Síntesis de Ag NP’s

La síntesis de las Ag NP’s, utilizada en este estudio, se basó en el método desarrollado por ^{Solomon et al. (2007)}, con algunas modificaciones. En una reacción típica, en 30 ml de una solución recién preparada 0.002M de borohidruro de sodio (NaBH₄), se le agregaron 2 ml de una solución 0.001M de nitrato de plata (AgNO₃) con una velocidad de adición de 0.2ml/seg. La disolución se mantuvo en agitación magnética hasta que se añadió completamente el AgNO₃. La formación de las Ag NP’s puede confirmase al observar que la disolución presenta una coloración amarillo claro (^{Solomon et al. 2007}).

Preparación de las muestras de adhesivo adicionado con Ag NP’s

Para este estudio, se seleccionó un adhesivo ortodóncico fotopolimerizable convencional (Transbond MIP, 3M Unitek, CA, EUA) debido a sus propiedades hidrofílicas. Las Ag NP’s, suspendidas en agua deionizada en una concentración de 3.3 nM, se añadieron al adhesivo con una micropipeta en diferentes concentraciones y se mezclaron en el adhesivo a través de agitación en vórtex por 1 min. Los grupos de tratamiento que se emplearon en este estudio pueden observarse en la Tabla 1.

Prueba de difusión en disco

La actividad antibacteriana del adhesivo se determinó por la técnica de difusión en disco de acuerdo con las recomendaciones del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Se prepararon cultivos frescos con S. aureus, E. coli y S. faecalis. Los cultivos fueron ajustados con solución salina estéril para obtener una turbidez equivalente al 0.5 del estándar de McFarland. Se prepararon placas de agar Mueller-Hinton (MHA) y se inocularon con 200 μl de cada cepa bacteriana del estándar de McFarland en dilución 1:20. Posteriormente se colocaron discos de papel filtro estériles sobre la superficie de las placas de agar y se agregaron con micropipeta 20 μl del agente a probar en cada disco según correspondiera, se utilizó como control positivo (+) un disco con clorhexidina y como control negativo (-) se empleó un disco con agua destilada estéril; y se incubaron a 37 °C durante 24 horas en condiciones aeróbicas. El ensayo se realizó por triplicado en dos ensayos independientes. Finalmente, se tomaron fotografías de las cajas y se midieron en milímetros los halos de inhibición bacteriana producidos en las placas de agar, con el programa Image J (U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). El programa fue calibrado usando una distancia conocida y cada halo fue medido en tres direcciones, obteniéndose el promedio del diámetro de cada uno de los halos.

Ensayo de citotoxicidad

Cultivo celular. Fibroblastos gingivales humanos (FGH) fueron obtenidos a partir de tejido gingival recolectado durante la extracción de la cirugía del tercer molar de un paciente de 25 años con consentimiento informado escrito previo firmado y aprobado por el Comité de Bioética de la Escuela Nacional de Educación Superior (ENES), Campus León, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Todos los tejidos se cortaron en pequeños explantes utilizando una hoja de bisturí estéril y los fragmentos de tejido se sembraron en una placa de cultivo de 10 cm y se cultivaron en Alpha Modification of Eagle’s Medium (α-MEM, Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA, EUA) Complementado con un 20% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS, Life Technologies, Gibco), 100 UI/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies, Gibco). Los cultivos primarios se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO₂ al 5% hasta que la población celular cubrió el 80% de la placa. Después, las células se recuperaron mediante tratamiento con 0.25% de tripsina-edta-2Na al 0.025% en PBS (-) y se subcultivaron o se usaron para experimentos. Las células se subcultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Gibco) suplementado con 10% de SFB, 1% de Glutamax (Life Technologies, Gibco) y 2% de penicilina y estreptomicina (Life Technologies, Gibco).

Actividad citotóxica (dosis-respuesta). De un cultivo de fibroblastos gingivales humanos (FGH) en su división celular (PDL, del inglés population doubling level) 12, se obtuvo un cultivo secundario en su división número 13. Se inocularon dichas células (2x10⁵ células/ml) en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h para lograr la completa confluencia y adherencia celular. Posteriormente, se inocularon las muestras de adhesivos con Ag NP’s a diferentes concentraciones (10, 5, 3 y 0 v/v%) previamente diluidas cada una de ellas en medio de cultivo en una relación 1:1 para permitir el crecimiento celular; más adelante se realizaron diluciones seriadas de cada una de las muestras. Después, se incubaron durante 24 horas a 37 ºC, con una humedad relativa del 95% y CO₂ al 5%. El número relativo de células viables se determinó mediante el método MTT (Sigma-Aldrich, St Luis, MO, EUA). El medio de cultivo de cada pocillo se reemplazó con MTT (0.2 mg/ml) disuelto en DMEM, y las células se incubaron durante 4 h a 37 °C. Después de reemplazar el medio, el formazano se disolvió completamente en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich) y se determinó la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Thermo Scientific, St. Luis, MO, EUA). La citotoxicidad se calificó de acuerdo con la norma ISO 10993-5 como no citotóxica (viabilidad celular superior al 75%), ligeramente citotóxica (viabilidad celular entre 50% a 75%), moderadamente citotóxica (la viabilidad celular entre 25% a 50%), y severamente citotóxica (viabilidad celular inferior al 25%). La concentración citotóxica media (CC₅₀) se determinó a partir de la curva dosis-respuesta. Se obtuvieron datos reproducibles por triplicado y en tres experimentos independientes.

