INTRODUCCIÓN

Haemonchus contortus es un nemátodo gastrointestinal de rumiantes que afecta la productividad de ovinos en diferentes regiones del mundo. Por su actividad hematófaga, provoca reducción en las tasas de crecimiento y fecundidad, así como incremento en la mortalidad de animales (^{Moreno et al. 2010}). Su tratamiento y control se basa exclusivamente en moléculas de químicos inorgánicos, lo que ha provocado resistencia a este tipo de productos (^{Van Wyk 2001}). Esta problemática ha motivado la búsqueda de alternativas, para su manejo, siendo una de éstas el uso de plantas con propiedades antihelmínticas (^{Irum et al. 2015}). La exploración de plantas para el control de nemátodos gastrointestinales de ovejas y cabras ha sido extensa en los últimos diez años, lo que ha desarrollado el uso de extractos crudos o soluciones antiparasitarias. Entre las plantas investigadas con efecto ovicida y larvicida contra H. contortus, se reporta Theobroma cacao (^{Vargas-Magaña et al. 2014}), Citrus sinensis (^{Islam et al. 2015}), Artemisia vestita, Artemisia maritima (^{Irum et al. 2015}) y Rhizophora mangle (^{Alemán et al. 2011}).

La planta Pluchea sericea comúnmente conocida como Cachanilla, es un arbusto silvestre de hoja perenne, que crece en suelos arenosos o salinos en los desiertos de Baja California, Sonora y Chihuahua en México (^{Villaseñor y Villareal 2006}). Existe evidencia reciente de su potencial en el control de plagas de los cultivos. Al respecto ^{Ail-Catzim et al. (2015)} reportan efecto insecticida y repelente de extractos acuosos, acetónicos y etanólicos de hojas y tallos de P. sericea sobre Bemisia tabaci. La planta Artemisia tridentata es un arbusto importante del oeste de América del Norte, se distribuye desde Columbia Británica hasta México (^{Jassbi et al. 2010}). Los usos de esta especie por pueblos nativos americanos incluyen analgésicos, antiinflamatorios, antisépticos, actividad inmunoestimulante, así como el tratamiento de aflicciones de origen espiritual (^{Turi et al. 2014}).

No hay estudios que confirmen la actividad antihelmíntica de P. sericea y A. tridentata sobre H. contortus; por lo tanto, es importante estudiar los extractos de estas plantas, como una alternativa para el manejo de H. contortus en sistemas de producción ovina. Debido a lo anterior, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto ovicida y larvicida de extractos acuosos de hojas de P. sericea y A. tridentata en huevos y larvas del tercer estadio (L₃) de H. contortus.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Parasitología del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Baja California, localizada en Ejido Nuevo León, Mexicali, Baja California. Se recolectaron partes áreas de P. sericea en el Valle de Mexicali (32º 24’ 34” LN y 115º 11’ 31” LO), en el municipio de Mexicali y de A. tridentata en el Valle de la Trinidad (31º 24’ 15” LN y 115º 43’ 55” LO), en el municipio de Ensenada. Las muestras de hojas se secaron a temperatura ambiente bajo sombra, para luego molerlas en un molino (Willey) para obtener partículas de 2 mm de diámetro.

Los extractos de estas plantas se obtuvieron de 200 g de muestra de hojas molidas en 2 L de agua destilada a 100 °C, por 3 h. Posteriormente se filtró con gasa y algodón para separar los residuos sólidos, el filtrado de cada muestra se rotovaporó a 40 °C y 0.2 bar de presión con un equipo Heidolph L3. El extracto concentrado se congeló a -50 °C para su liofilización en un equipo Labconco. Se tuvieron rendimientos de extracto del 10 y 8% para A. tridentata y P. sericea, respectivamente.

