Introducción

Actualmente, las ciencias biomédicas buscan mejorar el diagnóstico y la terapia de varias enfermedades, por medio de novedosos dispositivos a escala nanométrica. El trabajo llevado a cabo en nuestro laboratorio está orientado al desarrollo de nuevos dispositivos a escala nanométrica para el tratamiento de distintas patologías. Utilizando herramientas nanotecnológicas, estudiamos aspectos fundamentales de los mecanismos por los cuales diferentes patologías como el cáncer o la diabetes afectan la nanomecánica celular. Este es un punto muy importante dado que los datos obtenidos en los últimos años por diferentes laboratorios han mostrado que son varias las patologías que provocan cambios a nivel nanomecánico en las células. A continuación, presentaremos un par de ejemplos de nuestro trabajo referente al uso de la microscopía de fuerza atómica (MFA) para estudiar los cambios en la nanomecánica celular (estudiado a nivel de célula única). Entender los mecanismos físicos, químicos y biológicos por los que una patología afecta un tejido biológico es fundamental para abrir nuevas puertas en la búsqueda de mejoras en tratamientos o herramientas diagnósticas para esas patologías.

Microscopía de fuerza atómica

La microscopía de fuerza atómica se ha constituido como una herramienta fundamental para la investigación en diversas áreas del conocimiento, incluyendo las ciencias biológicas y biomédicas. El MFA permite no sólo reconstruir la topografía de la muestra a dimensiones nanométricas, sino también aplicarle fuerzas controladas a la vez que se mide su deformación. Esto último hace posible caracterizar la muestra en términos de su mecánica, conociendo de forma cuantitativa parámetros como el módulo de Young (relación entre tensión aplicada y deformación causada) y la adhesividad en la superficie.

Al acoplar el MFA con un microscopio óptico de epifluorescencia, que cuente con elementos capaces de controlar la temperatura y la atmósfera en la que se colocará la muestra, se obtiene un instrumento con un gran potencial para el estudio de muestras biológicas en condiciones fisiológicas. De esta forma se pueden estudiar los efectos que diferentes tipos de eventos celulares (como la locomoción, la diferenciación, el envejecimiento, la activación fisiológica, la electromotilidad) o diferentes patologías pudieran tener en la morfología y en propiedades mecánicas, a nivel de célula única.

En la última década se han publicado varios trabajos analizando las propiedades visco-elásticas de diferentes tipos celulares (para revisiones recientes véase ^{Dufrene et al., 2011}; ^{Yango et al., 2016}; ^{Müller y Dufrêne, 2017}.

A continuación, describiremos, en su contexto correspondiente, dos trabajos realizados en nuestro laboratorio donde se aplica esta herramienta.

Neuroblastoma

El neuroblastoma es un tipo de tumor embrionario que puede causar la muerte en niños y se origina en progenitores o células inmaduras del sistema nervioso simpático (^{Schulte, 2015}; ^{Domingo-Fernández et al., 2013}).

La lámina A/C es un componente importante de la lámina nuclear que participa en procesos tales como la replicación y transcripción del ADN; su función es soportar el envoltorio nuclear y proveer de sitios de anclaje a la cromatina (^{Hutchison y Worman, 2004}; ^{Takeshi et al., 2016}; ^{Worman y Schirmer, 2015}; ^{Foisner, 2015}; ^{Shimi et al., 2015}).

En un trabajo reciente de algunos de los integrantes de nuestro grupo de investigación, observamos por primera vez que la lámina A/C se encuentra silenciada por medio de la hipermetilación aberrante de su promotor en líneas celulares de neuroblastomas (^{Rauschert et al., 2017}). Se observó también que el uso de agentes desmetilantes restituyeron su expresión tanto a nivel de ARN como a nivel proteico.

Las células carentes de lámina A/C demostraron un mayor potencial neoplásico, dado entre otros factores por un mayor potencial de migración e invasión y alteraciones en los diferentes componentes del citoesqueleto. Se comprobó utilizando MFA que las propiedades nanomecánicas se encuentran modificadas en estas células carentes de lámina A/C, resultando en células menos rígidas (menor valor del módulo de Young aparente), con el citoesqueleto alterado, lo que explicaría su tendencia a una mayor capacidad de metástasis (Figura 1).

