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Introducción
El género Piper comprende cerca de 1 500 especies distribuidas en las zonas tropicales, siendo más abundantes en bosques húmedos premontanos y tierras bajas, de éstas, 136 se encuentran en México y 89 en Veracruz (Jaramillo et al. 2008, Villaseñor 2016). Las especies a este género representan un recurso biotecnológico importante en la búsqueda de compuestos bioactivos. Al respecto, se ha reportado que poseen actividad bactericida, insecticida, antiprotozoaria, fungicida, antihelmíntica y nematicida, atribuibles a sus más de 700 compuestos fitoquímicos identificados (Scott et al. 2008, Carmona-Hernández et al. 2016).
Los nemátodos fitopatógenos cusan daño anualmente en aproximadamente un 7% de la producción agrícola mundial, lo cual equivale a 48 991.04 toneladas y en un estimado de 215 769.92 millones de dólares (Abd-Elgawad y Askary 2015). Algunos fitonemátodos responsables de los daños pertenecen a los géneros Melodoigyne y Globodera (Pehlivan et al. 2020), y son causantes de malformaciones en plantas de la familia Solanaceae, así como marchitamiento en algunas hortalizas y plantaciones de café (Del-Prado-Vera et al. 2018). Aunado a esto, muchas especies de estos géneros han mostrado resistencia o tolerancia a los nematicidas sintéticos (Roeber et al. 2013, Wram y Zasada 2020). Como alternativa al uso y aplicación de estos compuestos, se ha sugerido el uso de extractos naturales de plantas, en particular de las especies de Piper que se han evaluado como plaguicidas alternativos por su capacidad toxicológica. Por lo que el objetivo del presente trabajo fue determinar el perfil fitoquímico y efecto nematicida de los extractos foliares de cuatro especies de Piper contra Caenorhabditis elegans, nemátodo ampliamente utilizado como modelo en bioensayos de actividad biológica por su amplia capacidad de resistencia toxicológica frente a extractos naturales y su estrecha relación filogenética con nemátodos fitopatógenos (Wang et al. 2012).
Materiales y métodos
Colecta e identificación de especímenes de Piper
Las especies utilizadas fueron: Piper amalago L., Piper aduncum L., Piper marginatum Jacq., y Piper umbellatum L., las cuales se colectaron en los municipios de Coatepec (19.436502, -96.955859) y San Andrés Tlalnelhuayocan (19.516908, -96976465), en el estado de Veracruz, México. La identificación se realizó en el Herbario XAL del Instituto de Ecología, y con la base de acceso abierto de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Intermountain Regional Herbarium Networky Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem (Carmona-Hernández et al. 2014).
Preparación de extractos
Aproximadamente 1.5 kg de hojas de cada especie se secaron a 50 ± 5 °C en una estufa, para posteriormente obtener un polvo fino (Soberon et al. 2006). A partir de este, se realizaron extracciones a reflujo continuo con etanol (EtOH), metanol (MetOH) y etanol-agua 50:50 (EtOH:H2O), en un equipo Soxhlet por 10 h continuas. Los extractos obtenidos se concentraron a presión reducida en un rotavapor a 50 °C y se estimó el rendimiento bruto (Moreno et al. 2000, Wiratno et al. 2009, Agyare et al. 2014).
Cultivo de Caenorhabditis elegans
La cepa N2 de C. elegans fue obtenida del laboratorio Evolution of Metabolic Diversity (LANGE-BIO) y se cultivó a temperatura promedio de 22 ± 2 °C, en cajas Petri con nematode medium growth (NMG) (17 g de agar bacteriológico, 2.5 g de peptona, 3 g de NaCl, 1 mL de CaCl2 1 M, 1 mL de MgSO4 1 M, 25 mL de KH2PO4 1 mL de solución de colesterol de 5 mg mL-1 en EtOH) e inoculadas previamente con Escherichia coli cepa OP50, la cual sirvió de alimento para los nemátodos ( Katiki et al. 2011, Sant’anna et al. 2013).