Para la obtención de los huevos y larvas de H. contortus, se suministró oralmente 4000 larvas de tercer estadio (L₃) del parásito a dos ovinos machos (Donadores) no castrados de 4 meses de edad, con peso de 25 kg cada uno. A partir de 21 d post-infección se observaron por conteo 2 000 huevos de H. contortus g^-1 de heces (HPG). Los donadores recibieron una dieta de mantenimiento, compuesta de 80% de paja de trigo más 20% de heno de alfalfa (Proteína cruda 9.3% y energía metabolizable 2.0 mcal kg^-1 de materia seca), recomendada por la National Research Council (NRC 2007) y permanecieron en estabulación en corrales elevados con disponibilidad de agua ad libitum, de acuerdo a las normas de Bienestar Animal (OIE 2015). De los donadores todos los días se extrajeron las heces de forma directa del recto y se trasladaron al laboratorio para la recuperación de los huevos del parásito. Las muestras de heces frescas se maceraron en un mortero, se saturaron con agua destilada, y filtraron en tamices de 180, 106, 75 y 25 μm, para eliminar la materia orgánica; y retener los huevos en el último tamiz (^{Bizimenyera et al. 2006}). Para luego recoger los huevos con una micropipeta Pasteur y se resuspendieron con solución salina saturada, luego se centrifugaron a 190 X g durante 5 min. Se extrajo el sobrenadante y se lavó con agua destilada en un tamiz de 25 μm para eliminar la solución salina. Para el caso de larvas L₃, se utilizó la técnica de ^{Corticelli y Lai (1963)}, que consistió en colocar materia fecal húmeda dentro de una caja de Petri, para luego colocar dentro de otra caja Petri de mayor tamaño, y añadir agua destilada entre ambas cajas y tapar la caja Petri. Los huevos se mantuvieron durante 15 d bajo condiciones de 26 °C y humedad relativa de 85%, después de este periodo se observó la presencia de larvas L₃.

Los experimentos de inhibición de huevos se realizaron depositando en cada pozo de una microplaca (96 pozos) 100 huevos contenidos en 50 μL de agua destilada y se agregaron 50 μL de cada una las concentraciones de 100, 75, 50, 25 y 12.5 mg mL^-1 de los extractos de P. sericea o A. tridentata, y se incluyó un testigo absoluto (agua destilada) y un testigo comercial (Albendazol 1.0 mg mL^-1). Se tuvieron 10 repeticiones para cada concentración y testigos. Las microplacas se sellaron y se mantuvieron por 24 h en incubadora a 27 °C y humedad de 85%. Transcurrido el tiempo se detuvo le eclosión, con la adición de 10 μL de solución de lugol al 3% (^{Assis et al. 2003}). La evaluación de la inhibición de huevos se realizó colocando 10 alícuotas de 10 μL de cada tratamiento en un portaobjetos para cuantificar los huevos no eclosionados y larvas vivas, mediante un microscopio compuesto con aumento de 10X. El porcentaje de inhibición de eclosión de huevos (IEH) se calculó mediante la fórmula:

Los experimentos de mortalidad larval se realizaron depositando en cada pozo de una microplaca (96 pozos) 30 larvas L₃ contenidos en 30 μL de una solución tampón de fosfato a la que se le agregaron 30 μL de las concentraciones de los extractos de P. sericea o A. tridentata. También se incluyó un testigo absoluto (tampón de fosfato) y un testigo comercial (Albendazol 1.0 mg mL^-1). Se tuvieron cinco repeticiones para cada concentración y testigos. Las microplacas se sellaron y se mantuvieron por 24 h en incubadora a 27 °C y humedad de 85%. La evaluación de la mortalidad se realizó colocando seis alícuotas de 10 μL de cada tratamiento en un portaobjeto para cuantificar las larvas muertas mediante un microscopio compuesto (Fisher Scientific Micromaster) con aumento de 10X. Se consideró como larvas muertas, aquellas que presentaran enroscamiento del cuerpo o cuerpo estirado, sin movimiento sinusoidal después de haber sido estimuladas por la luz del microscopio (^{Ferreira et al. 2013}). El porcentaje de mortalidad larval (ML) se calculó con la fórmula:

Los resultados de los experimentos se analizaron mediante análisis de varianza bajo un diseño completamente al azar con el procedimiento PROC GLM de SAS versión 9.0, las medias del porcentaje de inhibición y mortalidad larval para cada extracto se compararon con la prueba de Tukey con probabilidad de 5.0%. Se estimó el valor de la concentración letal media (CL₅₀) y sus límites fiduciales al 95% para cada extracto y cada estadio del parásito mediante el PROC PROBIT de SAS versión 9.0; se consideró que dos valores de CL₅₀ son estadísticamente iguales si existe traslape entre sus límites fiduciales a 95% (^{Robertson et al. 2007}).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las plantas P. sericea y A. tridentata exhibieron actividad ovicida y larvicida sobre H. contortus dependiente de la concentración de sus extractos, el análisis de varianza indicó diferencias significativas entre los tratamientos para el porcentaje de inhibición de eclosión de huevos (F=153.44; gl=6, 63; P=0.0001) y mortalidad de larvas L₃ (F=13.30; gl=6, 28; P=0.0001). Todas las concentraciones de los extractos de P. sericea y A. tridentata presentaron mayor (p < 0.05) porcentaje de inhibición de eclosión y mortalidad larval sobre H. contortus (Figura 1 y 2) que el testigo absoluto que tuvo 13% de inhibición de eclosión de huevos y 0% de mortalidad larval, lo que indica que las dos plantas tienen efecto ovicida y larvicida sobre el parásito gastrointestinal.

Figura 1: Porcentaje de inhibición de eclosión de huevos de H. contortus expuestos a cinco concentraciones de extractos acuosos de P. sericea y A. tridentata. 

Figura 2: Porcentaje de mortalidad de larvas (L₃) de H. contortus expuestas a cinco concentraciones de extractos acuosos de P. sericea y A. tridentata. 

Los extractos de P. sericea y A. tridentata con 100 mg mL^-1 tuvieron 100 y 96.30% de inhibición de eclosión de huevos, respectivamente (Figura 1), resultados que coinciden con ^{Mini et al. (2013)}, quienes con 100 mg mL^-1 de extracto acuoso de Aristolochia indica tuvieron 90% de inhibición de eclosión de huevos de H. contortus. Los extractos de P. sericea y A. tridentata fueron cinco veces más eficaces en comparación al extracto acuoso de semillas de Azadirachta indica reportado por ^{Barrabí-Puerta y Arece-García (2013)}. En contraste, los extractos de las plantas estudiadas presentaron menor eficacia en comparación con el extracto acuoso de Artemisia campestri, que con 2 mg mL^-1 presentó 100% de inhibición de eclosión de huevos de H. contortus (^{Akkari et al. 2014}).

En relación a la mortalidad larval, los extractos de P. sericea y A. tridentata con 100 mg mL^-1 presentaron 92.67 y 89.33% de mortalidad (Figura 2), resultados que son similares a los de ^{Irum et al. (2015)}, quienes con 100 mg mL^-1 de extracto de A. maritima y A. vestita tuvieron 100 y 85% de mortalidad larval, respectivamente. Sin embargo, los extractos de ambas plantas estudiadas tuvieron menor eficacia que los extractos acuosos de Saba senegalensis (^{Belemlilga et al. 2016}) y Piptadenia viridiflora (^{Morais-Costa et al. 2016}), ya que con 15 y 19.31 mg mL^-1 registraron 97.77 y 93.13% de mortalidad larval, respectivamente.

Las plantas P. sericea y A. tridentata presentaron moderada eficacia sobre huevos y larvas de H. contortus, en comparación con los resultados de otros estudios, con 100 mg mL^-1 de extractos de ambas plantas se obtuvo inhibición de eclosión de huevos y mortalidad larval similar al obtenido con albendazol (Figura 1 y 2). Lo que indica que los extractos de estas plantas pueden ser una alternativa para el control de nemátodos gastrointestinales de pequeños rumiantes, representando además una alternativa para sustituir a los productos químicos que exhiben inadecuado control debido a la resistencia.

