Obtención del material vegetal

El experimento se realizó en el Instituto Tecnológico del Valle de Oaxaca, México, ubicado a 17^o 04’ LN, 96^o 46’ LO con altitud de 1 550 m. Como material vegetal se utilizaron plántulas a partir de semillas germinadas in vitro. Las semillas se colectaron de plantas silvestres de A. potatorum Zucc, en San Pedro Totolapan, Distrito de Tlacolula, Oaxaca, México. De las plantas se separaron tejidos foliares y de tallo que se establecieron en medio de cultivo para inducir la formación y proliferación de brotes adventicios, mediante el procedimiento descrito por ^{Luna-Luna et al. (2017)}. Para luego realizar el enraizado de brotes y la aclimatación de plantas micropropagadas.

Enraizado de brotes

Se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, para lo cual se tomaron de los recipientes de cultivo, racimos con 15 a 23 brotes de tamaño heterogéneo en la etapa de proliferación de propágulos, de los cuales se seleccionaron brotes de 4 a 5.5 cm de altura, los cuales se separaron individualmente para luego transferir tres brotes en cada frasco de 8.5 cm de altura, 5.4 cm de diámetro interno y 160 cm³ con 20 mL de medio de cultivo para inducir la formación de raíces adventicias. Se prepararon 18 variantes de medio de cultivo que tenían 100 mg L^-1 de myo-inositol, 1 mg L^-1 de tiamina-HCl, 25 g L^-1 de sacarosa, que variaron en: 1) sales minerales MS (^{Murashige y Skoog 1962}) en concentraciones de 75 o 100%; 2) concentraciones de 0, 0.1 y 0.5 mg L^-1 de ácido indol-acético (AIA) ,y 3) concentraciones de 0, 0.1 y 0.5 mg L^-1 de ácido indol-3-butírico (AIB). En todas las variantes de medio de cultivo, el pH se ajustó a 5.8 antes de agregar 5.7 g L^-1 de agar. Los brotes establecidos se incubaron por 66 días en condiciones de iluminación LED, 35 μmol m^-2 s^-1, en fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad, con temperatura entre 15 y 29 ^oC.

El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar con arreglo factorial 2×3×3 (dos niveles de concentraciones de sales minerales, tres niveles de concentraciones de AIA y tres niveles de concentraciones de AIB), por lo que se tuvieron 18 tratamientos, tomando como unidad experimental un frasco con tres brotes, con ocho repeticiones por tratamiento, y cuando transcurrieron 66 días de incubación, se evaluó el porcentaje de brotes que formaron raíces adventicias. El desarrollo de la parte aérea y raíces, se determinó en una planta tomada al azar de cada frasco, cuantificando el número de hojas, la longitud de la hoja más larga, número de brotes, diámetro del tallo, número de raíces, longitud de la raíz más larga, volumen de raíz, peso fresco y peso seco.

Aclimatación de plantas micropropagadas

De cultivos in vitro en la etapa de multiplicación de propágulos, se obtuvieron 300 brotes de 4 a 4.5 cm de altura, y se transfirieron tres brotes en cada frasco de 160 cm³, con 20 mL de medio de cultivo para enraizado de brotes, preparado con las sales minerales MS al 100% de concentración, 100 mg L^-1 de myo-inositol, 1 mg L^-1 de tiamina-HCl, 25 g L^-1 de sacarosa, 1 mg L^-1 de ácido indol-3-butírico (AIB). El pH del medio de cultivo se ajustó a 5.8 antes de agregar 5.7 g de agar L^-1. Los cultivos in vitro se incubaron durante 66 días en condiciones similares que durante el experimento de enraizado de brotes, y transcurrido este periodo se obtuvieron las plantas micropropagadas que se extrajeron de los frascos y se lavaron para retirar el residuo del medio de cultivo. Entonces se seleccionaron 201 plantas homogéneas en tamaño, que se transfirieron a charolas de 26 cm de ancho, 53 cm de longitud y 6.5 cm de altura, divididas en 50 cavidades de 90 cm³ con sustrato turba-perlita (1:2). Para posteriormente establecerlas durante 60 días en una casa sombra de aclimatación, expuestas a humedad relativa entre 80 y 90%, y radiación solar de 400 a 500 μmol m^-2 s^-1. Las plantas recibieron todos los días riego intermitente por nebulización de 10 s cada 12 minutos, en horario de 11:00 a 16:00 h. Las 201 plantas se separaron en tres grupos de 67 plantas, para aplicarles diluciones diferentes (25, 50 y 100%) de solución nutritiva de ^{Steiner (1984)}. Se aplicaron 20 mL de fertirriego a nivel de sustrato, después del periodo de nebulización, tres veces por semana, durante 60 días. Cuando transcurrieron los primeros 60 días de aclimatación, se trasladaron a vivero donde se expusieron durante los días 61 a 90 a radiación solar de 600 a 700 μmol m^-2 s^-1, bajo cubierta de malla sombra, ventilación y humedad relativa entre 40 y 60%. Las plantas ya no recibieron riego por nebulización, pero se fertirrigaron tres veces por semana con la correspondiente dilución de solución nutritiva.