Bioensayos de toxicidad
Se usaron nemátodos en instar larvar L4, para ello se sincronizaron por el método de blancamiento alcalino, los gusanos se extrajeron de las cajas Petri con NMG y con solución Buffer M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 0.25 g MgSO4 7H2O en un litro de agua) (Porta de la Riva et al. 2012, Agyare et al. 2014, Ow y Hall 2015).
Se realizaron los ensayos en microplacas de 96 pozos, en cada microcelda se depositaron 10 larvas L4, con diferentes concentraciones de los extractos aleatorizados más un control (Buffer M9). El diseño experimental consistió en cinco concentraciones equidistantes del extracto de cada especie disuelto en Buffer M9, con cinco repeticiones, cada una de ellas correspondía a una placa. La exposición fue por 24 h a temperatura 22 ± 2 °C, transcurrido el tiempo se contabilizó el número de organismos sobrevivientes, mediante la inspección visual con ayuda de un microscopio estereoscópico (Roh y Choi 2007, Katiki et al. 2011, Agyare et al. 2014).
Análisis estadístico
El diseño experimental utilizado fue completamente al azar para cada extracto y se compararon entre las diferentes concentraciones, para determinar diferencias significativas y poder estimar una curva dosis-repuesta. Los resultados se expresaron en medias, graficadas en el programa Statistica 10. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, y para todos los casos se utilizó la prueba de Tukey para la comparación de medias. El cálculo de la CL50 se estimó mediante el modelo de regresión lineal Probit, donde la concentración de cada extracto fue la variable independiente y la mortalidad de las larvas en porcentaje, la variable dependiente (Finney 1987, Jensen et al. 2006), para lo cual se utilizó el programa estadístico BioStat V5.
Caracterización fitoquímica preliminar y perfiles por HTPLC
Los metabolitos secundarios se identificaron por pruebas fitoquímicas preliminares, para alcaloides, flavonoides, saponinas, cumarinas y triterpenos y esteroles, de acuerdo con una escala cualitativa (Domínguez 1979, Carmona-Hernández et al. 2014). Además, se realizaron perfiles químicos para alcaloides, terpenos, compuestos fenólicos, cumarinas y saponinas usando el equipo High Perfomance Thin Layer Chromatography (HTPLC) (CA-MAG Mutenz, Switzerland) (Lebot et al. 2014, Riffault et al. 2014). Las placas desarrolladas se digitalizaron con el software Wincats 1.4.3 y fueron tomadas con el equipo TLC Visualizar (CAMAG) a longitudes de onda de 360 y 260 nm, luz blanca visible superior e inferior. Con la ayuda del software Wincats 1.4.3 se estimaron los factores de retención (Rf) y se realizaron los perfiles gráficos mediante el modelado de bandas (Annegowda et al. 2013, Lebot et al. 2014, Upadhya et al. 2016).
Análisis por Cromatografía de Gases asociada a Espectrometría de Masas con ionización por Impacto Electrónico (CG-EIMS)
El análisis se realizó para los extractos de mayor actividad usando un equipo de GC-EIMS Agilent Technologies serie 7890A, acoplado a un detector selectivo de masas con ionización por impacto electrónico y separación por cuadrupolo de la marca Agilent Technologies serie 5979C. La separación de los compuestos se realizó en una columna DB1MS UI Agilent Technologies (60 m x 250 mm x 0.25 mm), se utilizó Helio de ultra alta pureza (99.9999) como gas acarreador a un flujo de 1 mL min-1; la temperatura de inyección fue de 250°C. La programación de la corrida fue: temperatura inicial 150 °C durante 3 min, 4 °C min-1 a 300 °C por 13 min. Los compuestos fueron identificados mediante la base de datos NIST 11 (National Institute Standard and Tecnology) (Robles-Zepeda et al. 2006).
