Material biológico e irradiación

Se utilizó semillas de café var. Oro Azteca, que se sometieron a diferentes dosis de radiación con rayos gamma de ⁶⁰Co, que constituyeron los tratamientos: T1 (0 Gy), T2 (10 Gy), T3 (50 Gy), T4 (100 Gy), T5 (200 Gy) y T6 (300 Gy), se utilizaron 345 semillas en cada tratamiento. Las dosis se determinaron mediante el sistema de dosimetría Gafchromic y una cámara de ionización RADCAL modelo Accudose. El irradiador fue un equipo panorámico Gamma Beam 127 MDS Nordion, con fuente de almacenamiento de 50 g de cobalto ⁶⁰Co en seco.

Establecimiento del experimento

El experimento se llevó a cabo en tres fases (abril de 2015 a noviembre de 2018) en las instalaciones del Campo Experimental Rosario Izapa del INIFAP ubicado en el Municipio de Tuxtla Chico, Chiapas, México (14^o 40’ LN y 92^o 10’ LO, y 435 msnm). La primera fase consistió en sembrar las semillas irradiadas en un almacigo para determinar el porcentaje de germinación, con un sustrato a base de suelo y arena con una proporción de 2:1, con textura franco arenosa, pH de 6.1 y 3.0% de materia orgánica. La segunda fase consistió en poner las plántulas emergidas en macetas de 2 kg de sustrato y la tercera fase fue establecer las plantas en un lugar definitivo en campo, a las cuales se les denominaron plantas M1, por ser la primera generación de plantas derivadas de semillas irradiadas.

Diseño experimental y variables registradas

Las plantas M1, se distribuyeron en un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones. Cada repetición consistió de 12 plantas las cuales se sembraron en marco real de 2 m x 1.5 m, se registraron 15 variables en diferentes fases de crecimiento. Porcentaje de germinación (PG) medida a los 45 días después de la siembra (DDS), porcentaje de sobrevivencia (PS), número de hojas (NH), medidas a los 90 DDS, altura de planta (AP), número de ramas por planta (NRPP), número de frutos por planta (NFPP) medidas a los 720 días DDS, peso de frutos por planta (PFP), peso de 100 frutos (P100F), peso de frutos vanos (PFV), porcentaje de frutos vanos (POFV), incidencia de enfermedades de roya anaranjada (Roya) (Hemileia vastatrix), antracnosis (Antra) (Colletotrichum sp), mancha por Cercospora (Cerc)(Cercóspora coffeicola), y ojo de gallo (OGa) (Mycena citricolor), medidas a los 1240 DDS. Para la evaluación de la incidencia de enfermedades, en cada una de las plantas dentro de cada tratamiento, se seleccionaron cuatro ramas en el segundo tercio altitudinal y de cada rama se contabilizó el número de hojas y número de hojas con presencia de sín tomas de las enfermedades de interés. La incidencia por planta se determinó con base al promedio de hojas totales y hojas enfermas en las cuatro ramas seleccionadas.

Análisis estadístico

La estimación de la DL₅₀ para germinación de semillas y sobrevivencia de plantas se realizó mediante los parámetros de modelos de regresión exponencial y cuadrática, mientras la GR₅₀ para altura de planta y número de hojas, se realizó con los parámetros de modelos de regresión cuadrática I y II. La selección del mejor modelo se llevó a cabo con base al mayor valor de coeficiente de determi nación simple o ajustada, diferencia no significativa en la prueba de falta de ajuste y el menor valor del criterio de información de Akaike (AIC) ^{Ramírez et al. (2006)}. La evaluación de los modelos, análisis de varianza, comparación de medias con la prueba de Dunnett y la comprobación de los supuestos de los modelos respectivos se llevaron a cabo con el paquete estadístico SAS versión v9 (^{SAS Institute 2002}). Por otra parte, las regiones de radiosensibilidad (estimulación, transición e inhibición) se determinaron de acuerdo con lo propuesto por ^{Ramírez et al. (2006)}. Las variables del componente de rendimiento y los valores de porcentaje de incidencia para cada una de las enfermedades evaluadas se analizaron mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias Tukey, 0.05.