A los 30 y 90 días de aplicación de la solución nutritiva, de cada grupo de 67 de plantas, se eligieron 10 plantas a las que se les cuantificó el número de hojas (NH), la longitud y ancho de la hoja más grande, diámetro del tallo, y en el día 90 se cuantificó además, el peso fresco y seco de la parte aérea y raíz. La unidad experimental fue una planta y por tratamiento se tuvieron 10 repeticiones. De las 67 plantas en cada tratamiento se determinó el porcentaje de plantas adaptadas. El experimento se estableció de acuerdo a un diseño completamente al azar.

Análisis estadístico

En el experimento 1, los datos de cada una de 10 variables se les aplicaron las pruebas de Bartlett y Shapiro-Wilk, de homogeneidad y normalidad de varianzas, respectivamente. Los datos que no cumplieron con estos supuestos se transformaron de la forma siguiente: número de hojas (raíz cuadrada en combinación con logaritmo natural), número de brotes (raíz cuadrada con logaritmo decimal), longitud de raíz (arco seno con tangente) y volumen de raíz (logaritmo natural con raíz cuadrada) para cumplir con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas. Mientras que el resto de variables no se transformaron. Para luego realizar el análisis de varianza y las comparaciones de medias (Tukey, 0.05). Se realizaron contrastes ortogonales para comparar los efectos en el enraizado de brotes: cuando los brotes se establecieron en medios de cultivo con o sin auxinas; comparar los efectos del uso combinado de AIB+AIA contra el uso de un solo tipo de auxina; el uso de AIB contra el uso de AIA; la comparación entre concentraciones de auxinas. Los datos del experimento 2, a los 30 y 90 días de aclimatación se sometieron a análisis de varianza y comparaciones de medias mediante la prueba de Tukey (0.05). Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statistical Analysis System (SAS) versión 9.0.

Enraizado de brotes

Los datos mostraron diferencias en la cantidad de brotes de A. potatorum que formaron raíces adventicias, en el crecimiento de la raíz y parte aérea, en respuesta a la cantidad de sales inorgánicas, tipo y concentración de auxina en el medio de cultivo. En la base de los brotes las raíces adventicias fueron visibles entre los 13 y 37 días de incubación. Se considera que el A. potatorum es una especie de difícil enraizado, pues en el medio de cultivo sin auxinas el 73% de los brotes formó raíces adventicias, además de que requirieron en promedio más tiempo para enraizar, mientras que los brotes en medios de cultivo con AIA o AIB, solos o combinados, entre el 88 y 96% de los brotes formaron raíces en mayor número.

Después de los 66 días de incubación en la etapa de enraizado de brotes (Figura 1a), el análisis de varianza (Tabla 1) indica que las concentraciones del ácido Indol-3-butírico (AIB) tuvieron efecto diferente significativo (p ≤ 0.05) sobre el peso fresco de la parte aérea, y peso fresco de raíces; además de efecto diferente altamente significativo (p ≤ 0.01) en el número y peso seco de raíces. Las concentraciones de sales minerales (Smin), tuvieron efectos diferentes significativos (p ≤ 0.05) en el diámetro del tallo y peso fresco de la parte aérea. La interacción de concentración de sales minerales y el AIB tuvo efecto significativo (p ≤ 0.05) en el diámetro de tallo. Mientras que la interacción del ácido Indolacético (AIA) y el ácido Indol-3-butírico (AIB), tuvo efecto altamente significativo (p ≤ 0.01) en el diámetro del tallo.

Figura 1 (1a) Plantas obtenidas in vitro a partir del enraizado de brotes a los 66 días de incubación, (1b) plantas micropropagadas de 60 días de aclimatación, (1c) plantas de A. potatorum fertirrigadas con las concentraciones de solución nutritiva a los 90 días de aclimatación en invernadero. 