Resultados
Actividad nematicida en C. elegans
En 11 de los 12 extractos evaluados se determinó actividad nematicida sobre C. elegans. Los extractos etanólicos fueron los de mayor actividad, seguidos de los hidroalcohólicos y los metanólicos. Los extractos etanólicos de las cuatro especies tuvieron mortalidades superiores al 90%. En los hidroalchólicos la actividad fue variada, mientras que para P. umbellatum la mortalidad fue del 100% a 3 mg mL-1, para P. amalago no superó el 40% de mortalidad. De los extractos metanólicos, el menos activo fue el de P. marginatum con 0% de mortalidad, en contraste el extracto de P. amalago presentó una mortalidad mayor a 90% seguido de P. umbellatum (Figura 1).
Figura 1 Mortalidad de Caenorhabditis elegans, después de 24 h de exposición a extractos de Piper spp. P < 0.05, a excepción del extracto metanólico de P. marginatum p > 0.05 EtOH-Etanol, MetOH-Metanol, EtOH:H2O: Hidroalcohólico al 70%.
La CL50 estimada para el extracto etanólico de P. aduncum fue de 0.650 mg mL-1, siendo la de mayor toxicidad con menor concentración. Seguida del extracto etanólico de P. marginatum con 0.836 mg mL-1, P. umbellatum con una CL50 de 1.389 mg mL-1 y finalmente P. amalago tuvo una CL50 de 2.962 mg mL-1 (Tabla 1). Los extractos hidroalcohólicos presentaron actividad biológica en rangos no superiores al 80%; el de P. marginatum tuvo una CL50 en 2.214 mg mL-1, seguida de P. umbellatum con 3.101 mg mL-1 y P. amalago con una CL50 de 10.907 mg mL-1. Para P. aduncum la concentración letal media estimada fue de 58.677 mg mL-1, siendo el menos activo sobre C. elegans. Los extractos metanólicos fueron los de menor actividad comparados con los etanólicos y los hidroalcohólicos, donde las CL50 para P. aduncum fue de 168.741 mg mL-1, P. umbellatum de 4.630 mg mL-1, P. amalago de 4.161 mg mL-1 y P. marginatum no tuvo actividad en C. elegans.
Tabla 1 Concentración letal media (CL50) de los extractos de las especies de Piper en C. elegans.
| Extracto | Concentración Letal Media (CL50) mg mL-1 | Error estándar | |
|---|---|---|---|
| EtOH | 0.650 | 0.375 | |
| P. aduncum | H2O+EtOH 50:50 | 58.677 | 10.782 |
| MetOH | 168.741 | 17.120 | |
| EtOH | 2.962 | 0.202 | |
| P. amalago | H2O+EtOH (50:50) | 10.979 | 1.584 |
| MetOH | 4.161 | 0.456 | |
| EtOH | 0.836 | 0.129 | |
| P. marginatum | H2O+EtOH (50:50) | 2.214 | 0.319 |
| MetOH | s/a | N/D | |
| EtOH | 1.389 | 0.165 | |
| P. umbellatum | H2O+EtOH (50:50) | 3.101 | 0.449 |
| MetOH | 4.630 | 1.545 |
s/a: sin actividad, N/D: no determinada. EtOH-Etanol, MetOH-Metanol, EtOH:H2O: Hidroalcohólico al 70%.
Análisis fitoquímicos y perfiles por HTPLC
Mediante las pruebas fitoquímicas preliminares se identificó la presencia de alcaloides y flavonoides en los 12 extractos, las cumarinas estuvieron ausentes en los extractos de P. umbellatum, los terpenos y esteroles no se detectaron en los extractos etanólicos, y las saponinas solo se identificaron en los extractos hidroalcohólicos (Tabla 2). Por HT-PLC se identificaron las las bandas correspondientes a Rf = 0.5 y 0.6 pertenecientes a alcaloides en los tres extractos de P. amalago. Los extractos de P. marginatum tuvieron presencia de alcaloides, con Rf similar en las bandas 0.5 y 0.6; y en Piper umbellatum fue la banda de Rf = 0.6 (Tabla 3).