Fuente: Figura extraída de ^{Rauschert et al., 2017}, PLoS One.

Figura 1 Histogramas normalizados del módulo de Young aparente (E) obtenido a partir de curvas de fuerza realizadas en células SK-N-SH control (rosado) y células SK-N-SH con la lámina silenciada (azul). Se encontró que E = 1.28 ± 0.37 kPa para el control y E = 0.73 ± 0.30 kPa para las células con lámina silenciada. 

Estos resultados abren el camino a nuevos estudios de la hipermetilación de promotores de la lámina A/C como un posible biomarcador, en vistas a futuras aplicaciones terapéuticas.

Diabetes

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica y sistémica que afecta actualmente a millones de personas en todo el mundo. Los estudios de proyección de la Federación Internacional de Diabetes estiman que el número de adultos a ser afectados aumentará a 552 millones para el año 2030 (^{Whiting et al., 2011}). La DM es un desorden metabólico caracterizado por hiperglucemia, insulino-deficiencia y/o resistencia a la misma (^{Boudina y Abel, 2010}). La DM está asociada con muchas complicaciones como retinopatía, nefropatía, neuropatía periférica y enfermedad cardiovascular, los cuales son desde el punto de vista pato fisiológico similares tanto en DM tipo 1 (DM1) y DM tipo 2 (DM2) (^{Waddingham et al., 2015}). La enfermedad cardiovascular es la patología asociada más común de la DM, y la principal causa de mortalidad en los pacientes (^{Candido et al., 2003}). En un estudio internacional, el 50 % de los pacientes con diabetes fallecieron por enfermedades cardiovasculares (principalmente enfermedad cardíaca e infarto) (^{Morrish et al., 2001}). La DM1 es resultado de un mecanismo autoinmune y representa aproximadamente 5 al 10 % de los casos de diabetes. Sin embargo, la DM2 representa el 90 al 95 % de los casos de DM y se inicia por la interacción entre genotipo, el ambiente y factores de estilo de vida (^{Laakso y Kuusisto, 2014}).

Diabetes y patologías cardíacas

Las patologías cardíacas asociadas a la DM incluyen cardiomegalia, disfunción del ventrículo izquierdo (VI), remodelamiento eléctrico ventricular, entre otros. Por lo tanto, las complicaciones cardiovasculares, como la arterosclerosis de grandes arterias (carótidas, aorta, y arterias femorales) y la arterosclerosis coronaria, contribuyen al riesgo de infarto de miocardio y paro cardíaco (^{Boudina y Abel, 2007}). Datos clínicos y experimentales sugieren que la diabetes promueve la cardiomiopatía en ausencia de arteriosclerosis coronaria e hipertensión. Los mecanismos patogénicos principales vinculados con esta enfermedad se dividen en: alteraciones metabólicas, fibrosis intersticial, enfermedad microvascular y disfunción autonómica (^{Arieta, 2011}). Así como también, la presencia de hipertrofia del miocardio, falla en las proteínas contráctiles, acumulación de proteínas de la matriz extracelular (fibrosis), alteración de la homeostasis iónica, formación de productos glicosilados y disminución de la función del VI (^{Battiprolu et al., 2010}); (^{Boudina y Abel, 2010}); (^{Gil-Ortega y Carlos, 2006}).

Se ha considerado por mucho tiempo que las disfunciones diastólicas asociadas a la DM son principalmente atribuidas a la fibrosis del VI y la hipertrofia del corazón, causando el aumento de rigidez en el miocardio. Sin embargo, recientes investigaciones proveen evidencia de que la resistencia a la insulina y la hiperglucemia también alteran los procesos intracelulares de los cardiomiocitos, responsables de iniciar y regular la contracción cardíaca (^{Waddingham et al., 2015}).

