Generalidades de las nanopartículas de óxido de zinc

El óxido de zinc existe como mineral zincita en la corteza terrestre, pero la mayor parte de esta es producida por métodos sintéticos que son usados comercialmente (^{Mirzaei y Darroudi, 2017}). El zinc a nanoescala es usado principalmente en la industria del caucho, pigmentos y como conductor de calor (^{Vayssieres et al., 2001}). Las NPsZnO son utilizadas en varios productos como catalizadores, sensores de gas, protectores solares, productos cosméticos, pinturas y semiconductores. Además, debido a que el ZnO absorbe muy bien la luz UV, las nanopartículas de ZnO se utilizan frecuentemente en productos de consumo humano como champús anticaspa, tratamientos de telas para protección de luz UV, polvos para bebés y protectores solares en crema (^{Ma, Williams y Diamond, 2013}).

La Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (USFDA, por sus siglas en inglés) y la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, por sus siglas en inglés) consideran que las NPsZnO son una sustancia segura. Sin embargo, muchos estudios demuestran que estas nanopartículas tienen efectos adversos en diferentes tipos de células (^{Osman et al., 2010}; ^{Brunner et al., 2006}; ^{Jeng y Swanson, 2006}) y el mecanismo de toxicidad frecuentemente observado es un incremento en la generación de ROS (especies reactivas al oxígeno, por sus siglas en inglés), (^{Osman et al., 2010}; ^{Sharma et al., 2009}), y una alteración en el sistema antioxidante (Tablas 1 y 2).

Generalidades de las nanopartículas de óxido de cobre

Las nanopartículas de óxido de cobre (NPsCuO) son abundantes en la naturaleza y han ganado una atención particular entre las nanopartículas metálicas debido a sus propiedades físicas útiles como la superconductividad a alta temperatura y los efectos de correlación electrónica (^{El-Trass et al., 2012}). Además, las NPsCuO son comúnmente utilizadas en materiales como lubricantes, plásticos, tintas, cosméticos y revestimientos metalúrgicos (^{Battez et al., 2010}), y se usan ampliamente en aplicaciones biomédicas como soportes de catalizador o acarreadores de fármacos (^{Khan et al., 2017}). El cobre existe en dos estados de oxidación Cu1+ y Cu2+, esto permite que funcione en reacciones bioquímicas como agente reductor u oxidante. Sin embargo, esta propiedad también hace que el cobre sea potencialmente tóxico, porque sus iones pueden inducir estrés oxidativo (^{Valko, Morris y Cronin, 2005}), producción de radicales libres (^{Ivask et al., 2010}) y genotoxicidad (^{Ahamed et al., 2010}) así como alteración de los niveles de enzimas antioxidantes (Tabla 3).

Estrés oxidativo como mecanismo de toxicidad

Los efectos negativos que se reportan normalmente para indicar si una NP en determinadas condiciones es tóxica o no, son la citotoxicidad y la genotoxicidad. Esta última es la capacidad que tiene una sustancia de provocar daño al material genético, mientras que la citotoxicidad es la propiedad de una sustancia para causar una alteración de las funciones celulares que conducirán a la muerte celular. Se han propuesto varios mecanismos que explican los efectos adversos para la salud de las nanopartículas de óxidos metálicos (NPs-OM). Los efectos que han recibido la mayor atención son la sobreproducción de ROS (conjunto de radicales libres de especies de oxígeno altamente reactivas) y la generación de estrés oxidativo.

Los ROS biológicamente relevantes incluyen el anión superóxido (•O₂- ), radical hidroxilo (•OH), oxígeno singlete (¹O₂) y peróxido de hidrógeno (H₂O₂). Estos se generan de forma intrínseca o extrínseca dentro de la célula, son bioproductos naturales del metabolismo oxidativo celular, producidos a través de la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias (respiración celular).