Tabla 2 Análisis fitoquímico preliminar de las cuatro especies de Piper.
| Extracto | Compuesto | Alcaloides | Flavonoides | Saponinas | Cumarinas | Terpenos y/o esteroles | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Prueba Especie | M | D | W | A | C | S | E | SL | C | LB | |
| Etanólico | P. aduncum | + | ++ | ++ | + | + | + | - | n/d | + | - |
| P. marginatum | + | + | ++ | + | ++ | + | - | n/d | + | - | |
| P. amalago | ++ | +++ | +++ | +++ | ++ | + | - | n/d | + | - | |
| P. umbellatum | ++ | + | ++ | + | + | + | n/d | - | - | ||
| Hidroalcohólico | P. aduncum | +++ | +++ | + | ++ | +++ | +++ | + | n/d | + | + |
| P. marginatum | +++ | ++ | + | ++ | +++ | +++ | + | n/d | + | + | |
| P. amalago | +++ | +++ | ++ | +++ | ++ | +++ | + | n/d | + | + | |
| P. umbellatum | + | + | + | + | + | ++ | + | n/d | - | + | |
| Metanólico | P. aduncum | ++ | +++ | + | + | +++ | + | - | n/d | + | ++ |
| P. marginatum | ++ | +++ | + | ++ | ++ | + | - | n/d | + | ++ | |
| P. amalago | ++ | +++ | + | + | +++ | + | - | n/d | + | ++ | |
| P. umbellatum | + | + | + | + | + | + | - | n/d | - | ++ | |
Alcaloides: M = Prueba de Mayer, D = Prueba de Drangendorff y W = Prueba de Wagner. Flavonoides: A = Prueba del H2SO4, C = Prueba del FeCL2, S = Prueba de Shinoda. Saponinas: E = Prueba de la espuma, SL = Prueba de Lieberman. Cumarinas: C = Prueba de fluorescencia. Triterpenos y/o Esteroles: LB = Prueba de Lieberman-Bouchard. Intensidad: mayor +++, media++, baja +, nula - y n/d no determinada.
Tabla 3 Valores de Rf de los perfiles fitoquímicos de los extractos foliares de las cuatro especies de Piper por HPTLC.
| Extracto | Compuesto Fase móvil Revelador Especie | Alcaloides A D | Flavonoides F PN | Cumarinas C HS | Saponinas S AA | Terpenos T VS |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Etanólico | P. aduncum | 0.874 | 0.7,0.781, 0.886 | 0.057, 0.17, 0.182, 0.287, 0.329, 0.44, 0.512, 0.514 0.681,0.746,0.788,0.795, 0.863, 0.969 | 0.04, 0.079, 0.119, 0.148, 0.184, 0.223, 0.268, 0.302, 0.707, 0.747, 0.93 | |
| P. marginatum | 0.572, 0.649 | 0.541,0.813 | 0.656, 0.901 | 0.262, 0.37, 0.558, 0.614, 0.805, 0.951 | 0.025,0.096,0.106,0.179, 0.241,0.267, 0.292, 0.429, 0.485, 0.559, 0.697, 0.774 | |
| P. amalago | 0.52, 0.588, 0.646, 0.786 | 0.752 | 0.648, 0.714, 0.768 | 0.170, 0.284, 0.239, 0.444, 0.478, 0.666 | 0.023, 0.099, 0.123 ,0.17, 0.197, 0.265, 0.487, 0.692 | |
| P. umbellatum | 0.588, 0.648 | 0.739 | 0.646, 0.719, 0.869 | 0.162, 0.390, 0.685, 0.694 | 0.018, 0.58, 0.104, 0.126, 0.179,0.234,0.250,0.284, 0.703, 0.883 | |
| Hidroalcohólico | P. aduncum | 0.885 | 0.793, 0.802, 0878 | 0.514,0.681,0.795,0.864, 0.961 | 0.084,0.111,0.262,0.299, 0.692 | |
| P. marginatum | 0.595, 0.648 | 0.693 | 0.487, 0.648, 0.759 | 0.116,0.167,0.649,0.805, 0.869, 0.954 | 0.094, 0.173, 0.212, 0.256 | |