En los grupos de brotes que se establecieron en medios de cultivo sin auxinas, o con AIA o AIB, el 73, 89 y 95% de los brotes formó raíces adventicias, respectivamente. El uso combinado de AIB + AIA mostró un efecto intermedio entre cada tipo de auxina sola, en el número de brotes que formaron raíces (Tabla 2). Al ordenar los datos en función de la concentración de las sales minerales (Smin) en el medio (Tabla 2), los brotes establecidos con Smin-100% y los brotes en el medio con Smin-75%, el 87.5 y 92.1% de esos brotes formaron raíces, además los tallos fueron de 6.3 y 5.6 mm de diámetro, y el peso fresco de la parte aérea fue de 1.18 y 0.96 g, respectivamente, magnitudes diferentes (Tukey 0.05).

Los contrastes ortogonales (Tabla 3) indican que los brotes que se establecieron en medios de cultivo con auxinas, solas o combinadas, formaron significativamente (p ≤ 0.05) mayor número de hojas (NH), número de raíces (NR), longitud de raíz (LR), diámetro de tallo (DT) y peso seco de raíz (PSR), en comparación con los brotes en medios de cultivo sin auxinas. Los brotes en medios de cultivo con AIB formaron significativamente (p ≤ 0.05) más NH, NR, LR, que los brotes que se establecieron en medios de cultivo en que se agregaron AIB y AIA combinados. Los brotes en medios de cultivo con AIB formaron significativamente (p ≤ 0.05) más NR y PSR, que los brotes en medios de cultivo con AIA. Por lo tanto, el AIB para A. potatorum es la mejor auxina para promover la formación de raíces adventicias y el crecimiento de los brotes. Los brotes en medios de cultivo con 0.5 mg L^-1 de AIA desarrollaron tallos de 6.4 mm de diámetro, magnitud 3.2% mayor y significativamente (p ≤ 0.05) diferente al diámetro de tallo de los brotes en medio de cultivo con 0.1 mg L^-1 de AIA.

Aclimatación de plantas micropropagadas

Al inicio de la aclimatación las plantas de A. potatorum presentaban hojas de 5 cm longitud y 0.7 cm de ancho, flácidas, y de bordes lisos. Pero a los 60 días de exposición a mayor radiación solar, las plantas habían formado hojas nuevas que fueron más rígidas y gruesas, además de espinas marginales (Figura 1b). El análisis de varianza (Tabla 4) a los 30 días de aclimatación, muestran que las concentraciones de las soluciones nutritivas tuvieron efectos diferentes altamente significativos (p ≤ 0.01) para el número (NH) y ancho de las hojas (ANH), así como para el diámetro del tallo (DT). Mientras que a los 90 días (Figura 1c), las concentraciones de las soluciones nutritivas tuvieron efectos diferentes significativos (p ≤ 0.05) para NH, ANH, diámetro de talle (DT), altura de la hoja más larga (AHL), volumen de raíz (VOLR) y peso fresco de la parte aérea (PFA).

Las plantas mostraron crecimiento positivo en relación con la cantidad de nutrimentos que recibieron mediante la solución nutritiva, ya que a los 90 días de aclimatación las plantas fertirrigadas con SN-25% y las plantas que recibieron SN-50%, tuvieron en promedio 7.4 y 8.9 hojas; siendo la hoja más grande de 6.6 y 8.4 cm de longitud, de 1.0 y 1.3 cm de ancho; tallo de 8.5 y 10.2 mm de diámetro; parte aérea de 2.4 y 4.1 g de peso fresco, así como 0.19 y 0.31 g de peso seco, magnitudes que en cada caso fueron significativamente diferentes (Tukey, 0.05).

De los tres grupos de 67 plantas de A. potatorum micropropagadas que se transfirieron a sustrato turba-perlita (1:2) para su aclimatación en invernadero, del 84 a 90% de estas plantas sobrevivieron, y aquellas plantas que se fertirrigaron con la SN-25% fueron las más pequeñas de las que menor cantidad (84%) sobrevivió (Tabla 5). Las plantas micropropagadas, que se establecieron en sustrato turbaperlita (1:2), y recibieron solución nutritiva ^{Steiner (1984)} diluida al 50%, y aclimatadas durante 90 días en invernadero sobrevivió el 90% y fueron las más grandes en la mayoría de las características morfológicas.

