Optimizacion de las quinolonas comerciales y el nanoacarreador

Se realizó el modelado y la optimización del nanoacarreador de TiO₂ , así como de una familia de fármacos comerciales de diversas generaciones (segunda a cuarta generación), tales como el ácido oxolínico (Oxo), ciprofloxacina (Cipro), ofloxacina (Oflo), enoxacina (Eno), norfloxacina (Nor), lomefloxacina (Lom), levofloxacina (Lev), esparfloxacina (Esp), clinafloxacina (Clin), gatifloxacina (Gat), trovafloxacina (Tro) y moxifloxacina (Mox) (Figura 2). Cabe destacar que estos fármacos fueron seleccionados por ser utilizados en el área clínica. El modelado fue realizado por medio del software Avogadro, posteriormente se realizó la optimización y el cálculo de descriptores electrónicos empleando la teoría del funcional de la densidad (DFT) mediante el uso del paquete computacional Gaussian 09, y, específicamente, aplicando un nivel M06L/6-311+G(d,p).

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 2 Moléculas de quinolonas comerciales. 

Diseño y optimizacion de quinolonas prospecto

Se diseñaron moléculas de núcleo quinolónico con adición y evaluación de diferentes grupos funcionales. Se realizaron cuatro categorías, a la primera se le adicionaron ciclos insaturados de tres, cuatro y seis carbonos; a este último se le adicionaron átomos de flúor para mejorar la distribución de la nube electrónica. La segunda y tercera categoría consistió en la adición de triazoles y tetrazoles, respectivamente, variando la posición de los átomos de nitrógeno y las saturaciones presentadas. Finalmente, a la cuarta categoría se le adicionaron isatinas con distintos puntos de anclaje a la quinolona (Figura 3). Las quinolonas prospecto fueron modeladas y optimizadas con la metodología descrita anteriormente.

Nota: El diseño de quinolonas se clasificó en cuatro grupos, del grupo naranja se evaluaron distintos ciclos insaturados. Al grupo azul se le adicionaron triazoles con distintas saturaciones y nitrógenos en múltiples posiciones; al grupo verde se le adicionaron tetrazoles, con distintas saturaciones y con distinto acomodo de los nitrógenos. Por último, al grupo morado se le adicionaron isatinas como sustituyentes con distintos puntos de anclaje al núcleo de quinolona, el primero con unión en el nitrógeno y el segundo con unión al oxígeno próximo al nitrógeno.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 3 Moléculas de quinolonas propuestas. 

Cálculo de descriptores electrónicos

A partir de la DFT conceptual, se calcularon los siguientes descriptores de reactividad global: potencial de ionización (I), afinidad electrónica (A), electronegatividad ( χ ), dureza (η ), blandura (S), y, electrofilicidad (ω), los cuales fueron calculados mediante las ecuaciones mostradas en [1] (^{Robles et al., 2000}).

Estudio QSAR

Para las estructuras de quinolonas comerciales se realizó un estudio QSAR empleando el software Dragon (^{Thiemann y Vill, 1997}), a partir del cual se obtuvieron más de 1,200 descriptores geométricos, topológicos y moleculares. Posteriormente, se planteó un modelo matemático con el uso de los descriptores geométricos y electrónicos, para poder predecir el valor experimental MIC (^{Andersson y MacGowan, 2003}; ^{Hoogkamp-Korstanje, 1997}; ^{Prosser y Beskid, 1995}; ^{Pham, Ziora y Blaskovich, 2019}; ^{Yoshimura, Ishimaru y Kojima, 2002}). Para facilitar el manejo de datos se utilizó el pMIC definido en [2].

El modelo matemático predictivo o QSAR se obtuvo a partir del software MobyDigs (^{Todeschini et al., 2004}).

Acoplamientos moleculares in silico

Se obtuvo la estructura cristalizada de la ADN girasa-topoisomerasa IV (ADNg-TIV) como blanco biológico del Protein Data Bank (código PDB: 5CDP) (Figura 4), lo anterior por ser un blanco biológico específico para derivados quinolónicos, sin considerar posibles mutaciones derivadas de la resistencia a antibióticos. Se evaluó la interacción entre las quinolonas y el composito de quinolona-TiO₂ en las cavidades del blanco biológico, por medio del algoritmo de búsqueda MolDock SE y una función de evaluación MolDock Score (GRID) (^{Thomsen y Christensen, 2006}). Con lo anterior se lograron conocer las poses energéticamente más estables y la energía de interacción blanco-ligando. El análisis se realizó con el uso del software Molegro Virtual Docker (^{Thomsen et al., 2006}).