| P. amalago | 0.593, 0.632, 0.744, 0.824 | 0.752, 0.876, 0.886 | 0.648, 0.722, 0.769, 0.837, 0.847, 0.898, 0.937 | 0.165,0.284,0.319,0.377, 0.44, 0.67, 0.791,0.979 | 0.019,0.097,0.123,0.180, 0.199, 0.258 0.267, 0.484, 0.561,0.700 | |
| P. umbellatum | 0.588, 0.642 | 0.646, 0.712, 0.761,0.863 | 0.397, 0.686, 0.786, 0.967 | 0.019,0.052,0.101,0.179, 0.14, 0.253, 0.273, 0.297 | ||
| Metanólico | P. aduncum | 0.864 | 0.769, 0.878 | 0.180, 0.284, 0.321,0.448, 0.519, 0.68, 0.802, 0.864, 0.973 | 0.132, 0.18, 0.234, 0.267, 0.695 | |
| P. marginatum | 0.638 | 0.898 | 0.661, 0.742, 0.797, 0.907 | 0.123,0.173,0,175,0.346, 0.626, 0.957 | 0.052,0.096,0.177,0.218, 0.712 | |
| P. amalago | 0.558, 0.637 | 0.747, 0.886 | 0.653, 0.727, 0.768 | 0.157,0.289,0.317,0.383, 0.411,0.485 | 0.019,0.075,0.114,0.117, 0.197, 0.256, 0.417, 0.482, 0.697 | |
| P. umbellatum | 0.597, 0.592, 0.646, 0.648 | 0.900 | 0.646, 0.761, 0.866 | 0.390, 0.688 | 0.023,0.060,0.104,0.179, 0.214, 0.272, 0.702 |
A: tolueno-cloroformo-etanol (28.5:57:41.5, v/v/v), F: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:26, v/v/v/v), C: acetato de etilo-tolueno (1:1 v/v) 10% ácido acético, S: cloroformo-ácido acético-metanol-agua (60:32:12:8 v/v/v/v), T: tolueno-acetato de etilo (93:7 v/v); D: Dragendorff, PNP: productos naturales polietilenglicol, HS: hidróxido de sodio 10% en etanol, AA; anisaldehído acético (115°C), VS: vainillina sulfúrica (115° C).
Los flavonoides estuvieron ausentes en el extracto hidroalcohólico de P. umbellatum, en cambio para metanol y etanol se encontró una sola banda cada una con Rf = 0.739 y 0.900, respectivamente. Los flavonoides en P. marginatum se presentaron en los tres extractos. En P. amalago, el extracto etanólico presentó el mayor número de bandas con Rf = 0.752, 0.876, 0.885. Finalmente, para los extractos de P. aduncum se determinó un Rf similar a 0.800.
Las cumarinas estuvieron presentes en todos los extractos, y el hidroalcohólico de P. amalago tuvo el mayor número de bandas con siete. Las saponinas fueron los compuestos de mayor abundancia después de los terpenos. El extracto etanólico de P. aduncum tuvo 14 bandas con Rf = 0.057, 0.17, 0.182, 0.287, 0.329, 0.44, 0.512, 0.514 0.681,0.746, 0.788, 0.795, 0.863, 0.969. Los terpenos estuvieron presentes en todas las muestras analizadas, estando mayormente representados en el extracto etanólico de P. marginatum con 12 bandas con Rf = 0.025, 0.096, 0.106, 0.179, 0.241, 0.267, 0.292, 0.429, 0.485, 0.559, 0.697, 0.774 (Tabla 3).
Análisis por GC-EIMS
En la caracterización química tentativa de los extractos etanólicos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-EIMS), se registró en su mayoría compuestos de origen terpénico y aceites esenciales, así como algunas cumarinas y compuestos fenólicos. Otros compuestos identificados tentativamente fueron cadaleno, δ cadineno, β copaeno, α-gurjuneno y calameneno para P. umbellatum (Tabla 4).
