Área de estudio

Las 10 muestras de la rizósfera se obtuvieron de cinco poblaciones de especies de agave silvestre distribuidos en dos municipios del estado de Oaxaca (Tabla 1). Las poblaciones se seleccionaron en localidades donde se extraen continuamente agaves silvestres para obtener mezcal de alta calidad. Las muestras de la rizósfera se obtuvieron de plantas sanas de agave de entre 2 y 4 años de edad, las plantas se encontraban contiguas a plantas de agave que mostraban síntomas de pudriciones húmedas del cogollo. Las muestras de la raíz se tomaron a distancia de entre 5 y 10 cm del cuello de la planta y a profundidad de entre 30 y 40 cm de tres plantas por cada especie de agave para formar una muestra compuesta de 200 g de raíces y suelo rizosférico.

Aislamiento de poblaciones de Pseudomonas fluorescentes

Las muestras de raíces se agitaron suavemente a mano hasta mantener el suelo adherido de forma natural a la raíz de la planta (^{Aranda et al. 2011}); después, las raíces con suelo rizosférico se cortaron en fragmentos de 1 cm y colocar 1 g de raíz de cada muestra en tubos estériles de polipropileno (50 mL) (PROLAB México) con 9 mL de buffer fosfatos (g L⁻¹): NaCl 8.0, KCl 0.2, Na₂HPO₄ 1.44 y KH₂PO₄ 0.24, pH 7 (^{Hoang et al. 2019}). La mezcla se homogeneizó por agitación a 90 rpm (Labnet ORBIT 1900. USA) durante 30 min; posteriormente se sometió a sonificación (Ultrasonic Cleaners, Branson 8510. USA) por 30 min. De esta suspensión, se realizaron diluciones en serie (100 hasta 10⁻⁴) y se sembraron 100 µL de cada dilución con tres repeticiones en medio de cultivo B de King suplementado con cicloheximida, ampicilina y cloranfenicol (^{Landa et al. 2006}) y luego se incubaron a 28 ◦C por 72 h. Las colonias fluorescentes se determinaron en un transiluminador de luz ultravioleta (UV 380 nm). La densidad de Pseudomonas fluorescentes se determinó por el método de diluciones en serie y conteo en placa de colonias (^{Peng et al. 2009}). Con los datos del número de colonias se realizó el análisis de varianza y la comparación de medias por el método Tukey (α = 0.05), con el programa R versión 3.6.1. La densidad de Pseudomonas se reportó en UFC g⁻¹ de raíz.

Aislamiento de poblaciones de Bacilllus spp

De cada muestra se colocó 1 g de raíz en 20 mL de buffer fosfatos descrito anteriormente y homogeneizó por agitación a 90 rpm durante 30 min; posteriormente, se sometió a sonificación por 30 min. Las muestras se calentaron a 80 ◦C por 10 min en baño maría. De esta suspensión, se realizaron diluciones en serie (10⁰ hasta 10⁻⁴) y se sembraron100 µL de la suspensión con tres repeticiones en placas Petri con medio de cultivo R2A (Difco) e incubó a 28 C por 24 h. A partir del crecimiento bacteriano, se seleccionaron y aislaron las cepas con las características morfológicas descritos para Bacillus por ^{Lu et al. (2018)}. La densidad de Bacillus spp. se determinó por el método de diluciones en serie y conteo en placa de colonias (^{Peng et al. 2009}). Con los datos del número de colonias se realizó el análisis de varianza y la comparación de medias por el método Tukey (α = 0.05), con el programa R versión 3.6.1. La densidad de Bacillus spp. se reportó en UFC g⁻¹ de raíz.