Germinación y sobrevivencia

A los 45 DDS el porcentaje de germinación de semillas en T1 fue de 86.29%, mientras que, en los demás tratamientos con radiación, se presentó una tendencia a disminuir el porcentaje de germinación con el incremento de la dosis de radiación. T2 y T3 registraron el 61.44 y 54.15% de germinación respectivamente, que corresponden a disminuciones de 28.79 y 37.24%, respecto a T1. Las radiaciones altas como en T6 (300 Gy) inhabilitaron la germinación, ya que registró 99.33% de semillas que no germinaron. La DL50 para germinación fue de 60.4 Gy, mediante los parámetros de regresión exponencial negativa con un coeficiente de determinación de 0.95 (Figura 1a).

Figura 1: a) Regresión exponencial y b) Regresión cuadrática para la determinación de DL50 en porcentaje de germinación y sobrevivencia, respectivamente. 

Para sobrevivencia de plantas, en T1, T2, T3 y T4 no se observó mortalidad de plantas a los 90 DDS. Sin embargo, en T5 y T6 la sobrevivencia de plantas fue afectada drásticamente, ya que en T5 se registró una mortalidad del 50% del número inicial de plántulas emergidas, mientras que en T6, las plántulas no sobrevivieron. La DL⁵⁰ para sobrevivencia de plantas se estimó en 177.88 Gy, mediante los parámetros de regresión cuadrática I (Figura 1b).

Características morfológicas

En altura de planta a los 720 DDS, T1, T2, y T3, presentaron valores de 82.99, 87.08 y 86.59 cm, respectivamente, dichos valores no fueron estadísticamente diferentes (Figura 2A). Sin embargo, T4 registró un valor de 59.48 cm, resultado estadísticamente diferente (p ≤ 0.05) en lo que se refiere a los demás tratamientos, lo que se infiere que la radiación gamma de ⁶⁰Co en semillas de café var. Oro Azteca afecta de forma significativa la altura de planta a partir de los 100 Gy.

Para el número de ramas por planta a los 720 DDS en T1, T2 y T3 fueron en un rango de 14 a 16, valores que no fueron estadísticamente diferentes (Figura 2B). Sin embargo, en T4, disminuyo de forma significativa a ocho ramas por planta. En relación con el número de hojas en T1 se registró un promedio de 190 hojas por planta. T2 y T3 no fueron estadísticamente diferentes con relación a T1. Sin embargo, en T2, se registró el mayor número de hojas por planta (225 hojas). De igual forma que en número de ramas, T4 resultó estadísticamente diferente comparado con T1 (111 hojas por planta) (Figura 2C).

Figura 2: Efecto de la radiación gamma de ⁶⁰Co en altura de planta (A), número de ramas (B) y número de hojas (C) en plantas M1 de café var. Oro Azteca.Medias con letras iguales son estadísticamente iguales entre sí (Tukey, 0.05). 

En lo que se refiere a GR₅₀ para altura de planta y número de ramas (Tabla 1) se encontró en 120.12 Gy y 107.78 Gy, respectivamente, debido a que ambas variables presentaron en el modelo de regresión lineal cuadrático II, el mayor coeficiente de determinación ajustada y menor valor de IAC. No fue posible determinar la GR₅₀ para número de hojas por presentar coeficientes de determinación ajustada de 0.42 y 0.28 para los modelos de regresión cuadrática I y II respectivamente. El intervalo de transición estuvo entre 10 y 100 Gy (Tabla 2). La región de inhibición para la germinación se estimó que es a partir de dosis superiores a 50 Gy, mientras que, para la sobrevivencia, altura de planta y número de ramas por planta fue de 100 Gy.

Efecto de la radiación gamma de ⁶⁰Co en componentes de rendimiento e incidencia de enfermedades

El comportamiento de los componentes del rendimiento a los 1240 DDS, fue variable dependiendo de la dosis de radiación. Pero en todas se observó diferencias significativas. Los resultados para PFP y P100F en T1 se obtuvo el valor más alto (856 y 119.9, respectivamente) y el más bajo en T4 (110.2 y 18.5, respectivamente); mientras que para PFV y POFV el valor más alto fue para T3 (128.2 y 18.4, respectivamente) y en el más bajo para T4 (23.2 y 6.1, respectivamente) (Tabla 3).

