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Introducción
Los avances sobre el comportamiento de la materia a escala nanométrica han abierto una perspectiva prometedora de nuevos conocimientos y aplicaciones, pues las propiedades físicas de los nanomateriales son muy diferentes de las observadas en un sólido de tamaño macroscópico con la misma composición química.
Actualmente, se empiezan a utilizar de forma habitual técnicas experimentales que permiten sintetizar, caracterizar y manipular materiales nanométricos para su uso en diversos campos como la genómica, diagnóstico médico, farmacogenética, patología, criminología, seguridad alimentaria, seguimiento ambiental, entre otros (Chávez-Sandoval et al., 2020; Fujimori et al., 2012).
En cuanto a las propiedades de las nanopartículas (NPs), las ópticas, en particular, dependen fundamentalmente del tamaño, forma y distribución espacial de estas en la muestra, pudiendo ser: de esfera, de barra, de cubo, de triángulo, entre otras, siendo estas características de gran relevancia para sus aplicaciones (Chávez-Sandoval et al., 2015; Abrica-González et al., 2018).
Las NP de metales nobles están siendo ampliamente utilizadas en el campo médico debido a su baja toxicidad y biocompatibilidad; sin embargo, la toxicidad de las NP aún no está bien demostrada, por lo cual la síntesis biológica de nanopartículas de oro (AuNPs) es un procedimiento alternativo a la síntesis química: es simple, económico y menos dañino para el medio ambiente. Además, el uso de extractos de plantas para la síntesis de nanomateriales representa una buena alternativa, al obtenerse NP estables de diferente forma y tamaño (Rico-Moctezuma et al., 2010; Panda y Deepa, 2011; Chávez-Sandoval et al., 2016).
En este trabajo, se realizó la síntesis y caracterización de nanopartículas de oro (AuNPs) utilizando extractos de plantas como agente reductor, las plantas utilizadas fueron: clavo (Syzygium aromaticum), manzanilla (Matricaria chamomilla), cuachalalate (Amphipterygium adstringens), pulmonaria (Lobaria pulmonaria), noni (Morinda citrifolia), y hojas de olivo (Olea europaea), debido a su uso tradicional en el tratamiento del resfriado común, fiebre, infecciones por virus, influenza y neumonía, por mencionar algunos (Liu et al., 2017). Por lo anterior, las NP obtenidas podrían servir para garantizar la salud pública si se utilizan como desinfectantes en insumos médicos, considerando la pandemia a causa del coronavirus SARS-CoV-2 que el mundo está sufriendo, y a que seguramente seguiremos enfrentando otras epidemias y/o pandemias.
Se realizó también una síntesis de AuNPs utilizando ácido málico por ser uno de los ácidos más abundantes en la naturaleza, se encuentra en frutas y verduras, se metaboliza con facilidad y es primordial para el ciclo de Krebs, ya que el metabolismo mitocondrial-malato modula la actividad pirofosforilasa de la ADP-glucosa y el estado redox de los plastidios (Shitan y Yasaki, 2013; Shitan et al., 2013). Aunque, es posible que otros metabolitos, enzimas y/o proteínas también estén involucrados en el proceso.
Materiales y métodos
Reactivos y soluciones
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico y todas las soluciones se prepararon utilizando agua doblemente desionizada (Milli-Q, 18 MW cm) de un sistema de purificación Millipore. El tetracloroaurato de hidrógeno (III) trihidratado (HAuCl4 ∙ 3H2O, 99.99%) (520918) fue comprado a Sigma-Aldrich y el ácido málico (2-Amino-3-hydroxysuccinic acid, C4H7NO5, 97%), se compró a Merck. La resina Formvar 15/95, las rejillas de cobre 75 (Gilder-Grids Cu) y la mica muscovita V-1, se adquirieron en Electron Microscopy Sciences.
Biosíntesis de AuNPs
Se utilizó el método descrito por Chávez-Sandoval et al. (2016), con algunas modificaciones, descritas a continuación:
Obtención de los extractos naturales
Se obtuvieron extractos acuosos a partir del material biológico (Tabla 1). Se pesaron 5 g de material biológico (planta fresca si es posible) y se hirvieron en 10 mL de agua destilada, el extracto resultante se llevó a ebullición una segunda vez, agregando otros 10 mL de agua destilada y otros 5 g de planta, esto con el fin de promover la concentración.