Las ROS desempeñan papeles fisiológicos importantes en la modulación de la supervivencia, muerte, diferenciación y señalización celular, así como en la producción de factores que regulan la inflamación (^{Sharifi et al., 2012}). No obstante, la producción anormal y excesiva de ROS puede ser nociva para los organismos. Se le denomina estrés oxidativo a las condiciones en las cuales existe un desbalance entre la producción de ROS y la capacidad de las células para reducirlas (Figura 1); esto afecta negativamente el mantenimiento y regulación de funciones fisiológicas importantes. Algunos de estos daños en la función celular incluyen la oxidación de proteínas, daños en el ADN (genotoxicidad), peroxidación lipídica e inflamación (^{Lee et al., 2012}). Además, el estrés oxidativo está relacionado con enfermedades degenerativas como esclerosis lateral amiotrófica, artritis, enfermedad cardiovascular, inflamación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, diabetes y cáncer (^{Tan et al., 2018}). Es importante resaltar que los daños en las células y en la salud mencionados anteriormente no dependen solo de la capacidad oxidativa de los ROS, sino que es realmente debido al desbalance intracelular entre los niveles de ROS y la capacidad antioxidante de las células, así que la toxicidad no solo está relacionada con la producción de ROS sino que debe percibirse como desequilibrio redox.

Nota: Se muestran las reacciones principales del sistema celular de defensa antioxidante, para reducir y eliminar los radicales libres y las especies de oxígeno altamente reactivas (ROS).

Fuente: Figura diseñada con el programa Microsoft Powerpoint por Geraldo León, J. A.

Figura 1 Principales componentes del sistema antioxidante celular. 

Sistema antioxidante celular

Todos los efectos adversos relacionados con las ROS se deben a que estas son moléculas reactivas deficientes de electrones y capaces de oxidar a casi todos los tipos de biomoléculas. Pueden oxidar componentes estructurales y otros componentes vitales. Para minimizar los riesgos que conlleva el estrés oxidativo, los organismos han desarrollado una gran variedad de sistemas antioxidantes complejos comprendidos por mecanismos de defensa enzimáticos y no enzimáticos que se coordinan cooperativamente (Figura 1).

Entre estos sistemas destacan las enzimas superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX) y catalasa (CAT); además de otros mecanismos no enzimáticos como el ácido ascórbico (vitamina C), glutatión (GSH), (-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos. Estas moléculas antioxidantes conceden al organismo una capacidad protectora para contrarrestar los daños oxidativos, permiten que las células funcionen normalmente y previenen su destrucción prematura por mal funcionamiento y citotoxicidad. Los antioxidantes son esencialmente agentes reductores; participan en reacciones de óxido-reducción (redox) al donar electrones o átomos de hidrógeno. De esta manera, el sistema de defensa antioxidante permite que haya un equilibrio entre la producción y eliminación de las ROS.

Susceptibilidad diferencial de las células a las nanopartículas de óxidos metálicos

Las nanopartículas (NPs) pueden afectar el mecanismo de defensa antioxidante (Tablas 1 y 2) induciendo así la permanencia de las ROS, el inicio de una respuesta inflamatoria y la perturbación y destrucción de las mitocondrias lo que, finalmente, desencadena una muerte celular por apoptosis o necrosis (^{Ramírez y Rojas, 2010}).

Hay evidencia donde se muestra que las NPs-OM aumentan la producción de ROS y pueden ocasionar la muerte de diferentes tipos de células cultivadas in vitro (^{Pulskamp et al., 2007}) (^{Park et al., 2007}). Otros estudios confirman la sobreproducción de ROS, después de la exposición de NPs-OM incluyendo las fabricadas a base de ZnO y CuO en diferentes tipos de células (^{Zhang et al., 2017}). Por lo tanto, la apoptosis iniciada por las NPs-OM puede ser el resultado del aumento de la producción de ROS, alteración de la actividad de enzimas antioxidantes y el decremento de la presencia de GSH. Esta serie de factores desencadenarían una disfunción mitocondrial, daño en el ADN (genotoxicidad) y/o aumento de la expresión de los receptores de muerte celular para, finalmente, ocasionar una muerte celular programada (Figura 2).