Nota: Las cavidades (verde) identifican regiones con probabilidad de interacciones.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 4 ADNg-TIV como blanco biológico de quinolonas en un modelo de S. aureus. 

Modelo QSAR

Los descriptores obtenidos fueron del tipo topológicos, geométricos, de cargas, grupos funcionales, atómicos y de propiedades moleculares, los cuales se evaluaron en los distintos modelos matemáticos desarrollados mediante algoritmos evolutivos. En la selección del modelo matemático óptimo, se evaluaron distintos elementos; el primero de ellos es que tuviera un coeficiente de correlación (R2) cercano a uno, además de un análisis de componentes principales (PC), el cual está condicionado a que los descriptores seleccionados dentro del modelo matemático no tengan alguna correlación lineal entre ellos, pero sí con el pMIC como valores responsivos de la generación del modelo matemático. Previamente se validó el modelo con un conjunto de prueba aleatorio. Los valores obtenidos en el modelo seleccionado presentaron un valor de R² = 0.97, y en el análisis PC resultó SCBO ≠ ARR ≠ G_(N..O), por lo que estos descriptores no tienen alguna correlación entre ellos, pero sí con PMIC (Gráfica 1). El modelo matemático obtenido se muestra en [3].

Fuente: Elaboración de los autores.

Gráfica 1 Comparación de pMIC experimental contra pMIC in silico. 

Donde SCBO es el orden de suma en enlaces convencionales para el modelo matemático en estudio (MME); ARR indica el radio aromático; MAATS3v es la autocorrelación de Moran en volúmenes de Van Der Waals, y G_(N..O) es la suma de distancias geométricas entre los átomos de nitrógeno y oxígeno.

Para el diseño de nuevas quinolonas se consideraron los sustituyentes con mayor impacto en la eficiencia del fármaco, reportados en la bibliografía y en estudios previos de nuestro grupo de investigación. Se conservó el grupo metoxilo en el sexto carbono, la piperazina en el séptimo carbono y, finalmente, el flúor en el octavo carbono, considerando esta base como nuestro andamio para nuevas propuestas. Al evaluar estas estructuras nuevas con el MME y los descriptores, podremos conocer el valor teórico de pMIC y por tanto de MIC (Tabla 1), teniendo así una referencia de la posible inhibición de S. aureus por estas estructuras.

A través de las estructuras iniciales, se logró conocer el efecto del sustituyente 2,4-difluorofenilo, en comparación con el resto de las estructuras con anillos insaturados; obteniendo un pMIC = 1.74, el cual, en comparación con el pMIC = 1.22 de Mox, Clin y Tro (quinolonas comerciales de mayor eficiencia), es mayor, lo cual indica un mejor efecto en la propuesta. En cuanto a las moléculas 16 y 17 con un grupo isatina, se presenta un pMIC de 0.593 y 0.982, respectivamente, ubicándose en el promedio de las quinolonas comerciales.

En cuanto al resto de las moléculas con sustituyentes triazoles y tetrazoles supera hasta en mil unidades los pMIC experimentales, en especial las moléculas 11 y 12 en el grupo de tetrazoles y la molécula 7 en la clasificación de triazoles 4.407, 4.086 y 4.389, respectivamente. Una característica de estas últimas estructuras es la presencia de nitrógenos en las posiciones 1, 2, 6 del azol unido al nitrógeno en la primera posición de la base quinolónica. Dado lo cual, en esta región concentrada de nitrógenos, en conjunto con el flúor próximo, generan una densidad electrónica localizada, mayor electronegatividad, y por lo tanto presentan un comportamiento de nucleófilo.

Una diferencia entre la estructura 7 con la 11 y 12, es que la primera solo tiene tres nitrógenos pertenecientes al anillo, mientras que las otras estructuras presentan cuatro dentro del anillo, esto sin considerar el nitrógeno al que se encuentran unidos. Al parecer, el contener solo tres nitrógenos es mejor que contener cuatro en el anillo sustituyente, para obtener valores mayores en pMIC (Gráfica 2). En las estructuras 9, 10, 14 y 15, se evaluaron los dobles enlaces en los azoles, indicando un aporte positivo al presentar dos insaturaciones en lugar de solo una.