Tabla 1 Descripción, características principales, e informes médicos del material biológico utilizado para la biosíntesis de AuNPs.
| Nombre | Descripción | Usos y propiedades | Observaciones |
|---|---|---|---|
| Nombre común: Clavo Nombre científico: Syzigium aromaticum 
|
De Indonesia son los botones de las flores del árbol los cuales son retirados y secados al sol o en cámaras de aire caliente hasta que estos hayan perdido dos tercios de su peso original y hayan obtenido su color característico. Recibe su nombre debido a la forma que simula igual a la de un clavo o de una forma de cáliz cuando las hojas de la flor se encuentran plegadas, justo antes de florecer. | Es una especia muy aromática. Se ha descrito que tiene propiedades antisépticas, cicatrizantes, analgésicas y estimulantes del apetito y la digestión. | Se ha reportado que es rico en aceites esenciales y han demostrado que tras combinarlo con los aceites esenciales de canela tiene una inhibición del crecimiento de bacterias gram negativas como la Pseudomona aeruginosa (Aglaoglu et al., 2007; Celis, 2010; Liu et al., 2017). |
| Nombre común: Pulmonaria Nombre científico: Lobaria pulmonaria 
|
De Europa, es un líquen foliar que se extiende por el suelo, generalmente al pie de los árboles o sobre el tronco, formando láminas. Tiene grandes hojas lobuladas, que son blanquecinas en clima húmedo y se vuelven marrones en clima seco. | Tiene un sabor amargo astringente debido al ácido estictínico que lo hace útil en medicamentos y colorantes utilizados en la preparación de soluciones tornasol. También se utiliza como cicatrizante, antiséptico y estimulante del apetito. | Se utiliza para el tratamiento de la tos, la fiebre común, el resfriado común y asma, debido a su efecto expectorante y mucolítico (Lerchundi, 2006). |
| Nombre común: Hojas de olivo Nombre científico: Olea europea 
|
De Europa, estas hojas provienen del árbol del olivo o aceitunas y son de un tamaño de entre 3 y 4 cm. Son de color verde y en la cara inferior son de un tono más claro. Están conectadas por pequeñas ramas a la rama que conecta con el tronco del árbol. | Efecto antioxidante, actividad anti esclerótica, antimicrobiana, inductora de apoptosis por efecto de la presencia de idroxitirosol (De la Fuente et al., 2004). | Se ha demostrado que el hidroxitirosol se presenta como un buen candidato para ser empleado como agente antimicrobiano contra bacterias patógenas como Haemophilus influenzae, Salmonella sp, Vibrio parahaemolyticus y Staphilococcus aereus en humanos (De la Fuente et al., 2004). |
| Nombre común: Manzanilla Nombre científico: Matricaria chamomilla 
|
De Europa, es una planta que llega a medir 40 cm de altura, es anual, ramificada, de olor característico y muy aromática, de tallo recto. La caracteriza su flor que consta de un centro color amarillo y pétalos de color blanco. | Tiene efectos antinflamatorios, antiespasmódicos, coleréticos, así como sedantes y relajantes, además de antisépticos por su contenido en aceites esenciales, flavonoides y otros principios activos. | Se ha reportado como tratamiento para infecciones oculares, ayuda contra el mal aliento, entre otros (Morales y Pardo de Santayana, 2006). |
| Nombre común: Noni Nombre científico: Morinda citrifolia 
|
De Asia, es un fruto de forma irregular, ovoide y grande de pulpa transparente, gelatinosa cuyas semillas se encuentran en dicha pulpa y son pequeñas y lustrosas de color café obscuro. Provienen de un árbol pequeño de hasta 4 metros de altura, muy ramificado con corteza lisa, delgada y verdosa, presenta hojas opuestas, grandes y lustrosas en tonos amarillentos al madurar, las flores se presentan en grupos y son de color blanco (Rojas, 2007). | Se han reportado muchos usos para el fruto, hojas, flores, semillas y raíz. Se encuentra en muchos productos naturistas para el tratamiento de diferentes padecimientos como las alergias, artritis, asma, cataratas, diabetes, dolores de cabeza, colitis, estrés, úlceras gástricas, varices, problemas cardiacos, presión, entre otros. Tiene uso antibiótico, regenerativo, antihistamínico, fortalecedor de huesos y sistema digestivo. | Se ha reportado que algunos compuestos provenientes del fruto y la raíz han demostrado tener efecto inhibitorio en cepas de Pseudomona aeruginosa y otras bacterias como Proteus morganii, Staphilococcus aereus, Bacillus subtilis, Escherichia Coli y Helicobacter pylori (Torres y Toranzo, 2006; Rojas, 2007). |
| Nombre común: Cuachalalate Nombre científico: Amphipterygium adstringens 
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De México, es una corteza obtenida del árbol del mismo nombre que proviene del náhuatl Cuauchachalatli, que significa árbol de chachalaca. Esta corteza es dura y gruesa, de apariencia lisa con algunos bultos. Si la extracción de la corteza del árbol no se realiza correctamente, muere porque no puede regenerarlo, por eso está en peligro de extinción. | Se utiliza en el tratamiento de la gastritis, también se utiliza para tratar úlceras pépticas. Se han encontrado más de 30 usos medicinales como agente antitumoral, hipocolesterolemiante, paludismo, fiebres intermitentes, astringente, antinflamatorio, entre otros. | Se ha demostrado que el extracto de cuachalalate tiene un efecto inhibidor contra Pseudomona aeruginosa y Helicobacter pylori (Castillo-Juárez et al., 2013; Rodríguez-García et al., 2015). |
Fuente: Elaboración de los autores.