Antagonismo in vitro de bacterias pectinolíticas

Se evaluaron 109 aislados de Pseudomonas fluorescentes y 119 de Bacillus spp. contra cinco cepas bacterianas pectinolíticas identificadas por secuenciación del gen ribosomal 16S rRNA aisladas de diversos hospedantes en México, incluyendo agave mezcalero: D. chrysanthemi (A. cupreata y Aloe vera), Pectobacterium cacticida, P. carotovo-rum (Opuntia sp.) y P. brasiliense (Neoubuxbaumia tetetzo). Las bacterias de la rizósfera se sembraron en microplacas de 96 pocillos con 200 µL de caldo nutritivo y se incubaron por 48 h a 28◦C. El antagonismo se evaluó por cultivo dual in vitro en placas Petri cuadradas (120 x 120 mm) con medio de cultivo Waksman agar (^{Berg et al. 2006}). Las cepas pectinolíticas patógenas (n = 5) se inocularon por extensión sobre la superficie del medio de cultivo con 250 µL de una suspensión acuosa con 3 x 10⁸ UFC mL⁻¹; se establecieron tres repeticiones. Posteriormente, las bacterias de la rizósfera se inocularon con un inoculador multipunto (Boekel^®, microplate replicator 96 puntos). Las placas se incubaron a 28 ◦C realizando observaciones cada 24 h durante cuatro días y se seleccionaron las cepas bacterianas que mostraron antagonismo (halo de inhibición del crecimiento bacteriano) contra una o más especies de bacterias pectinolíticas evaluadas.

Índice de eficiencia de antagonismo

Las bacterias de la rizósfera que mostraron antagonismo se incubaron a 48 h de crecimiento a 28 ◦C; posteriormente se inocularon por punción de masa bacteriana en placas inoculadas con las cepas pectinolíticas bajo las mismas condiciones del ensayo anterior. Las placas se incubaron a 28 ◦C realizando observaciones cada 24 h durante 96 h. El grado de antagonismo in vitro se determinó por el diámetro (mm) de los halos de inhibición del crecimiento de las bacterias pectinolíticas alrededor del punto de inoculación para cada cepa antagonista. El ensayo se repitió tres veces. El índice de eficiencia antagonista (IEA) se determinó con el método propuesto por ^{El-Yazeid et al. (2007)}, que consiste en dividir el área del halo producido por el antagonista entre el área del crecimiento de la colonia: IEA= A´rea del halo A´rea de la colonia los datos de los halos de inhibición (mm) se realizó el análisis de varianza y la comparación de medias por el método Tukey (α = 0.05), con el programa R versión 3.6.1.

Identificación molecular de las cepas antagonistas

El ADN genómico de las 25 cepas con el mayor IEA se obtuvo con el kit comercial Qiagen®. La concentración y calidad del ADN se verificó con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA). La amplificación del gen 16S rRNA se realizó con las condiciones de PCR y el protocolo descrito por ^{Weisburg et al. (1991)} con los iniciadores 8F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) y 1942R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ en un termociclador (C1000 Touch TM Thermal Cycler). Las bandas de los amplificados se verificaron por electroforesis en gel de agarosa (1.5%) teñido con bromuro de etidio (500 ng mL⁻¹). Los fragmentos amplificados de un peso molecular de 1500 pb se secuenciaron en Macrogen Inc. (Korea). Las secuencias se compararon en el banco de genes (Gen Bank) del Centro Internacional para la Información en Biotecnología (NCBI), empleando el algoritmo Blastx (^{Altschul et al. 1990}) del NCBI.

Detección de genes para la biosíntesis de lipopéptidos antimicrobianos

La amplificación de los genes fenD (fengicina), ituC (iturina), srfAA (surfactina) y bmy (bacilomicina) para Bacillus spp.; prnD (pirrolnitrina), y phlD (2,4- diacetilfloroglucinol) para Pseudomonas fluorescentes se realizó con los iniciadores descritos en la Tabla 2.

La reacción de PCR para los genes fenD, ituC, srfAA y bmy se realizó en un volumen total de 25 µL, con 12.5 µL de Gotaq Green Master® (2X), 9.5 µL de agua libre de nucleasas, 0.5 µL de cada iniciador (25 pmol) y 2 µL de ADN. El programa de ciclos térmicos empleado fue de una desnaturalización inicial de 95 ◦C por 4 min, seguido de 40 ciclos a 94 ◦C por 1 min, temperatura de anillamiento de 58 ◦C por 1 min, extensión de 70 ◦C por 1 min y una extensión final de 70 ◦C por 5 min. En el caso del gen bmy la temperatura de anillamiento fue de 55 ◦C durante 1 min. Para el caso de los genes prnD y phlD para Pseudomonas, la reacción de PCR se realizó en un volumen total de 25 µL, con 12.5 µL de Gotaq Green Master®, 9.5 (2X) µL de agua libre de nucleasas, 0.5 µL de cada iniciador (20 pmol - prnD y 25 pmol - phlD) y 2 µL de ADN. El programa de ciclos térmicos empleado para el gen prnD fue de una desnaturalización inicial de 95 ◦C por 1 min, seguido de 30 ciclos a 95 °C por 2 min, temperatura de anillamiento de 68 ◦C por 1 min y extensión de 72 ◦C por 1 min con extensión final de 72 ◦C por 5 min. Para el caso del gen phlD una desnaturalización inicial de 95 ◦C por 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 ◦C por 1 min, temperatura de anillamiento de 60 ◦C por 1 min con extensión de 72 ◦C por 1 min y extensión final de 72 ◦C por 5 min.