Nota: El valor expresado en MIC nos indica la cantidad necesaria para inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana, lo deseable dentro del área farmacéutica e investigación es que sea una mínima cantidad para que tenga efecto, en otras palabras, mientras más pequeño sea el valor MIC se estipula una mejor quinolona.

Fuente: Elaboración de los autores.

Gráfica 2 MIC in silico de quinolonas propuestas. 

Los valores MIC obtenidos in silico para las quinolonas propuestas con triazoles, tetrazoles en diferentes saturaciones e isatinas con diferentes puntos de anclaje, se encuentran hasta mil unidades por debajo de los MIC comerciales (sugiriéndose una eficiencia 1,000 veces mejor). Por lo tanto, de acuerdo con el estudio QSAR, las moléculas incluidas en este estudio se pueden considerar como prometedoras; sin embargo, esto no es evidencia suficiente. Es por ello que se realizó un ensayo de acoplamiento molecular, con el objetivo de conocer las interacciones que cada estructura exhibe en contacto con su blanco biológico.

Quinolonas comerciales y diseñadas

Se realizaron acoplamientos moleculares de las quinolonas comerciales y diseñadas, resultando un acoplamiento en el surco mayor de la cadena de ADNg por la alta afinidad presentada. Cabe destacar que entre más negativo sea el valor de energía de acoplamiento ligando-receptor, el sistema se torna más estable. Esto ocurrió en todos los casos, comprobando el mecanismo de inhibición presentada en la literatura. Las estructuras con mejores resultados de MIC fueron: Tro con una energía de acoplamiento de -152.90 kcal/mol, Clin con -147.52 kcal/mol, Mox con -146.89Kcal/mol, y, Esp con -137.35Kcal/ mol en el caso de las comerciales.

Las interacciones presentes son de tipo puente de hidrógeno (PH) en las cuatro estructuras con los anillos y grupos fosfato del ADNg. No obstante, Tro y Mox también presentaron interacciones estéricas (IE) con la proteína topoisomerasa IV (pTIV) en los aminoácidos serina-glutamina y serina-glicina, respectivamente (Tabla 2). Otra interacción observada en las quinolonas es la interacción tipo apilamiento (overlaping o staking), esta última simula un emparedado donde el fármaco se encuentra atrapado por los anillos de las bases nitrogenadas de la cadena.

En cuanto a las quinolonas diseñadas, el acoplamiento también ocurrió en el surco mayor del ADNg, obteniendo energías de acoplamiento comparables y en algunos casos más bajas que las de las quinolonas ya analizadas. Las quinolonas diseñadas, 9 y 3, presentaron energías de acoplamiento de -142.47 kcal/ mol y -142.47 kcal/mol, respectivamente, comparables a las mejores quinolonas comerciales Clin (-147.52 cal/mol) y Mox (-146.89 kcal/mol. Sin embargo, las estructuras 16 y 17 alcanzaron energías de acoplamiento menores, de -152.32 y -164.54, respectivamente (Tabla 2); en estas últimas estructuras también se encontró una mayor cantidad de interacciones del tipo PH e IE con los aminoácidos serina, asparagina y glutamina (Figura 5).

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 5 Acoplamientos moleculares de quinolonas comerciales (fondo blanco). Se muestra el acomodo que obtuvieron las quinolonas comerciales en el surco mayor del ADNg. Las quinolonas diseñadas se acoplaron de manera similar a las comerciales. Átomos interactuantes de quinolonas (fondo negro). Se muestran los átomos que se encuentran en interacción con el blanco biológico de las quinolonas comerciales y diseñadas, así como los distintos tipos de interacción: puentes de hidrógeno (línea punteada azul) en interacción con ADNg, interacciones estéricas (línea punteada roja) con pTIV y, finalmente, las interacciones tipo apilamiento (círculos verdes) con los anillos de las bases nitrogenadas de las cadenas. 

Por otra parte, las estructuras 7 y 11 resultaron tener el MIC más alto en el modelo QSAR, obteniendo una energía de acoplamiento de -129.16Kcal/ mol y -135.84Kcal/mol, en ese orden y aunque en este análisis no exhibieron los mejores resultados, presentan interacciones con el ADNg con PH y apilamiento, mientras que la IE en el pTIV solo ocurrió con la estructura 7.

La correlación entre los resultados obtenidos del QSAR y los acoplamientos moleculares in silico se pueden explicar en términos farmacofóricos, considerando la estructura electrónica generada en los sistemas con mejor MIC.