Todos los extractos se prepararon el mismo día en que se realizó la síntesis de AuNPs para evitar interferencias en el resultado por oxidación y transformación de los metabolitos secundarios presentes en los extractos. También se midió el pH de cada extracto. El pH de los extractos se evaluó utilizando un medidor de pH de la marca Mettler Toledo MPC 227. Cada biosíntesis se llevó a cabo por triplicado para asegurar la reproducibilidad.
Las AuNPs obtenidas se dejaron enfriar a temperatura ambiente (25 ºC) con agitación, se envasaron en frascos estériles y luego se almacenaron a 4 ºC para su conservación y posterior caracterización por espectroscopía UV-Vis y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para determinar tamaño y forma.
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos son consistentes con los reportados por Rico-Moctezuma et al. (2010), Panda y Deepa (2011), Chávez-Sandoval et al. (2020 y 2016) y Khan et al. (2019), entre otros, sobre la biosíntesis de AuNPs.
Extractos naturales
En la Tabla 2, se muestra el pH de los extractos obtenidos. Chávez-Sandoval et al. (2020) reportan que el pH es uno de los factores importantes durante la biosíntesis para controlar el tamaño y forma de las NP. Es importante señalar que la mayoría de los extractos resultó ácido en un rango de pH de 4 a 4.5, excepto el extracto de manzanilla que resultó neutro con un pH de 7.3.
Tabla 2 pH de los extractos obtenidos y utilizados como agente reductor.
| Extracto | pH |
|---|---|
| Clavo | 4.1 |
| Manzanilla | 7.3 |
| Noni | 4.0 |
| Pulmonaria | 4.4 |
| Cuachalalate | 4.0 |
| Hojas de olivo | 4.5 |
Fuente: Elaboración de los autores.
La Figura 1 muestra el extracto natural y las AuNPs obtenidas de cada planta, a la izquierda se observa el extracto (A, C, E, G, I, K) y a la derecha las nanopartículas biosintetizadas (B, D, F, H, J, L).
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 1 A-B extracto y AuNPs de hojas de olivo; C-D extracto y AuNPs de cuachalalate; E-F extracto y AuNPs de pulmonaria; G-H extracto y AuNPs de noni; I-J extracto y AuNPs de manzanilla, y, K-L extracto y AuNPs de clavo.
Asimismo, se obtuvieron AuNPs de ácido málico en un coloide púrpura (Figura 2), con una longitud de onda máxima de aproximadamente 560 nm (Figura 4), lo cual indica que son mayores de 30 nm o que están agregadas.
Espectroscopía UV-Vis
Se realizó un barrido de 400 a 700 nm para determinar la longitud de onda máxima a la que absorbe cada AuNP. La Figura 3 muestra estos resultados, y, la Figura 4, la espectroscopía UV-Vis de AuNPs obtenidas con ácido málico como agente reductor.
Caracterización por TEM
Una vez que mediante espectroscopía UV-Vis se confirmó que obtuvimos AuNPs, las muestras fueron entregadas al servicio de microscopía de la UAM-Iztapalapa. La Figura 5 muestra los resultados.
Fuente: Elaboración de los autores.
Figura 5 Imágenes TEM de las AuNPs obtenidas: A-B clavo, C-D manzanilla, E-F noni, G-H pulmonaria, I-J cuachalalate, K-L hojas de olivo.
Las imágenes TEM de las AuNPs obtenidas con ácido málico están en proceso, pero, debido a la pandemia de coronavirus, no sabemos cuándo estarán disponibles.
Los resultados obtenidos se describen de manera general en la Tabla 3. Se observa una comparación del pH, longitud de onda, tamaño y forma de las AuNPs biosintetizadas. Solamente las AuNPs de manzanilla presentaron una absorbancia máxima a 528 nm y resultaron homogéneas, obsérvese que el pH del extracto utilizado como agente reductor fue de 7.3.