Aislamiento y densidad de Bacillus spp. y Pseudomonas fluorescentes

De las 10 muestras de rizósfera se obtuvieron 119 aislados de Bacillus y 109 de Pseudomonas fluorescentes. Los resultados muestran que, en la rizósfera de agaves silvestres, las poblaciones de Pseudomonas fluorescentes fueron más abundantes que las de Bacilllus spp. La mayor densidad de Pseudomonas fluorescentes se detectó en la rizósfera de A. angustifolia (muestra 1-AgM, Sta. Catarina Minas) con 2.8X10⁷ UFC g⁻¹ de raíz y la menor en A. potatorum (9-AgM, Sola de Vega) con 2.2 X10⁶ UFC g⁻¹ de raíz. Así mismo, las poblaciones de Bacillus spp. fueron más abundantes en la rizósfera de A. potatorum (9-AgM, Sola de Vega) con 9.5 X10⁵ UFC g⁻¹ de raíz y la menor en A. angustifolia (muestra 5-AgM, Sta. Catarina Minas) con 2.4X105 UFC g⁻¹ de raíz (Figura 1).

Figura 1 Densidad de Pseudomonas fluorescentes y Bacillus spp. en la rizósfera de agaves silvestres 

Antagonismo in vitro

De 119 aislados de Pseudomonas fluorescentes y 109 de Bacillus spp. contra cinco cepas bacterianas pectinolíticas, el antagonismo in vitro seleccionó 11 cepas de Bacillus spp. y 14 de Pseudomonas fluorescentes antagonistas contra una o más cepas bacterianas pectinolítcas evaluadas. Los resultados del análisis estadístico del IEA in vitro (Tukey, α = 0.05) mostraron diferencias (P = 0.0883) para ambas poblaciones contra bacterias pectinolíticas aisladas de diferente hospedantes. El mayor grado de antagonismo se observó con las cepas A. thuringiensis (2B16), Pseudomonas sp. (F3), P. fluorescens (C2) a Dickeya chrysanthemi (Agave cupreata), B. subtilis (9B14) y P. fluorescens (G3) a D. chrysanthemi (A. vera); B. subtilis (9B14) y Pseu- domonas sp. (B10) a P. brasiliense (Neubuxbaumia tetezo); B. cereus (1B1) y Pseudomonas marginalis (A4) a P. cacticida (Opuntia sp.); B. thuringiensis (2B16) y P. fluorescens (G3) a P. carotovorum (Opuntia sp). Entre estos antagonistas, 55% fueron especies de Pseudomonas fluorescentes y 45% de Bacillus (Tabla 3).

Identificación molecular de bacterias antagonistas

Por PCR se amplificaron fragmentos de aproximadamente 1 500 pb. La comparación de las secuencias de la región 16S rRNA de las cepas antagonistas (n = 25) aisladas de la rizósfera de agaves silvestres identificaron a 11 (44%) cepas en el género Bacillus y 14 (56%) en Pseudomonas con un porcentaje de similitud entre el 97 y 100% (Tabla 4).

La secuenciación del gen 16S rRNA mostró que la especie más abundante fue P. fluorescens (20%) y Pseudomonas sp. (20%), seguidas de Bacillus sp. (12%), B. subtilis (8%), B. cereus (8%), B. amyloliquefaciens (8%) y 4% de las especies B. wedmanii, B. thuringiensis, P. marginalis, P. poae, P. veronii y P. aeruginosa.