Análisis estadístico

Los datos descriptivos se expresan como la media ± desviación estándar (SD). La prueba de normalidad de Shapiro-Wilk se realizó para todos los datos. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de ANOVA de una vía, t de Student, Kruskal-Wallis y la prueba U de Mann-Whitney. Se utilizó SPSS (Paquete estadístico para las ciencias sociales, Chicago, IL, EUA) En todos los análisis. Las diferencias se consideraron significativas si p≤0.05.

Síntesis de Ag NP’s

En la Figura 1, se observa el pico de la resonancia de plasmón superficial en 399 nm, el cual se encuentra dentro del rango característico de la banda de absorción centrada en 395 a 438 nm asignada a la resonancia del plasmón superficial de nanopartículas de plata de forma esférica, el tamaño de estas es mayor conforme más se encuentra desplazado a la derecha de 400 nm del espectro. La anchura a media altura (Full Width at Half Maximum, FWHM) del plasmón fue de 68 nm. De acuerdo con un reporte de ^{Solomon, et al., 2007}, con estos datos puede predecirse el tamaño de partícula de las Ag NP’s (a través de este método de síntesis a través de reducción química) el cual se encuentra en el rango de 10-14 nm de diámetro.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 1 Espectro de Uv-vis de las nanopartículas de plata. 

En este mismo estudio se postula que la adsorción de borohidruro juega un papel clave en la estabilización de las nanopartículas de plata durante su formación al proporcionar una carga negativa superficial de partículas. Los átomos de plata que conforman cada nanopartícula son pasivados o estabilizados por los aniones del [BH-] provenientes del agente reductor, un diagrama ilustrativo de lo anterior puede observarse en la Figura 2. Por lo tanto, mientras la proporción de borohidruro de sodio: nitrato de plata se encuentre en una relación estequiométrica de 2:1, las partículas obtenidas serán estables a través del tiempo (^{Solomon et al., 2007}) y esto se confirma a través del espectro de Uv-vis. En el método de síntesis empleado por Solomon se propone que con el fin de evitar la precipitación o agregación de las partículas se adicione un surfactante, polivinilpirrolidona (PVP), sin embargo, en este estudio no se utilizó dicho surfactante pues se colocaron en el adhesivo y este cumplió con la función de estabilizar a las NP’s.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 2 Diagrama ilustrativo de la pasivación de una nanopartícula de plata con los aniones [BH-] provenientes del borohidruro de sodio. 

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar

Entre las complicaciones más importantes del tratamiento de ortodoncia fija se encuentra la desmineralización del esmalte, ya que la aparatología fija ortodóncica facilita la acumulación de placa, lo que conlleva a un aumento en el recuento bacteriano (^{Agarwal et al. 2015}), debido a esto, es importante desarrollar un adhesivo que presente actividad antimicrobiana para reducir la formación de biofilm en la interfase diente-bracket.

La prueba de difusión en agar determina la capacidad de los agentes antibacterianos para difundirse con el agar y producir una zona de inhibición bacteriana (^{Rose y Miller, 1939}), sin embargo, es una prueba cualitativa que solo puede mostrar si existe o no un efecto antimicrobiano (^{Jorgensen y Turnidge, 2015}), cuando no ha sido estandarizado a través de regresión lineal la asociación entre agentes antimicrobianos nuevos y la susceptibilidad a cada cepa bacteriana (^{Matuschek, Brown y Kahlmeter, 2014}). Por otro lado, esta prueba es útil para detectar resistencias bacterianas (^{Balouiri y Sadiki, 2016}), esto es evidente cuando se observan colonias dentro de los límites de la zona de inhibición. En la presente prueba de difusión en agar de este estudio, no se observaron colonias que indicaran resistencia bacteriana en ninguna de las cepas en estudio. Por otra parte, los promedios de los halos de inhibición se compararon por medio de la prueba estadística de Mann-Whitney, entre las diferentes concentraciones de las nanopartículas de plata incorporadas en el adhesivo ortodóncico. En la Tabla 2 se muestran los resultados de dicha prueba y las comparaciones múltiples. Se observa que las Ag NP’s (sin adhesivo) son las que exhiben para todas las cepas bacterianas estudiadas el mejor efecto antibacterial, y que dicho efecto se ve ligeramente disminuido al incorporarse en el adhesivo. También los resultados de esta prueba muestran que el efecto es dosis-dependiente, es decir, que mientras mayor es la dosis de las Ag NP’s incorporadas, mejor es el efecto antibacteriano que exhibe el adhesivo.