Con respecto al porcentaje de incidencia de enfermedades a los 1240 DDS, se encontró que la antracnosis y roya anaranjada fueron las principales enfermedades distribuidas en toda la parcela con una incidencia del 12.24 y 6.12%, (Tabla 3), respectivamente. Sin embargo, el comportamiento de las cuatro enfermedades fue estadísticamente igual, solo para antracnosis presentó la menor incidencia con T3 (50 Gy).

Los rayos gama de ⁶⁰Co tuvieron efectos significativos en las variables del componente de rendimiento (Tabla 4), para la variable NRPP el valor máximo de los tratamientos irradiados estuvo por arriba de T1. Pero en el T3 fue mayor el porcentaje de plantas (54%) que presentaron valores máximos por arriba de T1. La variable NFPP se observó que T1 presentó un valor máximo de frutos por planta, y los tratamientos T2 y T3 presentaron los valores más altos de PFP y T3 y T4 el valor más alto de P100F. En la variable PFV fueron T2 y T3 los que presentaron valores más altos, pero solamente el T4 presentó menor valor de PFV y menor porcentaje de frutos vanos.

Germinación y sobrevivencia

El efecto de la radiación gamma de ⁶⁰Co en la germinación de semillas y sobrevivencia en plántulas de café varió según la dosis de radiación, ya que se encontró una tendencia a disminuir de manera significativa estos parámetros al aumentar la dosis, debido a que 300 Gy inhabilitó la germinación de semillas y se registró el 100% de mortalidad de plántulas por lo que se infiere que para café, 300 Gy se puede considerar dosis altas con efectos negativos en estas variables, siendo 60.4 Gy la dosis recomendada para obtener una germinación y sobrevivencia de plántulas por arriba del 50%, lo que permite seguir con el proceso de selección en plantas sobrevivientes. Estos resultados coinciden con lo reportado por diversos autores en otras especies que se han irradiado con ⁶⁰Co, por ejemplo, ^{Salomon et al. (2017)} mencionan que la dosis recomendada de radiación con gammas de ⁶⁰Co para inducir mutaciones en semillas de papa es de 20 a 40 Gy, presentando dosis mayores reduce drásticamente la emergencia de plantas. Mientras que ^{Díaz-López et al. (2016)} reportan una DL₅₀ para germinación en Jamaica (Hibiscus sabdariffa) con dosis de radiación gamma de 500 a1000 Gy. En tanto que, ^{Álvarez-Holguín et al. (2018)} encontraron al irradiar semillas de pasto africano una DL₅₀ a 2076 Gy y la GR₅₀ fluctuó entre 1357 y 1900 Gy por lo que recomiendan para el mejoramiento genético de esta especie irradiar a 1533 Gy para ambos parámetros. Al respecto, ^{Dada et al. (2018)} reportaron que la DL₅₀ en tres variedades de café (Mundo Novo, Kents y Geisha) fue en el rango de 12 Gy, al utilizar desde 0 hasta 25 Gy para inducir mutaciones en estacas enraizadas. Mientras que ^{Lamo et al. (2017)} mencionan los logros que se han tenido en varios frutales de interés comercial mediante la inducción de mutaciones genéticas con rayos gamma. Por otra parte, ^{Martirena et al. (2019)} en un trabajo donde irradiaron callos y nudo cotiledonal y semillas de frijol, encontraron que el mejor tratamiento fue la radiación de semillas a 100 Gy. En algunos otros casos la radiación gamma de ⁶⁰Co, no afecta los procesos de germinación en semillas como en uchuva (Physalis peruviana L.) donde la radiación no afecto su germinación, pero favoreció la emergencia (^{Antúnez-Ocampo et al. 2017}). En chile de agua (Capsicum annum),^{López-Mendoza et al. (2012)}, reportan que la radiación gamma no afecto la germinación a dosis de 20 a 120 Gy. Pero ^{Ramírez et al. (2006)} mencionan que la radiación puede ayudar en la germinación de diversas especies hortícolas y cereales cuando estas presentan latencia o cuando las condiciones ambientales limitan la germinación. En lo referente a los efectos fisiológicos de la radiación gamma de ⁶⁰Co se han reportado diversos efectos, al respecto ^{Lokesha et al. (1992)} y ^{Hameed et al. (2008)} reportan que la inhabilidad de la semilla para germinar a altas dosis de rayos gamma puede atribuirse a cambios histológicos y citológicos, disrupción y desorganización de la túnica de la semilla, interrupción de la mitosis celular en las zonas meristemáticas durante la germinación, síntesis de proteína, balance hormonal o intercambio de gas en la hoja. Mientras que ^{Kovács y Keresztes (2002)} mencionan que también se relaciona con la formación de radicales libres en las semillas irradiadas.