Fibrosis e hipertrofia

En biopsias de corazones de pacientes diabéticos, se ha encontrado fibrosis intersticial, hipertrofia de miocitos y un aumento en la glicosilación de proteínas contráctiles. Estos factores contribuyen a un menor rendimiento diastólico y a la hipertrofia del VI en estos pacientes. La fracción de eyección (FE) de un corazón es un valor expresado en porcentaje que mide la disminución del volumen del VI en sístole, con respecto a la diástole. Es un parámetro, entonces, que se utiliza para evaluar el porcentaje de sangre expulsada, y, por tanto, el funcionamiento del VI. ^{Van Heerebeek et al., 2008}, reportaron que en pacientes diabéticos con una fracción de eyección disminuida, la deposición de productos finales de glicosilación avanzada (advanced glycation end products-AGEs) y la deposición de colágeno son determinantes importantes en una mayor rigidez del VI. Mientras que una mayor tensión en reposo es el principal determinante de una mayor rigidez del VI en pacientes que tienen falla cardíaca con una FE normal.

Los AGEs se forman cuando la glucosa o metabolitos de la glucosa producen modificaciones covalentes estables en proteínas. Estas proteínas modificadas no sólo causan daños directamente, sino que contribuyen a la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) (^{Wang et al., 2006}). Estos, a su vez, causan estrés oxidativo ante la ausencia de defensas antioxidantes suficientes para degradarlos (^{Murarka y Movahed, 2010}). Proteínas extracelulares como el colágeno y la elastina son particularmente vulnerables a la glicosilación. Esto podría disminuir la degradación del colágeno, lo cual contribuye a una acumulación del mismo (fibrosis intersticial). Los crosslinks -productos de la glicosilación no enzimática del colágeno y la elastina en el corazón diabético- junto con la fibrosis resultante, también causan un aumento en la rigidez del miocardio y dificultan la relajación cardíaca, fenómenos típicos en la diabetes (^{Wang et al., 2006}).

Diabetes y nanomecánica del cardiomiocito

Nuestro grupo de investigación viene trabajando con un modelo animal bien caracterizado de diabetes tipo 1. Este modelo se basa en utilizar inyecciones intra-peritoneales de streptozotocina a ratones CD1. La streptozotocina es un antibiótico con propiedades antitumorales y capacidad citotóxica selectiva para las células beta del páncreas. Esta droga es muy utilizada para generar diabetes (insulino-deficientes) en los animales de experimentación. Utilizando este método hemos constatado un mayor índice de mortalidad en los ratones diabéticos que en los controles (Figura 2).

Fuente: Figura extraída de ^{Benech et al., 2014}. American Journal of Physiology, Cell Physiology.

Figura 2 Gráfica de la sobrevida de ratones controles (■) e inyectados con streptozotocina (∆) a lo largo del tiempo. 

Por otra parte, se realizaron imágenes de cortes histológicos obtenidos del miocardio de ratones diabéticos. Las muestras histológicas mostraron células desordenadas, núcleos irregulares, fibras de miocardio fragmentadas, tal como se muestra en la Figura 3.

Fuente: Figura extraída de ^{Benech et al., 2014}. American Journal of Physiology, Cell Physiology.

Figura 3 Cortes histológicos de ventrículo izquierdo de ratón control (A) y con diabetes inducida por estreptzotocina (B). Magnificación 40x. 

Se observaron también depósitos de colágeno intersticial, constatando así alteraciones en proteínas de la matriz extracelular. Se detectó por Western Blot la reducción en la expresión de la bomba de Ca⁺² y el aumento en la expresión de NCX1 en homogenizados obtenidos del VI de corazones diabéticos, comparado con animales control (^{Zambrana, 2016}). Estos resultados confirman que en nuestro modelo animal de diabetes, la expresión de proteínas del propio cardiomiocito está siendo afectada por la patología. El grupo de investigación es pionero en el estudio de propiedades visco-elásticas, mediante nanoindentación-MFA, en cardiomiocitos aislados provenientes de ratones normales o diabéticos.