Detección de genes relacionados a la biosíntesis de lipopéptidos antimicrobianos

La presencia de genes para la biosíntesis de lipopéptidos antimicrobianos (AMPs) en las cepas de Bacillus y Pseudomonas spp. antagonistas se evidenciaron por la amplificación de fragmentos óptimos para los diferentes genes evaluados (Figura 2 y Tabla 2). Entre las cepas de Bacillus spp., al menos un gen AMPs se detectó en la mayoría de las cepas. La mayoría albergó entre dos a cuatro genes; en la cepa B. subtilis (9B14) se detectaron los cuatro genes evaluados. Entre las cepas de Bacillus spp. antagonistas la frecuencia de genes fue ItuC (63.63%), srfAA (54.54%), FenD (45.45%) y bmy (18.18%). Así mismo, entre las Pseudomonas spp. se detectó al menos un gen en la mayoría de las cepas; las cepas P. fluorescens (G3, D4 y H6) albergaron ambos genes evaluados. Entre las especies de Pseudomonas antagonistas la frecuencia de genes fue phlD (50%) y PrnD (42.85%) (Tabla 5).

Figura 2 Amplificación de productos de PCR. MM: Marcador de peso molecular 1 kb plus Invitrogen. A) Gen FenD (269 pb). Carrilles 1-14 ADN de Bacillus spp.; 15: blanco con H2O. B) Gen ItuC (423 pb). Carriles 1-14 ADN de Bacillus spp.; 15: blanco con H2O. C) Gen srfAA (370 pb). Carrilles 1-14 ADN de Bacillus spp.; 15: blanco con H2O. D) Gen bmy (370 pb). Carrilles 1-14 ADN de Bacillus spp.; 15: blanco con H2O. Pseudomonas spp.: E) Gen PrnD (786 pb). Carrilles 1-14 ADN de Pseudomonas spp.; 15: blanco con H2O. F) Gen phlD (423 pb). Carriles 1-14 ADN de Pseudomonas spp.; 15: blanco con H2O 

Aislamiento y densidad de Bacillus spp. y Pseudomonas fluorescentes

Especies de Pseudomonas fluorescentes y Bacillus antagonistas de bacterias pectinolítcas fitopatógenas se aislaron de la rizósfera de cinco especies de agaves mezcaleros silvestres en dos municipios del Estado de Oaxaca. La densidad de las poblaciones de Pseudomonas fluorescentes fue mayor que las de Bacillus spp. La mayor densidad de Pseudomonas fluorescentes y Bacillus spp. se observó en A. angustifolia (1-AgM) y A. potatorum (9-AgM), respectivamente. Al respecto, se sabe que la densidad de poblaciones bacterianas en la rizósfera son una subpoblación de la comunidad bacteriana del suelo, que influye en la selección de taxones bacterianos específicos por distintas especies de plantas por medio de los diferentes compuestos de los exudados radicales (^{Huang et al. 2014}, ^{Zhu et al. 2022}). Así mismo, ^{Larsen et al. (2015)} y ^{Bhattacharyya et al. (2022)} atribuyeron que la densidad bacteriana en la rizósfera tiene relación importante con los procesos de mineralización del suelo, principalmente con nitrógeno, fósforo y carbono. La mayor densidad de poblaciones de Pseudomonas fluorescentes en la rizósfera se ha demostrado en otras investigaciones con otras especies de plantas (^{Chiniquy et al. 2021}). Otros estudios reportan que la especie de planta y la localización geográfica también influyen en las poblaciones bacterianas (Lugtenberg y Kamilova 2009, ^{Mendes et al. 2014}, ^{Zarraonaindia et al. 2015}). Además de que se sabe que en especies silvestres y cultivados del género Agave, la composición de las comunidades procarióticas estuvo influenciado principalmente por el exudado de la raíz y especie de agave (^{Desgarennes et al. 2014}, ^{Coleman et al. 2016}), lo cual sugiere que los factores mencionados anteriormente podrían estar influyendo en la densidad de Pseudomonas y Bacillus spp. encontradas en las especies de agave evaluadas. La especie B. amyloliquefaciens se aisló solo de la rizósfera de A. americana var. oaxacensis (Tabla 5), lo cual puede evidenciar una relación estrecha con esta especie de agave.