Tabla 4 Composición química del extracto etanólico de Piper marginatum determinado por GC-EIMS.
| Pico | Compuesto | Tiempo de Retención | Área (%) | Similitud |
|---|---|---|---|---|
| 11 | (Z) -Muurola-3,5-dieno | 24.892 | 0.34 | 94 |
| 13 | Ácido cinámico | 25.935 | 0.48 | 93 |
| 14 | α-Gurjuneno | 26.605 | 0.67 | 99 |
| 15 | Aloaromadendreno | 27.337 | 0.66 | 91 |
| 17 | Aromandendreno | 27.849 | 0.3 | 95 |
| 18 | α-Muurolene | 28.086 | 0.58 | 98 |
| 19 | β-Cubebeno | 28.288 | 0.25 | 95 |
| 21 | Biciclogermacreno | 28.678 | 2.8 | 93 |
| 23 | L-Calameneno | 29.068 | 0.81 | 90 |
| 24 | δ-Cadineno | 29.159 | 0.54 | 98 |
| 25 | α-Calacoreno | 29.549 | 0.27 | 96 |
| 30 | P-Celineno | 30.713 | 0.56 | 96 |
| 31 | Apiol | 30.963 | 6.9 | 90 |
| 34 | α-Cadinol | 32.128 | 0.74 | 93 |
| 35 | Cadaleno | 32.487 | 0.2 | 98 |
| 41 | Pineno | 36.157 | 0.93 | 93 |
| 44 | Ácido palmítico | 38.339 | 11.14 | 99 |
| 46 | Nerolidol | 39.643 | 0.41 | 91 |
| 48 | Ácido linoleico | 41.496 | 10.78 | 99 |
| 49 | α-Ácido linoleico | 41.569 | 6.85 | 99 |
| 50 | Ácido esteárico | 41.966 | 3.31 | 99 |
| 52 | Dipropil sulfito | 43.489 | 0.69 | 94 |
| 59 | Eicosano | 51.462 | 0.66 | 94 |
| 52 | α-Tocoferol | 52.266 | 0.85 | 94 |
| 65 | Campesterol | 57.13 | 0.83 | 91 |
Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.
En P. aduncum se identificaron germacreno D, ácido (Z)-cinámico, γ sitosterol, estigmasterol, ácido mirístico y humuleno (Tabla 5); en P. marginatum: cadaleno, α calacoreno, aromandendreno, ácido cinámico, cis-muurol-3,5-dieno (Tabla 6); y para P. amalago: piranona, coumarano, piperonal y 2-nonadecano (Tabla 7). Finalmente, para todos los extractos analizados se identificaron tentativamente ácido esteárico, ácido linoleico y ácido palmítico.
Tabla 5 Composición química del extracto etanólico de Piper umbellatum determinado por GC-EIMS.
| Pico | Compuesto | Tiempo de Retención | Área (%) | Similitud |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Pyranono | 18.078 | 1.98 | 90 |
| 8 | α-Gurjuneno | 26.709 | 0.82 | 99 |
| 9 | Aromandendreno | 27.452 | 0.71 | 93 |
| 11 | β-Cadineno | 28.202 | 0.65 | 95 |
| 13 | 2,5-dimetil-3-metilen-hepta-1,5-dieno | 28.787 | 3.06 | 90 |
| 14 | β-Copaeno | 29.122 | 0.51 | 92 |
| 15 | Calameneno | 29.183 | 0.81 | 90 |
| 16 | δ-Cadineno | 29.275 | 0.6 | 93 |
| 22 | α-Selineno | 31.305 | 1.24 | 95 |
| 23 | 2-isopropil-5-metil-9-metilen-biciclo-1-deceno (4.4.0) | 31.951 | 0.45 | 90 |
| 24 | α-Cadinol | 32.255 | 0.85 | 98 |
| 25 | Cadaleno | 32.609 | 0.2 | 96 |
| 31 | Ácido palmítico | 38.485 | 12.2 | 99 |
| 32 | Ácido palmítico, éster metil | 39.064 | 0.29 | 96 |
| 34 | Fitol | 41.478 | 10.39 | 98 |
| 35 | Ácido linoleico | 41.654 | 11.57 | 99 |
| 36 | α-Ácido linoleico | 41.734 | 7.71 | 99 |
| 37 | Ácido esteárico | 42.160 | 3.17 | 99 |
Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.
