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Introducción
Para aumentar el número y calidad de embriones al comienzo de un programa de superovulación, se han diseñado y evaluado diversas estrategias, entre las cuales destacan: 1) El uso de agonistas y/o antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) previos a la superovulación para incrementar el número de folículos pequeños disponibles y así poder estimularlos con hormona folículo estimulante (FSH) exógena (Cognie et al.2003), 2) Iniciar el tratamiento de superovulación inmediatamente después de la ovulación (Menchaca y Rubianes 2007), y 3) Asegurar concentraciones altas de progesterona durante la fase inicial del tratamiento superovulatorio (Gonzalez-Bulnes et al. 2004). Pero una vez superada la etapa de superovulación, es importante verificar que los embriones generados y recuperados se encuentran en óptimo desarrollo lo que ayudará a disminuir el porcentaje de mortalidad (Cognie et al. 2003).
En rumiantes, se ha demostrado que una dosis única de rBST mejora el desarrollo embrionario si se aplica al momento de la inseminación artificial (Mejía et al. 2012), incrementando el IFNT (vacas lecheras) y aumenta la tasa de concepción (Ribeiro et al. 2014). Asimismo, en programas de ovulación múltiple y transferencia de embriones (OMTE) se ha mejorado la tasa de concepción cuando se aplica la rBST al momento del estro en vacas de leche (Ribeiro et al. 2014), no así en ovejas (Carrera-Chávez et al.2014). Tanto en vacas como en ovejas se ha mencionado la importancia de iniciar el tratamiento de la rBST para mejorar la tasa de ovulación como el porcentaje de cuates (Safdar y Sadeghi 2016).
Estudios realizados en ovejas y vacas demuestran que la aplicación de la somatotropina bovina recombinante (rBST) previa a la ovulación tiene efectos directos en la fisiología reproductiva, como mayor tamaño del cuerpo lúteo (CL), incremento en la secreción de progesterona y extensión del estro por el alargamiento de la vida media el CL funcional (Navarrete-Sierra et al. 2008, Zarco et al.2012). También se ha encontrado que altera los componentes del sistema de factores de crecimiento insulínico (IGF), estimulando la esteroidogénesis folicular (Montero-Pardo et al. 2011) y los fluidos uterinos (Costine et al.2005, Martínez et al. 2011).Adicionalmente, se ha relacionado con el desarrollo de la sensibilidad a la hormona luteinizante (LH) y es escasa en cabras sobre la aplicación de la rBST en diferentes tiempos de un ciclo reproductivo. Por lo anterior, el objetivo fue conocer el efecto de la rBST sobre la actividad ovárica, la cantidad y estadio de los embriones transferibles en cabras al inicio del anestro estacional.
Materiales y métodos
Área de estudio
El estudio se llevó acabo al inicio del anestro estacional (marzo) en el Rancho Cerro de Agua, ubicado en el km 151 de la carretera 57, Galeana, Nuevo León, México (24° 50’ 00” LN, 100° 04’ 00” LO, con altitud de 1 600 msnm). El clima es semiárido, templado con temperatura media anual de 16.1 °C y precipitación media de 434.5 mm (INEGI 2010).
Manejo y selección de las hembras
Se utilizaron 30 cabras multíparas de la raza alpina como donadoras de embriones, con la condición de que se tuvieran un parto registrado en la época reproductiva anterior, con un descanso posparto mínimo de cinco meses. Al inicio del experimento, las cabras presentaban un peso vivo de 50.1 ± 2.3 kg y condición corporal (CC) de 2.9 ± 0.3, de acuerdo con la clasificación descrita por Arranz (2002), donde 1 = flaca y 5 = obesa, la CC fue evaluada por dos técnicos expertos en ganado caprino. Las cabras se sometieron 30 días antes del tratamiento hormonal a un manejo sanitario, el cual consistió en la aplicación de vitaminas A, D y E a razón de 1.0 mL animal−1, con una concentración de 500 000 U.I, 75 000 U.I. y 50 mg, respectivamente (Vigantol® ADE). También se desparasitaron de forma interna con 2.5 mg de Closantel-Panavet® al 5%, vía oral a dosis de 1 mL por cada 20 kg de peso vivo. Las cabras permanecieron estabuladas durante el experimento (2 meses) y se alimentaron ad libitum con alfalfa henificada. Adicionalmente se proporcionó un concentrado todos los días a razón de 0.5 kg animal−1 (14% de proteína cruda y 3.0 Mcal kg−1 de energía metabolizable), mientras que la disponibilidad de agua fue a libre acceso
Las cabras permanecieron estabuladas durante el experimento (2 meses) y se alimentaron ad libitum con alfalfa henificada. Adicionalmente se proporcionó un concentrado todos los días a razón de 0.5 kg animal−1 (14% de proteína cruda y 3.0Mcal kg−1 de energía metabolizable), mientras que la disponibilidad de agua fue a libre acceso.