En la Tabla 1 se presenta la concentración letal media (CL₅₀) de los extractos de P. sericea y A. tridentata para el porcentaje de inhibición de huevos y mortalidad larval de H. contortus, no observándose diferencias significativas (p > 0.05) entre estos valores para ambos estadios del parásito, ya que existe traslape entre sus límites fiduciales al 95% (^{Robertson et al. 2007}). Los extractos acuosos de A. tridentata y P. sericea registraron una CL₅₀ de 23.26 y 23.21 mg mL^-1, respectivamente; para el porcentaje de inhibición de huevos, valores que son superiores a 1.0 mg mL^-1 de extracto de A. campestri sobre huevos de H. contortus reportados por ^{Akkari et al. (2014)}. Valores inferiores para la CL₅₀ de extractos metanólicos de Annona squamosa y Eclipta prostrata, extractos de etil acetato de Solanum torvum y Cathanranthus roseus, y extractos acetónicos de Terminalia chebula fueron reportados por ^{Kamaraj y Rahuman (2011)}. La CL₅₀ para la mortalidad larval obtenida es similar a la obtenida por ^{Irum et al. (2015)} para el extracto de A. maritima (CL₅₀= 12. 2 mg mL^-1). Pero en general, los valores de CL₅₀ de los extractos de P. sericea (20.36 mg mL^-1) y A. tridentata (27.18 mg mL^-1) son superiores en comparación con otros estudios que evalúan la actividad larvicida de extractos de plantas sobre H. contortus (^{Zhu et al. 2013}, ^{Acharya et al. 2014}, ^{Akkari et al. 2014}). La diferencia en eficacia que exhibieron P. sericea y A. tridentata en comparación con otros estudios realizados para evaluar la actividad ovicida y larvicida sobre H. contortus puede estar relacionada con el disolvente utilizado para la preparación de los extractos. Los extractos a base de agua presentan menor actividad antihelmíntica en comparación con los extractos a base de disolventes orgánicos (^{Bizimenyera et al. 2006}), debido a que el agua extrae menos compuestos bioactivos de las plantas (^{Alawa et al. 2003}). Por ejemplo, los extractos acetónicos presentan más compuestos bioactivos de amplio rango de polaridad (^{Eloff 1998}) y exhiben mayor actividad ovicida y larvicida sobre H. contortus que los extractos acuosos (^{Adamu et al. 2013}, ^{Fouche et al. 2016}). En muchas investigaciones se ha utilizado dimetil sulfóxido, compuesto que tiene capacidad emulsionante y solubiliza compuestos altamente polares o no polares, facilitando el paso de los compuestos a través del corión del huevo y la cutícula de la larva, lo que incrementa el porcentaje de inhibición de eclosión del huevo y mortalidad larval de H. contortus (^{Acharya et al. 2014}). El no emplear solvente químico, puede explicar la diferencia en eficacia que presentaron los extractos acuosos de P. sericea y A. tridentata. Los extractos acuosos tienen la ventaja de presentar menor citotoxicidad en comparación con los extractos a base de acetona (^{Nchu et al. 2011}), aspecto que corrobora la mayor inocuidad de los extractos acuosos sobre los organismos, además la baja citotoxicidad es un aspecto importante para evaluar la selectividad de este tipo de compuestos sobre los hospederos de los parásitos (^{Fouche et al. 2016}).

Tabla 1: Concentración Letal media (CL₅₀) para la inhibición de eclosión de huevos y mortalidad de larvas L₃ H. contortus expuestos a extractos acuosos de P. sericea y A. tridentata. 

* Valores de CL₅₀ seguidos de letras iguales en la columna no son diferentes estadísticamente según ^{Robertson et al. (2007)}. ** Indica la prueba de significancia para la pendiente de la ecuación de predicción.

Se presenta evidencia de la actividad ovicida y larvicida in vitro de extractos acuosos de P. sericea y A. tridentata sobre H. contortus, que indica que puede usarse para el control de nemátodos gastrointestinales en pequeños rumiantes; la eficacia de ambos extractos sobre H. contortus depende de la concentración. Se recomienda realizar análisis fitoquímicos para identificar los compuestos bioactivos responsables de la actividad ovicida y larvicida de los extractos de P. sericea y A. tridentata.