En relación a sobrevivencia, ^{Abdullah et al. (2009)} reportan en cúrcuma un promedio de sobrevivencia del 50% con 20 Gy y solo del 2% a 40 Gy. En tanto que ^{Antúnez-Ocampo et al. (2017)} encontraron que a dosis mayores de 275 Gy la supervivencia en Phisalys peruviana L. es afectada de manera drástica. Para vainilla (Vanilla planifolia G. Jackson), ^{Reyes-López et al. (2018)} encontraron al irradiar esquejes el mayor porcentaje de sobrevivencia se tuvo a dosis menores de 35 Gy. Mientras que ^{Minisi et al. (2013)} reportan que en Moluccella laevis L. obtuvieron el 100% de sobrevivencia con 20 Kr.

Características morfológicas

La radiación gamma de ⁶⁰Co afecto significativamente (p ≤ 0.05) la altura de planta y el número de ramas por planta con dosis de 100 Gy. Para número de hojas y ramas, aunque estadísticamente no fueron significativos T1, T2 y T3, numéricamente se observa mayor número de hojas y ramas a los 50 Gy (Figura 2), esto es importante, ya que, estas variables influyen en el rendimiento. La tendencia de disminuir la altura de planta al aumentar la dosis de radiación se ha reportado en Physalis peruviana (^{Antúnez- Ocampo et al. 2017}), cacahuate (^{Brito y Angeles 2016}), papa (^{Salomon et al. 2017}) y lenteja (^{Roy et al. 2019}). La reducción del tamaño de planta en el cafeto permitirá incrementar el número de plantas por unidad de superficie y con ello mayor eficiencia en el uso del suelo. En relación al número de hojas ^{Kara et al. (2016)}, reportan que el número de hojas en soya disminuye al irradiar con dosis de 0 a 500 Gy. Por otro lado, ^{Antúnez-Ocampo et al. (2017)} mencionan que no encontraron diferencias estadísticas significativas en número de hojas cuando se irradiaron con rayos gamma semillas de Physalis peruviana L.

Efecto de la radiación gamma de ⁶⁰Co en componentes de rendimiento e incidencia de enfermedades

La radiación no presentó diferencias estadísticas significativas (p ≤ 0.05) en la mayoría de las enfermedades consideradas en el presente estudio. Pero numéricamente se observa una disminución a partir de los 100 Gy. Los componentes del rendimiento fueron afectados de manera significativa (p < 0.05) a dosis de 100 Gy, por lo que en trabajos futuros de mejoramiento genético en café por mutagénesis, se podrían considerar dosis más estrechas a partir de los 50 Gy para no afectar dichos componentes del rendimiento que son parámetros importantes al momento de seleccionar plantas con características agronómicas deseables. Resultados similares son reportados por ^{Olasupo et al. (2016)}, quienes encontraron en ocho accesiones de Cowpea (Vigna unguiculata) un aumento de frutos por planta a 100 Gy. Sin embargo, a partir de los 200 Gy disminuye drásticamente. También ^{Álvarez-Holguin et al. (2018)}, reportan disminución de número de semillas por planta al aumentar la dosis de radiación en pasto africano. Mientras que ^{Mei et al. (1994)} y ^{Li et al. (2007)} mencionan que las características más favorables que se inducen con rayos gamma son la precocidad en la madurez, altos rendimientos y resistencia a enfermedades.