | 131.49 | 0.05 |
| Concentración, millones/mL | 1997.5 | 1777.5 | 1932.8 | 99.322 | 0.66 |
| Motilidad individual, % | 75.909 | 76.636 | 79.087 | 1.8699 | 0.77 |
| Motilidad masal, escala de 0-5 | 3.6591 | 3.5909 | 3.7174 | 0.1408 | 0.93 |
| Viabilidad, % | 79.00 | 81.500 | 85.609 | 2.1560 | 0.45 |
| Morfología normal, % | 86.818b | 89.045ab | 92.870a | 1.1545 | 0.05 |
| Circunferencia escrotal inicial, cm | 17.167 | 16.667 | 17.5 | 0.9497 | 0.95 |
| Circunferencia escrotal final, cm | 28.667 | 27.333 | 28.333 | 0.7536 | 0.80 |
| Concentración de testosterona sérica, ng/dL | 264.59b | 332.12ab | 403.87a | 33.681 | 0.09 |
a,bLiterales diferentes en el mismo renglón indican diferencias estadísticas significativas, 1Error Estándar de la Media.
La respuesta observada por el consumo adicional de diferentes niveles de Zinc orgánico durante un periodo de 9 meses, indican que el consumo de dietas adicionadas con 70 ppm de zinc a partir de metionina de zinc elevan el volumen del eyaculado (P<0.05) y la concentración sérica de testosterona (P<0.09); estos resultados son similares a los reportados por Kumar et al. (2006) quien al utilizar dietas adicionadas con 0, 35 y 70 ppm de zinc a partir de sulfato de zinc y 35 ppm de propionato de zinc, observó que a medida que se incrementó el nivel de adición de zinc a las dietas ofrecidas a toros cruzados, se obtuvo un mayor volumen de eyaculado y concentración sérica de testosterona en comparación con el control. También, Cupic et al. (1998), observó un incremento en el volumen del eyaculado, cuando se suplementó con sulfato de zinc en la dieta de toros. Sin embargo estos resultados no coinciden con los encontrados por Luque et al. (2009), quien al suplementar metionina de zinc durante 5 meses a ovinos previos a la evaluación seminal, bajo condiciones climáticas similares a las de este estudio; no observaron modificaciones en el eyaculado. Desde el punto de vista fisiológico el Zn es calificado como un micronutriente crítico, que posee propiedades multifuncionales en el organismo. En el sistema reproductivo del macho, existe en altas concentraciones y participa en el funcionamiento normal de testículos, próstata y epidídimo (García-Contreras et al., 2011). En los testículos, el Zn se encuentra principalmente en las células de Leydig (CL), espermatogonias tipo B, y en las espermátidas (Croxford et al., 2011). Las CL ocupan aproximadamente el 50% del compartimiento intertubular del testículo, por lo que el consumo de Zn es fundamental (Almeida et al., 2006) para el adecuado funcionamiento testicular.
El retículo endoplasmático liso (REL), es el orgánulo citoplásmico más notable de las CL, por ser el lugar de acción de una serie de enzimas que intervienen en la síntesis de testosterona; donde el Zn favorece dicha síntesis (Hesketh, 1982). También se ha reportado que el zinc estimula el crecimiento y el desarrollo de órganos sexuales primarios, secundarios y accesorios en borregos; además se ha observado atrofia de éstos cundo los borregos son alimentado con dietas deficientes en zinc (Martin et al. 1994). La principal fuente de zinc en el semen es la próstata, donde hay altas concentraciones de este micromineral, y es el principal indicador de la función prostática (Elzanaty et al. 2004; Nagamine et al. 1990).
El total de espermatozoides por eyaculado fue modificado (P˂0.05) por los tratamientos, observándose que los borregos que recibieron alimento adicionado con 70 ppm de zinc a partir de metionina de zinc, tuvieron una mayor producción espermática por eyaculado; lo que concuerda a lo observado en hombres (Wong et al., 2002), borregos (Kendall et al., 2000) y toros (Cupic et al., 1998; kumar et al., 2006); cuando recibieron dietas adicionadas con zinc. Luque et al. (2009) al proporcionar dietas adicionadas con Zn a niveles máximos de 45 ppm no observó mejoras en esta variable. La respuesta obtenida con niveles de adicción de 70 ppm, se pudo deber a la mayor cantidad de Zn disponible en el organismo, dado que la producción de espermatozoides pasa por muchas divisiones celulares; por ende requiere grandes cantidades de zinc, ya que está involucrado en el metabolismo del ácido nucleico y de las proteínas; por lo tanto es esencial en la diferenciación y replicación celular (Underwood, 1981).