Sincronización y superovulación de las hembras
La sincronización del estro, se realizó mediante la inserción de dispositivos vaginales con 0.3 g de progesterona (CIDR®) durante siete días, el mismo día de la inserción del dispositivo, se aplicó una dosis única de 5 mg de dinoprost trometamina (Lutalyse®). El tratamiento superovulatorio consistió en la administración de siete dosis de 25 mg de FSHp (Folltropin-V®) a partir del cuarto día post-inserción del CIDR y con un intervalo de 12 h entre cada dosis,
para administrar una dosis total de 175 mg de FSHp a cada cabra. Las cabras fueron bloqueadas de acuerdo al peso, producción de leche y condición corporal, asignandola en forma aleatoria en cada uno de los siguientes tratamientos T1 = grupo testigo (n=10), T2 = 100 mg de somatotropina bovina recombinante (rBST) (Boostin-S®, Intervet) (n = 10), y T3 = 200 mg de rBST (n = 10). En los T2 y T3, la administración de rBST se realizó vía subcutánea después de detectar el estro, desde la remoción de los dispositivos hasta las 72 h posteriores al retiro; utilizando un macho vasectomizado para la detección del estro Las cabras se inseminaron vía laparoscopia a un tiempo fijo de 51 ± 3.4 h después del retiro del dispositivo con semen congelado importado (Biogenics-LTD), proveniente de sementales de la misma raza, probados genéticamente en cuanto a valores de referencia genética para producción de leche y apreciación lineal (Habilidad de transmisión predicha) y previa prueba de calidad y viabilidad post descongelamiento, relacionados con la concentración espermática y motilidad masal, las cuales fueron evaluadas de acuerdo a la metodología descrita por Evans y Maxwell (1990), dando como referencia un mínimo de 100 millones por pajilla y motilidad mínima de 2.5.
Recolección de embriones
La recolección de embriones se realizó por la técnica de laparotomía al séptimo día post retiro del dispositivo, mediante la metodología descrita por Baril et al. (1995). Las cabras fueron sometidas a previo ayuno 24 h antes de la cirugía y se anestesiaron con una mezcla de clorhidrato de ketamina (Anesket®) a dosis de 20 mg kg−1 de peso vivo y clorhidrato de xilacina (Rompun®) a dosis de 0.25 mg kg−1 de peso vivo. Una vez anestesiada la cabra, se aplicó en el sitio de la incisión abdominal una dosis única de 40 mg de clorhidrato de lidocaína (Pisacaina®1%). Las cabras se colocaron en posición craneal a 45° y el aparato reproductor se exteriorizó por una incisión medio-ventral de 6 cm. Posteriormente se utilizó una sonda pediátrica Fouley debalón de 5 cm3 para realizar el lavado de cada uno de los cuernos uterinos aplicando 40 mL del medio de colección BioLife™ Advantage Embryo Collection Medium, el cual se mantuvo en baño maría a temperatura de 37°C. La recolección del medio de cada cuerno uterino se depositó en una caja de Petri (100 x 15 cm) para la identificación y clasificación de los embriones mediante un microscopio estereoscopio (Stemi 2000, Carl Zeiss) de acuerdo con los criterios descritos en la guía del Manual del International Embryo Transfer Society (Stringfellow y Seidel 1998).
Variables de estudio
Se evalúo el intervalo retiro-estro (IRE), contando las horas que pasaron después del retiro del dispositivo hasta la detección del estro. El intervalo retiro-servicio (IRS) se determinó cuantificando las horas que transcurrieron desde el retiro del dispositivo vaginal hasta la inseminación artificial a tiempo fijo. Número de cuerpos lúteos (CL), número de embriones recuperados (ER), número de embriones transferibles (ET), porcentaje de cabras en estro y porcentaje de embriones recuperados, que se calculó en base a los embriones recuperados sobre el número de cuerpos lúteos que se contaron.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron con el paquete estadístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences). Todas las variables se compararon con la prueba de Kruskal-Wallis. El porcentaje de cabras en estro y de embriones recuperados, se compararon mediante la prueba de Chi cuadrada. La comparación de medias se realizó por medio de DMS. Las diferencias se consideraron significativas cuando p <0.05.
Resultados y discusión
Para las variables de la sincronización del estro como el porcentaje de cabras en estro, el IRE, IRS no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados (p >.05, Tabla 1). Para el número de cuerpos lúteos, se presentó diferencia significativa (p = 0.002) entre los tratamientos, siendo mayor para el T3. Para el número y porcentaje de embriones recuperados se presentaron diferencias significativas (p = 0.001, p = 0.02) entre tratamientos, siendo mayor en ambos en T3. Para el total de mórulas fue mayor en T1, y para blastocitos recuperados fue mayor en T3 que T2 (p = 0.0008 y p = 0.001) respectivamente; siendo en el caso que T1 no se recolectó ningún blastocito.