Fuente: Figura elaborada en www.BioRender.com por J. A. Geraldo León y K. Juárez-Moreno.

Figura 2 Efectos citotóxicos inducidos por las especies de oxígeno altamente reactivas (ROS) producidas por la exposición de las células a nanopartículas de óxidos metálicos. 

La alteración en el contenido del nivel total de GSH, así como en la actividad de enzimas antioxidantes en las células, puede considerarse como una indicación de la respuesta adaptativa celular al daño oxidativo. Por ejemplo, en el trabajo reportado por Fahmy y colaboradores, se expusieron por 72 horas a cultivos de células de pulmón WI-38 y de cáncer de pulmón A549, a diferentes concentraciones de NPs de Cu y CuO. Los resultados del trabajo indicaron que los niveles de GSH incrementaron en las células de cáncer, pero disminuyeron en las células normales de pulmón. Además, la actividad de la enzima SOD disminuyó en las células normales, pero incrementó en las células de cáncer de pulmón (^{Fahmy, Ebrahim y Gaber, 2020}). Las diferencias en la actividad de GSH y SOD entre las células normales y las de cáncer indican que el estado metabólico de la célula tiene un efecto importante en la respuesta antioxidante ante la exposición a nanopartículas de óxidos metálicos.

Por ello, se propone que la susceptibilidad diferencial de las células al daño por la exposición a las NPs, se debe a las distintas actividades metabólicas de cada tipo celular (^{Chibber, Ansari y Satar, 2013}). Por ejemplo, en un estudio realizado en el año 2011 por Pujalté y colaboradores, se expusieron dos líneas celulares diferentes de tejido de riñón humano: mesangial glomerular (IP15) y epitelio proximal (HK-2) a distintos tipos de nanopartículas incluyendo las sintetizadas a base de ZnO; se observó que existe una sensibilidad distinta para cada tipo de nanopartícula, demostrando así que el tipo de célula influye en la respuesta citotóxica (^{Pujalté et al., 2011}).

Otro trabajo evaluó el efecto de la exposición subaguda de nanopartículas de TiO₂, ZnO y Al₂O₃ en hígado y cerebro de ratón. Los resultados del estudio revelaron que todas las NPs inducen una disminución significativa de la actividad de las enzimas SOD, GPx y CAT. Sin embargo, la mayor disminución fue provocada por las NPsZnO, sugiriendo que son más tóxicas que las NPs de TiO₂ y Al₂O₃. La actividad de la enzima GST permaneció inalterada en todos los grupos, excepto aquellos que fueron expuestos a NPsZnO, los cuales tuvieron una disminución significativa en esta actividad enzimática (^{Shrivastava et al., 2014}). Estos datos sugieren que la respuesta antioxidante de las células difiere de acuerdo con las propiedades de las nanopartículas a las que se exponen.

Estos trabajos indican que la respuesta del sistema antioxidante de las células que han sido expuestas a NPs depende de dos variables: 1) del estado metabólico celular, y, 2) de las propiedades fisicoquímicas de las NPs. Ambas variables son importantes de considerar, pues cada resultado sobre la toxicidad de una NP en una determinada línea celular no puede extrapolarse de forma directa a otra línea celular diferente.

Alteración del sistema antioxidante por NPs de ZnO

La exposición a NPsZnO además de inducir estrés oxidativo también puede ser capaz de aumentar la actividad de enzimas antioxidantes. Se ha reportado un incremento de la actividad de GSH, GR, GPx y CAT y de su expresión de mRNA incluyendo SOD en adipocitos (^{Muthuraman, Ramkumar, y Kim, 2014}). En células epidérmicas de piel humana se ha detectado el aumento en la actividad de las enzimas SOD y GPx (^{Lee et al., 2012}) y en fibroblastos el incremento en la actividad de las enzimas GR, GPx y SOD (^{Syama et al., 2013}). En la Tabla 1 se muestra el incremento en la actividad de algunas enzimas antioxidantes en diferentes líneas celulares. Estos resultados nos indican que, al incrementar la cantidad de ROS, la célula debe aumentar también la actividad de la defensa antioxidante para contrarrestar el daño oxidativo. En estos estudios la capacidad del sistema antioxidante no fue suficiente para revertir el estrés oxidativo y sus efectos, alcanzando solo a aminorarlos.