Hemos determinado utilizando MFA el módulo elástico aparente (MEA) de cardiomiocitos aislados vivos de ratones diabéticos, cuyo valor medio fue 112% más alto que el de los cardiomiocitos de ratones control (91 ± 14 kPa para diabéticos y 43 ± 7 kPa para cardiomiocitos control). Estos resultados sugieren que las propiedades materiales de cardiomiocitos vivos pueden ser afectadas por la diabetes, resultando en cardiomiocitos más rígidos y contribuyendo muy probablemente a la rigidez diastólica del VI, fenómeno que ya ha sido observado en pacientes diabéticos (^{Falcão-Pires et al., 2011}). Se detectó un reordenamiento de la actina F en cortes de corazón proveniente de los corazones de ratones diabéticos, así como en los cardiomiocitos aislados. En los cardiomiocitos diabéticos, observamos una fuerza de adhesión (interacción entre la punta del tip del MFA y la muestra) 10.5 veces mayor que los grupos control, sugiriendo que el sarcolema del cardiomiocito diabético fue profundamente afectado por la diabetes (^{Benech et al., 2014}, ²⁰¹⁵). Al aislarse los cardiomiocitos se pierden la mayoría de los componentes de la matriz extracelular (^{Lammerding, 2004}) por lo que nuestros resultados sugieren que ese cambio -aumento- en el número y/o activación en moléculas de adhesión se encuentra en la superficie del cardiomiocito diabético. Por lo tanto las alteraciones mecánicas del corazón diabético no pueden ser atribuidas solamente a cambios en la composición de la matriz extracelular, sino que también deben atribuirse a cambios significativos de las propiedades nanomecánicas intrínsecas de los propios cardiomiocitos (^{Benech et al., 2014}, ²⁰¹⁵; ^{Zambrana, 2016}; ^{Bervejillo, 2015}; ^{Meininger, 2014}).

Actualmente nos encontramos trabajando con la línea celular H9c2. Ésta es una línea celular derivada de corazones de embriones de rata y ha sido usada como modelo in vitro de músculo cardíaco. Esta línea celular retiene varios de los elementos eléctricos y hormonales de los cardiomiocitos y se han constituido en un modelo aceptado para estudiar los efectos de la diabetes en el corazón. De hecho, utilizando esta línea celular observamos que la incubación por 48 hrs en un medio hiperglucémico e hiperlipidémico torna a estas células más rígidas (MEA mayor) que cuando son incubadas en un medio con concentraciones de glucosa y lípidos normal (^{Alberro, 2016}). Utilizando microscopía láser confocal (marcación de actina F con faloidina), el método de nanoindentación por MFA y drogas que desensamblan la actina F (como citocalasina B o D), hemos obtenido resultados que sugieren una correlación entre el aumento de la rigidez de las células en un medio hiperglucémico e hiperlipidémico (MEA mayor) con un reordenamiento de la actina F. Nuestras evidencias sugieren que la actina F es responsable por el 70 % del valor del MEA determinado. Por lo tanto, el reordenamiento espacial de actina F producido por el medio hiperglucémico e hiperlipidémico indica que este fenómeno debería ser estudiado con más profundidad en cardiomiocitos vivos provenientes de ratones diabéticos.

Actualmente estamos estudiando diferentes drogas con la idea de revertir el efecto que la diabetes produce en la nanomecánica del cardiomiocito y en la línea celular H9c2.

Discusión y perspectivas

Utilizando el MFA se logró verificar que las patologías estudiadas alteran la mecánica celular de manera significativa. En el primero de los trabajos presentados, se comprobó que líneas celulares de neuroblastoma con la lámina A / C silenciada tenían una mayor capacidad de metástasis debido a las alteraciones en sus propiedades mecánicas. Una mejor comprensión de estas diferencias puede abrir la puerta a nuevas terapias, como radiaciones de alta frecuencia pero baja intensidad, ya que al tener distintas propiedades mecánicas las células responderían de distinta manera a la misma radiación.

En el segundo trabajo, constatamos que en un modelo in vivo e in vitro, la diabetes produce un aumento en la rigidez celular y un reordenamiento de la actina F. Hoy en día estamos estudiando si diferentes drogas “antidiabéticas” revierten los efectos observados.

Como hemos visto, es de especial importancia comprender los mecanismos por los que distintas patologías modifican la mecánica celular para poder desarrollar nuevas terapias o herramientas de diagnóstico.