Tabla1 : Efecto de la rBST en cabras donadoras al final de la época del anestro estacional (medias ± EE).
| Somatotropina bovina recombinante (rBST) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Variable | T1 = Control | T2 = 100 mg | T3 = 200 mg | Probabilidad | |
| Número de hembras | 10 | 10 | 10 | ||
| Cabras en estro (%) | 80.0 (10/8) | 100.0 (10/10) | 100.0 (10/10) | 0.212 | |
| Intervalo retiro-estro (h) | 28.8 ± 0.8 | 28.9 ± 2.4 | 27.4 ± 1.0 | 0.972 | |
| Intervalo retiro-servicio (h) | 51.3 ± 0.1 | 51.7 ± 0.6 | 51.1 ± 0.1 | 0.722 | |
| Cuerpos lúteos (n) | 3.2 ± 2.4b | 5.3 ± 2.1a | 7.0 ± 2.8a | 0.002 | |
| Embriones recuperados (n) | 3.2 ± 2.1c | 4.5 ± 2.5b | 6.0 ± 4.9a | 0.001 | |
| Embriones recuperados (%) | 100.0 (32/32)a | 84.9 (45/53)b | 85.7 (60/70)b | 0.02 | |
| Mórulas (n) | 3.0 ± 0.3a | 2.0 ± 0.4a | 1.0 ± 0.2b | 0.008 | |
| Blastocitos (n) | 0.0c | 3.0 ± 0.7b | 6.0 ± 0.4a | 0.001 | |
Valores con diferente superíndice son estadísticamente diferentes (p < 0.05).
En general, se incrementó de forma significativa la producción de embriones transferibles en cabras con la aplicación de la rBST al momento de iniciado el estro y durante el inicio del anestro estacional. El comportamiento favorable de los tratamientos de rBST, sobre el porcentaje de embriones recuperados y su estadio, pudo deberse al aumento en las primeras 24 h de aplicación de IGF-I (Safdar y Sadeghi 2016) y disminuciones del INFT, ejerciendo un efecto estimulador en la proliferación y mitogénesis de células tecales y de la granulosa, favoreciendo la formación de folículos preovulatorios como se reporta en otras especies de mamíferos, como la yegua (Equus ferus caballus) (Davidson et al. 2002); o bien favoreciendo de forma directa el incremento en la población de folículos preantrales (Moreira et al. 2002b). Pero hoy en día se tiene poca información con respecto a este evento en cabras.
En este estudio, el efecto de rBST también se vio reflejado en aumento del número de CL, lo que coincide con lo reportado por trabajos en ovejas (Zarco et al. 2012, Montero-Pardo et al. 2011), quienes obtuvieron hasta 4.5 más de CL cuando se aplicó rBST. En el presente trabajo, la condición corporal se manejó de forma adecuada desde el inicio del trabajo (2.9) para que no fuera un factor determinante en la respuesta de la dosis de rBST (100 y 200 mg) que se aplicó a las cabra al inicio del estro, ya que de lo contrario al ser sometidas a un programa de transferencia de embriones, se puede afectar el desarrollo folicular y de embriones a mejores estadios (morula y blastocisto), más aún si el tiempo de aplicación de la rBST se realiza posterior al estro. Al respecto Moreira et al. (2002a) en vacas lecheras, encontraron diferencias en el número de folículos desarrollados y por lo tanto de cuerpos lúteos, cuando se aplicó la rBST en la inseminación y con diferente condición corporal. En este trabajo se logró impactar sobre el desarrollo de blastocitos aumentando el número de los mismos, para las cabras que recibieron 100 mg y 200 mg de rBST, las cuales son iguales a los reportados por Safdar y Sadeghi (2016), en ovejas. Esto se soporta por otras investigaciones realizadas in vitro, por el hecho de que embriones de dos células expresan más temprano el mRNA para los receptores de la hormona del crecimiento (Baldassarre 2007) y el adicionar rBST en el medio de cultivo acelera el desarrollo embrionario (Costine et al. 2005). Sin embargo, debe continuarse con líneas de investigación, donde se evalúe el efecto de dosis mayores de 100 mg de rBST, sobre el desarrollo embrionario, ya que se ha reportado en otros estudios que al exponer los embriones a altas concentraciones de Insulina e IGF-1, sufren apoptosis y por lo tanto al ser transferidos se reabsorberán, lo que afecta la tasa de gestación (Chi et al. 2000). Se encontró efecto benéfico de la rBST sobre la actividad ovárica y cantidad de embriones obtenidos dependiendo de la dosis utilizada. Sin embargo, se debe de considerar evaluar la acción directa de la rBST sobre las hormonas que actúan directamente sobre el crecimiento y desarrollo folicular de las cabras y su efecto sobre el desarrollo embrionario.