Tabla 3 Extracto, pH, longitud de onda máxima (λ ), diámetro(Ø) y morfología de las AuNPs obtenidas.
| Extracto | pH | (λ) | (Ø) nm | Morfología |
|---|---|---|---|---|
| Clavo | 4.1 | 550 | 20 | Heterogéneas, esféricas y triangulares |
| Manzanilla | 7.3 | 528 | 20 | Homogéneas, esféricas |
| Noni | 4.0 | 546 | 20 | Heterogéneas, agregadas, esféricas |
| Pulmonaria | 4.4 | 554 | 50-100 | Heterogéneas, agregadas, esféricas |
| Cuachalalate | 4.0 | 534 | 20 | Heterogéneas, principalmente esféricas |
| Hojas de olivo | 4.5 | 552 | 100 | Heterogéneas, esféricas, triangulares y hexágonos |
Fuente: Elaboración de los autores.
La espectroscopía UV-Vis mostró que las AuNPs de ácido málico presentan una absorbancia máxima de 560 nm, por lo que esperaríamos AuNPs heterogéneas de 50 a 100 nm de diámetro como las AuNPs de pulmonaria o de hojas de olivo, que presentan una absorbancia máxima a 554 nm y 552 nm, respectivamente. Las AuNPs de clavo, cuachalalate y noni tienen un tamaño aproximado de 20 nm, aunque, se observan agregadas y heterogéneos por TEM, tal vez porque el pH del extracto utilizado como agente reductor fue ácido, rondando un pH de 4.
Se observa, asimismo, que las AuNPs de manzanilla son homogéneas y mayoritariamente esféricas debido a que el pH del extracto con el que fueron sintetizados fue neutro (pH 7), y como lo reportan Chávez-Sandoval et al. (2020) en la biosíntesis es crucial que el pH sea neutro o cercano a la neutralidad para obtener nanopartículas homogéneas en tamaño y forma.
Estos resultados de biosíntesis con extractos de plantas también son consistentes con lo reportado por Chávez-Sandoval et al. (2016), quienes sintetizaron AuNPs a partir de extractos de cactus (Opuntia sp.), cebolla (Allum sp.), pera (Pyrus sp.), café (Coffea sp.) y laurel (Laurus sp.); por Panda y Deepa 2011, en su revisión sobre la biosíntesis de nanopartículas de oro de microorganismos, plantas y otras fuentes biológicas; o por Khan et al. (2019), sobre las estrategias de fabricación de nanopartículas de oro a través de rutas basadas en material biológico de plantas y donde destacan la diversidad de las aplicaciones de estos bionanomateriales.
Conclusiones
Se obtuvieron nanopartículas de oro estables (AuNP) a partir de extractos de clavo (Syzygium aromaticum ); manzanilla (Matricaria chamomilla); noni (Morinda citrifolia); pulmonaria (Lobaria pulmonaria); cuachalalate (Amphipterygium adstringens) y hojas de olivo (Olea europea), los extractos tuvieron un pH ácido de 4 a 4.5, excepto el extracto de manzanilla que presentó un pH de 7.3. También se obtuvieron AuNPs estables a partir del ácido málico, debido a lo cual se corrobora que este metabolito está involucrado en la reducción de iones de oro durante la biosíntesis.
Por último, las AuNPs homogéneas, esféricas y de aproximadamente 20 nm como las de la manzanilla (Matricaria chamomilla) se pueden utilizar también para la administración de fármacos dirigida o desarrollar biosensores y acelerar la detección de microorganismos patógenos con estos dispositivos, entre otros usos.
Recomendaciones
Las AuNPs obtenidas mediante biosíntesis podrían ser utilizadas como agentes desinfectantes en implementos médicos como guantes o mascarillas, principalmente porque la pandemia de coronavirus ha demostrado la urgencia de contar con estos insumos médicos, entre otros, como sábanas o toallas de hospital, y ropa de cama en hoteles, incluso en condiciones no epidémicas o pandémicas, en especial por la baja toxicidad de las AuNPs así obtenidas, y porque si estos implementos se producen a gran escala podrían reducirse los costos.
Perspectivas
Se buscará obtener recursos a través de inversiones públicas y/o privadas para desarrollar las aplicaciones de estas AuNPs como sanitizantes y se realizarán pruebas de sensibilidad a Pseudomona aeruginosa con diferentes concentraciones de AuNPs para ser aplicadas por vía oral, como, por ejemplo, nanocápsulas que se eliminen fácilmente del cuerpo humano, o mediante aerosol, como posible tratamiento primero para la neumonía y SARS-CoV-2, y, más adelante, para otras enfermedades nosocomiales, aportando así al avance de la nanomedicina en México y en el mundo (Kim et al., 2010; Hu et al., 2020).