Enraizado de brotes

Las auxinas son reguladores de crecimiento a los que se atribuye la propiedad de estimular la formación de raíces adventicias, además de promover el crecimiento por medio de los mecanismos de elongación celular. Para el enraizado de brotes de Furcraea macrophylla Baker, en medio de cultivo con AIA y AIB, se reporta que el 100 y 92% de los brotes formaron raíces después de los 15 a 30 días (^{Martínez y Pacheco 2006}). Lo que se debe a que el ácido indolacético (AIA) es la principal auxina nativa que se sintetiza en el ápice del brote y en las yemas laterales, para luego ser transportada basipetalamente, mientras que el AIB es una auxina sintética. Para enraizar segmentos de tallo de Pisum sativum (^{Nordström et al 1991}) y Arabidopsis se reporta que la auxina sintética AIB ejerció un efecto superior que la auxina natural AIA para estimular la formación de raíces adventicias y el crecimiento de los tallos (^{Ludwig-Müller et al. 2005}), lo cual coincide con los resultados del presente trabajo.

En diversas especies vegetales se ha determinado la importancia de evaluar diferentes tipos y concentraciones de auxinas, en que se obtenga la mejor respuesta de enraizado de brotes. Ya que para el enraizado de brotes de chayote, Sechium edule, establecidos en medio de cultivo con sales minerales al 65% y 3.0 mg L^-1 de AIA, desarrollaron casi el doble en cantidad de raíces, en comparación a brotes establecidos en medio de cultivo con 0.05 mg L^-1 de AIB (^{García-García et al. 2015}). Para el enraizado in vitro de segmentos nodales de Dalia sp., en medios de cultivo con concentraciones diferentes (0, 0.1, 0.5 y 1 mg L^-1) de AIA, la adición de 0.5 mg L^-1 de dicha auxina promovió que mayor porcentaje de segmentos nodales formarán raíces adventicias, así como la cantidad de raíces y el crecimiento del tallo (^{Jiménez-Mariña et al. 2019}). En los tejidos vegetales se encuentran auxinas endógenas sintetizadas en las hojas jóvenes y ápice del tallo (^{Ludwig-Müller et al. 2005}), lo que sugiere que los brotes de A. potatorum que formaron raíces adventicias en los medios de cultivo sin reguladores de crecimiento, posiblemente sintetizaban endógenamente auxinas. Mientras que la aplicación exógena de una auxina fue complemento importante para aquellos brotes que pudieran tener niveles bajos de auxinas endógenas. Las auxinas exógenas estimularon que los brotes formaran más raíces adventicias. Los resultados del presente estudio difieren con lo descrito por ^{Reyes-Zambrano et al. (2016)}, quienes mencionaron que en Agave americana L. tanto la cantidad de raíces y su longitud, no se vieron afectadas por el AIB. En especies como Rosa centifolia (^{Baig et al. 2011}) y Prunus empyrean (^{Sadeghi et al. 2015}), se ha demostrado que el AIB tiene mayor efecto para inducir el enraizamiento de brotes de Rosa damascena Mill. (^{Pati et al. 2004}), pero es necesario investigar para cada especie la dosis óptima de auxina, ya que concentraciones de AIB superiores al óptimo inhiben el desarrollo de raíces (^{Baker yWetzstein 2004}). Al respecto se sabe que en algunas especies, las combinaciones en una proporción alta de auxinas y bajas de citocininas mejoran la respuesta en el enraizado de brotes (^{Buyukdemirci 2008}).

Además del efecto superior que tuvo el AIB en comparación al AIA para promover en los brotes de Agave potatorum la formación de raíces adventicias, pudo estar presente más AIB en forma biológicamente activa, en comparación a los medios de cultivo con AIA. Ya que parte de las auxinas son degradadas durante la esterilización mediante autoclave del medio de cultivo. También se sabe que el AIA es más propenso que el AIB a degradación por temperaturas elevadas, de tal manera que ^{Epstein y Ludwing-Müller (1993)} mencionan que debido a esterilización en autoclave las concentraciones de AIA y AIB son reducidas en 40 y 20%, respectivamente.