Ensayo de citotoxicidad

En la Tabla 3 y Figura 3 se muestran los resultados obtenidos de la viabilidad celular relativa en FGH expuestos a diferentes concentraciones de adhesivo ortodóncico adicionado con nanopartículas de plata (v/v%). Las nanopartículas por sí solas son consideradas no citotóxicas (viabilidad celular ≥75%) excepto en las tres dosis más altas en donde resultaron tener una citotoxicidad ligera (viabilidad celular <75%), el adhesivo sin nanopartículas muestra una citotoxidad severa (viabilidad celular <25%) en la dosis más alta. La citotoxicidad de los compuestos correspondió de la siguiente manera con base en la concentración citotóxica media (CC₅₀): Adh/Ag NP’s 5 (0.95%)>Adh (1.37%)>Adh/Ag NP’s 3 (1.45%)>Adh/Ag NP’s 10 (1.48%). El análisis estadístico se llevó a cabo a través de comparaciones múltiples con t de Student y Post ANOVA de Tukey.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 3 Gráfico de viabilidad celular de FGH en contacto con el adhesivo de uso ortodóncico adicionado con nanopartículas de plata a diferentes concentraciones. 

A pesar de que las nanopartículas de plata han sido muy estudiadas siguen siendo una de las áreas de investigación más controvertidas con respecto a su toxicidad para los sistemas biológicos. Se ha encontrado que inducen citotoxicidad moderada in vitro en ensayos de micronúcleos en células TK6 (^{Li et al., 2012}) y células de hígado de rata BRL 3a (^{Hussain et al., 2005}). En otro estudio se analizó la distribución de las Ag NP’s al estar en contacto con células y estas se encontraron dentro de las mitocondrias y el núcleo empleando microscopía electrónica de transmisión (TEM), lo cual implica su participación directa en la toxicidad mitocondrial y el daño del ADN. En dicho estudio se propuso un posible mecanismo de toxicidad que implica la interrupción de la cadena respiratoria mitocondrial por las Ag NP’s, lo que conduce a la producción de especies reactivas al oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) e interrupción de la síntesis de ATP, que a su vez causa daño en el ADN. Se anticipa que el daño en el ADN se ve aumentado por la deposición de las NP’s, seguido de las interacciones de Ag NP’s con el ADN, lo que conduce al detenimiento del ciclo celular en la fase G2/M (^{Choi y Hu, 2008}). Asimismo, se ha hipotetizado que la liberación de iones extracelular e intracelularmente es un mecanismo que actúa de forma simultánea a la deposición de dichas nanopartículas (^{Choi et al. 2008}). También se ha postulado que otro posible mecanismo de muerte celular es a través de apoptosis mediada por vía receptor 2 tipo-Toll (^{Kim et al., 2012}), un diagrama de estos mecanismos puede observarse en la Figura 4. Por otro lado, los resultados de un estudio in vivo realizado por ^{Kim et al. (2008)} mostraron que las nanopartículas de plata no afectaron ni el conteo de eritrocitos policromáticos micronucleados, tomados como un indicador de daño en el ADN, ni la relación PCE/(PCE+NCE), un indicador de toxicidad para células de la médula ósea, en las ratas macho y hembra; sin embargo, los 28 días de dosis orales repetidas de nanopartículas de plata indujeron toxicidad hepática y tuvieron un efecto de coagulación en la sangre periférica (^{Kim et al., 2008}). Los resultados del presente estudio muestran, que la viabilidad celular de los FGH fue superior para las Ag NP’s sin adhesivo en todas las diluciones seriadas (mostrando no citotoxicidad) excepto en la dosis más alta, en donde la viabilidad celular fue similar a la del adhesivo con Ag NP’s al 10, 5 y 0%. Lo cual es indicativo de que el adhesivo MIP ortodóncico en sí mismo exhibe una citotoxidad moderada a severa similar al adhesivo si se le incorporan Ag NP’s, es notorio que estadísticamente hubo diferencias significativas entre el adhesivo con nanopartículas de plata 10 en comparación con el adhesivo sin nanopartículas. La mayor viabilidad celular se observa en las nanopartículas de plata presentando diferencias estadísticamente significativas, en todas las dosis, respecto al adhesivo con o sin nanopartículas, por lo cual parece evidente que dichas nanopartículas no potencializan el efecto citotóxico del adhesivo en sí mismo.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 4 Diagrama ilustrativo de los posibles mecanismos de acción de las nanopartículas sobre las células.