También se ha observado que en los túbulos seminíferos activa y mantiene el epitelio germinativo (Wong at al., 2002); ayuda a codificar los factores de transcripción involucrados en la espermatogénesis (Bedwal y Bahuguna, 1994); además, las enzimas sorbitol deshidrogenasa y lactato deshidrogenasa son metaloenzimas dependientes del zinc, las cuales están involucradas en la espermatogénesis (Eggert et al. 2002). Todo ello puede explicar el incremento en el número de espermatozoides por eyaculado observados en el presente estudio en los borregos que consumieron dietas con niveles adicionales de 70 ppm de Zn orgánico.
El porcentaje de espermatozoide con morfología anormal se redujo (P˂ 0.05) en los borregos que recibieron la dieta adicionada con 70 ppm de zinc, a partir de metionina de Zn; estos resultados concuerdan con los reportados por Arthington et al. (2002), quien al proporcionar alimento adicionado con diferentes niveles y fuentes de zinc, por un periodo de 126 días a toros, encontraron una disminución en el porcentaje de anormalidades. Sin embargo estos resultados no coinciden con los reportados por Kumar et al. (2006) y Luque et al. (2009), quienes no observaron una respuesta favorable al consumo adicional de zinc en la reducción de anormalidades espermáticas en toros, cabras y borregos, respectivamente.
Las anormalidades espermáticas se deben a fallas en la espermatogénesis (Barth y Oko, 1989; Barrio, 2002), relacionadas con los cambios cualitativos y cuantitativos del material nuclear y de los órganos de origen citoplasmático, así como por perturbaciones bioquímicas del plasma seminal; debido a procesos inflamatorios del testículo y de las glándulas sexuales accesorias; así como también al aumento o disminución de la temperatura en el testículo y por manipulaciones del semen durante su procesamiento (De Serrano et al., 1989).
Como ya se mencionó, los espermatozoides pasan por diversas divisiones celulares (Underwood, 1981), por lo que asegurar niveles adecuados de Zn en el organismo animal puede disminuir las anormalidades espermáticas. Underwood y Somers (1969) reportaron que la suplementación con zinc a borregos aumenta la producción diaria de espermas y reduce la proporción de anormalidades espermáticas, lo que coincide a lo observado en el presente trabajo.
En los borregos que recibieron alimento adicionado con 70 ppm de zinc, se observó una tendencia (p = 0.09) a incrementar los niveles plasmáticos de testosterona en comparación con los tratamientos ZnMet35 y el control (403.87 vs. 332.12 y 264.59 ng/dL). Estos resultados son similares a los reportados en toros (Kumar et al., 2006; Xin et al., 2007), en humanos (Hartoma et al., 1977) y en conejos (El-Masry et al., 1994). Sin embargo, son diferentes a los observados por Luque et al. (2009) al adicionar niveles máximos de 45 ppm de Zn orgánico. El aumento de los niveles plasmáticos de testosterona, se puede atribuir a la función del zinc en la esteroidogénesis testicular, ya que activa el sistema adenilciclasa, que estimula la síntesis de testosterona (El-Masry et al., 1994); además es un componente de las proteínas involucradas en las síntesis y secreción de testosterona (Kumar et al., 2006).
La concentración espermática, motilidad masal, motilidad individual y circunferencia escrotal no fueron modificadas (P ˃ 0.45) por los tratamientos. Estos resultados son similares a los observados por Luque et al. (2009) y Arthington et al. (2002).
Los resultados obtenidos indican que la calidad seminal en borregos de pelo está relacionada con los niveles de Zn contenidos en la dieta, por lo que es necesario seguir investigando los niveles de adición óptimos, en los que se obtenga la mejor respuesta en la calidad seminal de los borregos, dado que la cantidad de estudios es limitada en esta especie animal y en especial en animales criados bajo condiciones de trópico seco.
Conclusión
El consumo de dietas adicionadas con 70 ppm de zinc orgánico a partir de metionina de zinc eleva el volumen y la producción de espermatozoides por eyaculado, disminuye la proporción de espermatozoides con anormalidades morfológicas y eleva la concentración plasmática de testosterona en ovinos de pelo criados en condiciones subtropicales.