En tejidos de tallo la formación de raíces adventicias después de que son estimuladas por auxinas algunas células especificas son activadas y en las primeras 24 horas acumulan almidón, que luego se degrada como paso previo a que las células asuman divisiones celulares, formación de meristemoides, y posteriormente primordios de raíz con una típica forma de domo. Por lo que la presencia de auxinas se requiere en la etapa de activación de las células (^{Klerk 1996}). Pero en el presente trabajo la evidencia mostro que de los grupos de brotes que se establecieron en el medio con las sales minerales a 75%, se formó mayor cantidad de raíces adventicias, que los grupos de brotes establecidos con las sales minerales al 100%. En la propagación in vitro de Agave americana var. oaxacensis (^{Miguel-Luna et al 2013}) y en Agave angustifolia (^{Enríquez-del Valle et al. 2005}) se reporta que todos los brotes formaron raíces adventicias entre los 12 y 21 días de incubación, aun en los medios de cultivo sin auxinas, pero que los brotes en medios de cultivo con menor cantidad, 66 y 50% de sales minerales MS, y con auxinas, formaron mayor cantidad de raíces y en menor tiempo, en comparación a grupos de brotes que se establecieron en medio de cultivo con las sales minerales a 100%.

Aclimatación de plantas micropropagadas

Las plantas micropropagadas poseen características morfológicas y fisiológicas, cutícula delgada e ineficiente funcionamiento de los estomas, por lo que son susceptibles a la deshidratación, lo que dificultan su transferencia directa a condiciones ex vitro, por lo que es importante someterlas a una etapa de aclimatación (^{Pospíšilová et al. 1999}). Por lo que los primeros 10 días de aclimatización se les debe proporcionar humedad relativa alta, radiación solar disminuida a 40 o 50%, y en días posteriores exponerlas gradualmente a menor humedad relativa y mayor radiación solar (^{Gil-Rivero et al. 2017}). En diversas especies de agaves micropropagados: A. fourcroydes (^{Abreu et al. 2007}), A. americana var. oaxacensis (^{Yescas-Arreola et al. 2016}, ^{Cruz-García et al. 2017}), A. potatorum (^{Luna-Luna et al. 2017}) se describe que en los primeros 35 a 70 días de aclimatación, ocurre la senescencia de hojas que las plantas formaron durante su cultivo in vitro, para ser sustituidas por hojas que presentan mayor área foliar, suculencia, engrosadas, rígidas, haces vasculares, lo que se relaciona con adaptación al ambiente ex vitro. Al respecto, ^{Sánchez et al. (2020)} describieron que plantas micropropagadas de A. angustifolia y transferidas a condiciones ex vitro, transcurridos 60 días, presentaron desarrollo estomático, aumento de la deposición de ceras, incremento de tamaño y número adaxial, desarrollo de estructuras papilares y formación de cristales de oxalato de calcio en la epidermis, por lo que las plantas requieren de 60 días de acondicionamiento en invernadero antes de ser trasladadas a vivero, ya que pasan a la fase de endurecimiento.

Las plantas a las que se aplicó la SN-100% no mostraron crecimiento adicional con respecto a las plantas fertirrigadas con SN-50% (Tabla 4). Los cuales son resultados diferentes a los descritos en A. americana (^{Cruz-García et al. 2017}, ^{Pérez-Santiago et al. 2014}) y en A. angustifolia (^{Enríquez-Del Valle et al. 2012}), a las que se aplicó la solución nutritiva al 100%, y fueron las más grandes al concluir la aclimatación.

Las plantas de tamaños inferiores a 7 cm de talla y de menos de 0.51 g de peso fresco, tuvieron menor sobrevivencia. Al respecto ^{Aureoles Rodríguez et al. (2008)} mencionan que en Agave inaequidens Koch, las plantas menores a 4 cm y con pocas raíces, tienen menor sobrevivencia, mientras que plantas de tamaño superior a 4 cm, tienen mayor sobrevivencia. Se sabe que es importante que las plántulas in vitro sean de buena calidad evaluado en cantidad y tamaño de hojas, diámetro de tallo, volumen de raíz, características que influyen en el porcentaje de plantas que sobreviven ex vitro (^{Sánchez-Rodríguez et al. 2012}). Sobre lo mismo, ^{Cabrera (1999)} menciona que el sustrato con turba y perlita presenta 93% de porosidad total, al combinar sustrato orgánico (turba) con inorgánico (perlita) ayuda a mejorar principalmente sus propiedades físicas y químicas, como la capacidad de retención de agua y poros de aire. De acuerdo con ^{Anicua-Sánchez et al. (2009)} y ^{Yescas-Arreola et al. (2016)} la materia orgánica en el sustrato estabiliza el pH, la capacidad de intercambio catiónico y la disponibilidad de nutrimentos, mientras que la perlita aporta estabilidad para conservar entre un 77.4 y 85% de porosidad para la retención de agua y la aireación de las raíces.