Antagonismo in vitro e identificación molecular de bacterias antagonistas

Pseudomonas fluorescens y B. subtilis son las especies antagonistas de Pectobacterium y Dickeya más abundantes aislados de la rizósfera de distintas especies de agave mezcalero (Tabla 5). El antagonismo eficiente de B. subtilis y P. fluorescens contra especies de Pectobacterium y Dickeya se ha demostrado en otras investigaciones con otras especies de plantas (^{Gerayeli et al. 2018}, ^{Salem et al. 2018}).

La eficiencia del antagonismo y biocontrol de fitopatógenos entre especies de Bacillus y Pseudomonas se ha asociado a la presencia de genes para la biosíntesis de lipopéptidos antimicrobianos (AMPs) (^{Stein et al. 2005}, ^{Dimopoulou et al. 2021}, Dimki´c et al. 2022); la identificación de estos genes en microorganismos antagonistas puede ser una herramienta importante para la óptima selección de agentes de biocontrol de patógenos en plantas (^{Mora et al. 2011}).

Detección de genes relacionados a la biosíntesis de lipopéptidos antimicrobianos

Los resultados mostraron diferencias en la distribución, frecuencia y número de genes para la biosíntesis de AMPs entre las cepas antagonistas aisladas de la rizósfera, incluso entre una misma muestra. Este mismo resultado fue reportado por ^{Kiesewalter et al. (2021}), quienes encontraron que las cepas de B. subtilis aisladas de una misma muestra de suelo fueron diferentes en la frecuencia y número de genes para la biosíntesis de AMPs. Los resultados muestran que en la mayoría de las cepas antagonistas de Bacillus y Pseudomonas spp. se detectó al menos uno de los genes estudiados; entre las cepas de Bacillus spp. los genes de mayor frecuencia fueron ItuC y srfAA por lo que estos resultados coinciden con los reportados por ^{Athukorala et al. (2009)} quienes encontraron que los genes para la biosíntesis de surfactina e iturina fueron de mayor prevalencia entre cepas de Bacillus spp. En diversas especies de Bacillus, la eficiencia del biocontrol de fitopatógenos se ha relacionado con la presencia de algunos de los genes bmyB, fenD, ituC, srfAA para la biosíntesis de AMPs (^{Zhao et al. 2018}, ^{Cossus et al. 2021}, ^{Hu et al. 2021}, ^{Shahid et al. 2021}). En la cepa B. subtilis (9B14) aislada de A. potatorum en el Municipio de Sola de Vega, se detectaron los cuatro genes evaluados para la biosíntesis de AMPs. Este resultado es relevante ya que la producción simultánea de AMPs es importante para la eficiencia del biocontrol de enfermedades y resalta el amplio rango de la actividad antagonista en Bacillus spp. (^{Stein et al. 2005}, ^{Dimkic´ et al. 2022}). Aunque la identificación de cepas bacterianas que albergan un alto número de genes para la biosíntesis de AMPs son poco común (^{Mora et al. 2011}).

Entre las cepas antagonistas de Pseudomonas spp., se detectó el gen phlD en la mayoría de ellas. Mientras que las cepas de P. fluorescens (G3, D4 y H6) albergaron los genes phlD y prnD lo que podría indicar un mayor potencial de antagonismo. Al respecto, se sabe que los AMPs 2,4- diacetilfluoruglucinol y pirrolnitrina cumplen una importante función en el biocontrol y en la interacción planta-microorganismo (^{Landa et al. 2006}, ^{Dimkic´ et al. 2022}, ^{Zhang et al. 2021}). Las cepas Bacillus subtilis (9B14) y Pseudomonas fluorescens (G3, D4 y H6) albergan todos los genes para la biosíntiesis de AMPs estudiados. Por lo anterior, estas cepas son un recurso biológico valioso que merecen ser estudiados con mayor profundidad como potenciales agentes de biocontrol contra patógenos bacterianos causantes de pudriciones blandas en agaves u otras aplicaciones biotecnológicas, ya que cepas bacterianas que albergan un mayor número de genes para la biosíntesis de AMPs son más efectivos como agentes de biocontrol contra fitopatógenos (^{Joshi et al. 2006}, ^{Cossus et al. 2021}, ^{Hu et al. 2021}, ^{Shahid et al. 2021}).