Por otro lado, se ha reportado también que la exposición a NPs de ZnO puede disminuir la actividad de algunas enzimas antioxidantes. En células de cáncer se presentó una disminución en la actividad de GSH, CAT, SOD, GPx y GR (^{Akhtar et al., 2012}). Algunas de estas, concretamente GSH, CAT y SOD, presentaron también una disminución en su actividad catalítica, pero en células epidérmicas (^{Sharma et al., 2009}). En hepatocitos se ha encontrado también disminución en la actividad de las enzimas SOD, CAT, GPx y GST (^{Shrivastava et al., 2014}). En la Tabla 2 se muestran los antioxidantes que disminuyen su actividad en las diferentes células posterior a su exposición a NPsZnO.

Estos sistemas enzimáticos y no enzimáticos forman parte del sistema antioxidante que combate el daño oxidativo, así que una disminución en su actividad puede provocar un desequilibrio redox importante, capaz de desencadenar daños oxidativos en las estructuras celulares y una citotoxicidad intrínseca. En los ejemplos de la Tabla 2, se demuestra que la respuesta del sistema antioxidante es inhibida después de una exposición a NPsZnO; lo cual induce un incremento en la producción de ROS. De tal forma que las NPsZnO no solo son capaces de inducir una sobreproducción de ROS, sino también de bloquear las defensas antioxidantes y de esta manera inducir efectos celulares adversos.

Los antioxidantes que se evaluaron tanto en los estudios de la Tabla 1 como en los de la Tabla 2, presentaron aumento y disminución en su actividad. Es necesario evaluar con más detalle las condiciones en la que determinadas enzimas del sistema antioxidante de la célula disminuyen su actividad, para así poder correlacionar alguna variable que repercuta exclusivamente a la inhibición catalítica y, así, este se estudie como posible factor de toxicidad al bloquear la defensa antioxidante y promover la inducción de estrés oxidativo. En la Figura 3, se muestra la morfología de células hepáticas AML-12 expuestas a diferentes concentraciones de NPsZnO durante 24 h. Para este experimento se cultivaron 5,000 hepatocitos AML-12 con medio de cultivo HAM-F12 durante 24 h a 37 ºC y 5% de CO₂. Después se le adicionaron 12, 20 y 30 μg/mL de NP-sZnO (número de catálogo 721077- 100G) ultrasonicadas, y se incubó durante 24 horas. Las células sin NPsZnO se utilizaron como control para representar el 100% de viabilidad. El cambio en la morfología celular corresponde a un decremento en la viabilidad de las células.

Fuente: Fotografías de J. A. Geraldo León, utilizando el software Lumaview720.

Figura 3 Cambios morfológicos de células hepáticas AML-12 expuestas por 24 horas a diferentes concentraciones de nanopartículas de óxido de zinc. 

Se observa que la exposición de las células a las diferentes concentraciones de NPsZnO, durante 24 horas, induce una disminución en el número celular, así como cambios morfológicos evidentes al compararlas con el cultivo control (sin ZnO NPs). Por ejemplo, una disminución del tamaño celular, células más redondas y oscuras. Estos cambios morfológicos están asociados con una disminución en la viabilidad celular.