Tabla 6 Composición química del extracto etanólico de Piper amalago determinado por GC-EIMS.
| Pico | Compuesto | Tiempo de Retención | Área (%) | Similitud |
|---|---|---|---|---|
| 7 | Pirano | 18.066 | 1.38 | 93 |
| 8 | Coumaran | 20.278 | 1.21 | 93 |
| 9 | Piperonal | 23.417 | 0.47 | 91 |
| 21 | Ácido palmítico | 38.381 | 2.74 | 99 |
| 22 | Ácido palmítico, éster metil | 39.058 | 0.23 | 90 |
| 27 | Fitol | 41.502 | 18.77 | 96 |
| 28 | Ácido linoleico | 41.661 | 5.14 | 99 |
| 31 | α-Ácido linoleico | 42.191 | 0.39 | 95 |
Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.
Tabla 7 Composición química del extracto etanólico de Piper aduncum determinado por GC-EIMS.
| Pico | Compuesto | Tiempo de Retención | Área (%) | Similitud |
|---|---|---|---|---|
| 6 | Piperotona | 21.583 | 0.56 | 96 |
| 9 | Germacreno D | 25.776 | 0.06 | 90 |
| 10 | (Z)-ácido cinámico | 26.050 | 0.13 | 95 |
| 11 | Cariofileno | 26.934 | 0.2 | 94 |
| 12 | Humuleno | 27.775 | 0.21 | 91 |
| 18 | δ-adineno | 29.275 | 0.19 | 95 |
| 40 | Ácido mirístico | 34.236 | 0.08 | 98 |
| 52 | Ácido palmítico | 38.503 | 3.07 | 99 |
| 53 | Ácido palmítico, éster metil | 39.064 | 0.08 | 95 |
| 55 | Fitol | 41.514 | 3.14 | 99 |
| 57 | Ácido linoleico | 41.788 | 1.53 | 98 |
| 58 | α-Ácido linoleico | 42.130 | 0.21 | 94 |
| 59 | Ácido esteárico | 42.192 | 0.78 | 99 |
| 69 | Estigmasterol | 47.433 | 0.03 | 95 |
| 73 | γ-Sitosterol | 51.151 | 0.43 | 91 |
Similitud: es el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.
Discusión
La mayoría de los extractos de las especies de Piper mostraron actividad nematicida contra C. elegans a bajas concentraciones, lo que coincide con lo reportado para otras especies del mismo género (Atjanasuppat et al. 2009). Los extractos etanólicos de las cuatro especies mostraron ser más activos que lo reportado para extractos de P. nigrum y P. betle en Schistosoma mansoni y Meloidogyne incógnita (Atjanasuppat et al. 2009, Wiratno et al. 2009, Dammini-Premachandra et al. 2014). El extracto etanólico de P. aduncum fue el de mayor actividad contra C. elegans con una CL50 estimada en 0.650 mg mL-1, similar a la reportada contra Haemonchus contortus y Melodoigyne incognita, además de tener efecto supresor en la formación de nódulos de plántulas de tomate infestadas con Melodoigyne sp. (Singh y Khuma 2006, Oliveira et al. 2014).
En contraste, se evidenció que el extracto metanólico de P. marginatum no presentó actividad en dosis de 500 mg mL-1, lo que coincide con lo reportado de que el extracto acuoso de esta especie no es efectivo contra Melodoigyne incógnita (Vinueza et al. 2006).