Alteración del sistema antioxidante por la exposición a nanopartículas de óxido de cobre

En comparación con otras nanopartículas de óxidos metálicos, las NPsCuO han demostrado ser unas de las que presentan mayor toxicidad. En ese sentido, existen evidencias donde se demuestra que la toxicidad de las NPsCuO es mucho mayor que las NPs de otros óxidos metálicos (^{Karlsson et al., 2008}) (^{Gunawan et al., 2011}). Por ejemplo, en el 2012, T. Sun y colaboradores expusieron las líneas celulares de pulmón (A549), cáncer de pulmón (H1650) y carcinoma nasofaríngeo (CNE-2Z) a NPs de óxidos metálicos y encontraron que las NPsCuO eran las más tóxicas; mientras que otras NPs-OM tenían poco efecto sobre la viabilidad celular (^{Sun et al., 2012}). En otro estudio se reportó que las NPsCuO indujeron una mayor citotoxicidad de una manera dependiente de la concentración, a diferencia de las NPs de SiO₂ y de Fe₂O₃ que a concentraciones altas no eran tóxicas para las células epiteliales de las vías respiratorias (HEp-2) (^{Fahmy y Cormier, 2009}).

También se ha demostrado que las NPsCuO alteran la actividad del sistema antioxidante celular. Se ha reportado un aumento en la actividad de GPx en células epiteliales de las vías respiratorias (HEp-2) (^{Fahmy y Cormier, 2009}) e hígado de ratas (^{Canli, Ila y Canli, 2019}). En este último trabajo también se encontró un aumento en la actividad de CAT, pero una disminución de la actividad de GST. En las células HEp-2 también se presentó una disminución de la actividad de las enzimas CAT y GR. Por lo tanto, la actividad de las enzimas antioxidantes, aumenta de manera dependiente a la generación de ROS, lo cual indica que las células de las diferentes líneas celulares evaluadas intentaron neutralizar el efecto de las ROS inducidas por la exposición a NPsCuO con la finalidad de disminuir el daño oxidativo celular.

En todos estos casos se ha observado que cada enzima del sistema antioxidante responde de forma distinta a las condiciones del desequilibrio redox, lo cual sugiere que presentan un mecanismo de regulación particular. Por ejemplo, una enzima como la SOD y un antioxidante no enzimático como GSH han demostrado ser capaces de variar su actividad según el estado metabólico de la célula. En células normales de pulmón (WI-38) la actividad de estos antioxidantes disminuye, mientras en células de cáncer de pulmón (A549) tienden a aumentar su actividad como se resumen en la Tabla 3.

Por otro lado, se ha reportado que la exposición a NPsCuO produce, en células epidérmicas de la piel humana (HaCaT), la disminución en la actividad de GSH (^{Alarifi et al., 2013}). En hígado de ratas también se encontró este mismo efecto, pero acompañado del aumento en la actividad de CAT y SOD. Esta última enzima junto con GSH disminuyó en células normales de pulmón. El comportamiento de la actividad de los antioxidantes celulares de la Tabla 4, promueve aún más el estrés oxidativo e indica que la exposición a NPsCuO puede provocar la inhibición en la actividad catalítica de enzimas antioxidantes, que a su vez afecta negativamente la defensa contra el daño oxidativo.

Conclusiones

La actividad del sistema antioxidante es un parámetro que repercute directamente en el mantenimiento del equilibrio redox. Las NPs de ZnO y CuO son capaces de alterar las moléculas antioxidantes con una gran variabilidad, ya que depende tanto de las propiedades fisicoquímicas de la NP como de la línea celular y su estado metabólico. Mediante la revisión bibliográfica, se recopilaron datos sobre la capacidad de las NPs de ZnO y CuO para afectar la respuesta celular a los ROS, reflejado en la disminución de la actividad y la inhibición catalítica de la defensa antioxidante de diferentes líneas celulares, lo que puede indicar un mecanismo por el cual las NPs inducen el desbalance redox y de esta manera causar daños a las estructuras y funciones celulares. Uno de los hallazgos de nuestro grupo de investigación demostró que los efectos adversos observados en los cambios en la morfología de los hepatocitos expuestos a NP-sZnO pueden tener relación con la afectación del sistema antioxidante, aunque se necesitarían más estudios para corroborar esto. Estos datos muestran cómo, en conjunto con la producción de ROS, la actividad antioxidante es un parámetro muy importante a considerar en los estudios nanotoxicológicos, al brindar estos una percepción más amplia y clara a nivel molecular de los mecanismos por los cuales las NPs inducen el daño oxidativo.