Los extractos etanólicos en este estudio presentaron efecto biocida mayor que el indicado en otros estudios, en los cuales los plaguicidas sintéticos como el clorpirifo, carbosulfan y deltramina, tuvieron CL50 estimadas en 19.4, 25.3 y 40 mg mL-1, respectivamente (Wiratno et al. 2009, Sant’anna et al. 2013). Esta función se puede atribuir a los diferentes compuestos secundarios presentes en los extractos, como terpenos y/o esteroles, ácidos grasos, flavonoides, compuestos fenólicos y alcaloides-amidas, las cuales actúan a nivel de sistema nervioso central en insectos y nemátodos (Scott et al. 2008, Suzuki y Yamato 2018). Compuestos como el dilapiol son agentes clastogénicos cuyo isómero apiol se encontró presente en el extracto etanólico de P. maginatum, lo que puede explicar su efecto tóxico en C. elegans (Razzaghi-Abyaneh et al. 2007, Rafael et al. 2008). Además de taninos, saponinas, glucósidos cianogénicos y otros compuestos reportados en extractos crudos de Piper que pudieran ser causantes de este efecto (Ejele et al. 2012, Varsha y Sonali 2014, Kumary Babu 2014, Shailesh 2015).
Los perfiles fitoquímicos determinados por HPTLC muestran que existe una diversidad de metabolitos secundarios presentes. Se encontró similitud en los valores de Rf, con una banda de Rf = 0.8, reportada anteriormente para P. nigrum, la cual corresponde a un flavonoide; esto puede indicar que este compuesto es químicamente similar, es decir un homólogo o isómero del mismo (Valencia 1995). Las bandas de alcaloides o alcamidas fueron escasas, y se encontraron en los extractos de tres especies de las cuatro en estudio, el compuesto más común fue el correspondiente al Rf = 0.6, que puede corresponder de manera similar a lo reportado por Rajopadhye et al. (2011), para una alcamida presente en P. nigrum (pimenta negra), P. nigrum (pimienta blanca), P. longum, P. retrofractum, P. cubeba y P. betle.
Los compuestos mayoritarios en los extractos etanólicos fueron el ácido palmítico y el fitol, ya reportados también para P. umbellatum, P. betle, P. aduncum, P. auritum, P. decurrens y P. methysticum (Parmar et al. 1997, Lee et al. 2004, Hezekiah et al. 2015). El cadineno fue identificado en sus formas β y δ, el cual fue reportado para P. marginatum, P. amalago y P. aduncum (Ferraz et al. 2010, Sant’anna et al. 2015) en el caso de β cadineno se ha reportado para P. nigrum (Bagheri et al. 2014).
Los monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos identificados como α-gurjuneno, aromandendreno, aloaromadendreno, L-calameneno, cadaleno, pineno, β-cubebeno, germacreno D, piperotona, cariofileno, piperonal, α-cadinol, β-copaeno, α-selineno y pirano estuvieron presentes en los extractos etanólicos analizados. Estos ya se han reportado para las especies de P. aduncum, P. maginatum, P. amalago y P. umbellatum (Ferraz et al. 2010, Souto et al. 2012, Oliveira et al. 2014, Brazão et al. 2104, Hezekiah et al. 2015). Por lo anterior se recomienda hacer estudios biodirigidos sobre los compuestos que pudieran ejercer el efecto tóxico o determinar si existe una asociación sinérgica entre los compuestos presentes.
Conclusiones
Los extractos etanólicos estudiados tienen efecto nematicida sobre C. elegans a bajas concentraciones, e inclusive superior a lo reportado en la bibliografía para plaguicidas sintéticos comerciales. Los extractos de Piper amalago mostraron efecto tóxico sobre Caenorhabditis elegans por debajo de 10 mg mL-1. Para las cuatro especies de Piper, los extractos metanólicos fueron los de menor actividad, seguidos de los hidroalcohólicos. El extracto metanólico de P. marginatum no tuvo actividad nematicida en las concentraciones evaluadas. Se determinó la presencia de alcaloides, terpenos, esteroles, flavonoides, saponinas y cumarinas de acuerdo con las pruebas fitoquímicas preliminares y los perfiles fitoquímicos por HTPLC. Por medio de la GC-EIMS se confirmó que cuentan con una diversidad de compuestos en su mayoría de origen terpénico y fenólico, así como componentes de aceites esenciales.
