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Introducción
La fermentación entérica de los carbohidratos estructurales de pastos y forrajes, celulosa, hemicelulosa y lignina, es la principal fuente CO2 y metano (CH4), emitidos por el sector agropecuario mundial (Eckard et al. 2010, Dewhurst 2013). La actividad ganadera genera cerca del 90 % del metano emitido al medio ambiente (Cottle et al. 2011, Gerber et al. 2013). En producción animal, la generación de metano representa energía liberada, que no se aprovecha para el mantenimiento y producción de los rumiantes y por tanto, hace que sea menos eficiente el uso de los recursos forrajeros. La pérdida fluctúa entre 3 y 13 % de la energía bruta contenida en la ración (Miller y Wollin 2001).
Dentro de las estrategias alimenticias para mitigar la metanogénesis entérica, la suple-mentación con fuentes de ácidos grasos polünsatu-rados de origen animal o vegetal se postula como una medida efectiva (Hristov et al. 2013, Kumar et al. 2014). Los ácidos grasos polünsatu-rados mitigan la producción de metano mediante la defaunaciòn que ejercen sobre bacterias gram+ y protozoarios, además de lacaptación de iones de H+ libre, saturando los enlaces dobles en sus cadenas en un proceso de biohidrogenaciòn, lo que disminuye la disponibilidad de H+ para la síntesis de CH4, (Martin et al. 2010). Sin embargo, la suplementación alimenticia con grasas, aceites y fuentes de ácidos grasos se ha asociado con la reducción de la cinética de fermentación y la degradabilidad de los sustratos (Hook et al. 2010, Hristov et al. 2012), disminuyendo la tasa de fermentación ruminal y modificando los patrones de síntesis de ácidos grasos volátiles en el rumen, ya que aumenta la síntesis de butirato y disminuye la proporción molar de acetato (Kong et al. 2010). Algunos aceites vegetales tienen en su composición química ciertos metabolitos secundarios (terpenoides, isoprenoides, compuestos aromáticos entre otros) que contribuyen a la reducción de las emisiones de metano, mediante la defaunación selectiva de las poblaciones de protozoarios y metanógenos asociados (Mao et al. 2010, Benchaar y Greathead 2011). El uso de aceites vegetales ricos en ácidos grasos polünsaturados en la nutrición animal, ha sido cuestionado, ya que compiten con la nutrición humana; sin embargo, si son accesibles en costo, abundancia relativa y adicionalmente poseen metabolitos secundarios, representan una alternativa para la mitigación de CH4 en la producción ganadera (Beauchemin et al. 2008, Sallam et al. 2009).
A nivel mundial, más de la mitad de los rumiantes domésticos habitan en regiones tropicales, en las que consumen forrajes de baja digestibilidad y con disponibilidad sujeta a las condiciones climáticas y estacionales, no obstante, persiste una firme presión por una mayor cantidad y calidad de productos de origen animal (FAO 2009). En dicho contexto, el uso de complementos alimenticios como los aceites vegetales provenientes de especies nativas en las regiones ganaderas, son un recurso renovable y sustentable (Abdalla et al. 2012). Los aceites de adelfa amarilla (Thevetia peruviana) y de aguacate (Persea americana) poseen un rendimiento y perfil de ácidos grasos similares a fuentes lipídicas como soya, coco, cañóla y girasol (Odihambo et al. 2012). Adicionalmente, en el aceite de adelfa amarilla se han descrito propiedades insecticidas, antibióticas y antifúngicas (Kareru et al. 2010). Por otro lado, en el aceite de aguacate se han encontrado compuestos bioac-tivos como fenoles, alcanos, cetonas, fitoesteroles y carotenos (Dos Santos et al. 2014). Aunque no se ha documentado su comportamiento, ni su toxicidad en sistemas de fermentación ruminal in vitro, ambos aceites son candidatos en nutrición animal como mitigadores de metano teniendo en cuenta su composición química (Ibiyemi et al. 2002, Ortiz et al. 2003). El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la inclusión de diferentes proporciones de aceites de adelfa amarilla (Thevetia peruviana) y aguacate Hass (Persea americana) sobre la metanogénesis y la digestibilidad in vitro de pasto estrella de Africa.
Material y métodos
El estudio se desarrolló en las instalaciones del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, en Tarímbaro, Michoacán, México, ubicada en los 19o 45' 00" LN y los 19° 54' 00" de LO, a una altitud media sobre el nivel del mar de 1883 m. El clima predominante es templado subhúmedo con lluvias en verano (Cw1) (García 1964).
Extracción de aceites y perfil de ácidos grasos
Para la obtención de aceite de adelfa amarilla (T. peruviana Schum) (TP) se cosecharon frutos maduros en el municipio de Tuzantla, Michoacán. Las semillas limpias se sometieron a un proceso de prensado mecánico a temperatura ambiente, separando el aceite crudo que se filtró y almacenó en frascos de color ámbar a temperatura ambiente, adicionando 0.1 mi de vitamina E como agente conservador.
El aceite de aguacate Hass (P. americana Miller var Hass) (AG) se obtuvo de frutos no aptos para la comercialización en huertos y empacadoras del municipio de Nuevo Parangaricutíro, Michoacán. Los frutos se deshidrataron a 65 °C durante 48 h y se trituraron para obtener una pasta, de la cual se extrajo la fracción oleosa de acuerdo al método número 30 descrito por la AOAC (2000), utilizando como solvente orgánico hexano grado reactivo.
En ambos aceites se analizó el perfil de ácidos grasos, a partir de una muestra de 50 mg que se mezcló con 6 mi de solución Folch durante 24 h. Posteriormente, las muestras se sometieron a sonicación por 15 min, a 4 °C , para su posterior evaporación a 30 °C. Se les realizó un proceso de derivación lipidica de acuerdo al método de Folch et al. (1957) con 2.5 ml de una solución metanol: ácido clorhídrico (95:5), a 85 °C por 2.5 h. Luego, las muestras se diluyeron al 5 % con hexano, adicionándose 10 µl de butil hidroxi tolueno como antioxidante y 10 µl de ácido tricosanoico como estándar interno. Las muestras se colocaron en viales para cromatografía de color ámbar, para luego realizar su inyección de 1 µl en un cromatógrafo de gases marca Agilent 6850. Utilizándose una columna (Aient BD-23) de 50 % Cyanopropyl, 50 % methylpolysiloxano, con longitud de 30 m X 0.25 mm de espesor con un diámetro interno de 0.25 µm. Como gas de acarreo se usó Helio grado cromatogràfico, con flujo de H+ a 40 ml min-1. Al final se realizó la identificación y cálculo de la concentración relativa de los ácidos grasos comparando el tiempo de retención de las muestras y el área de los cromatogramas contra los estándares de referencia 37 componente FAME mix, supelco y marinol.
Forraje sustrato
Se utilizó heno de pasto estrella africana (Cynodon plechtostachuys) que contenía 12.1 % de proteína cruda, 1.7 % de extracto etéreo, 71.29 % de fibra detergente neutra (FDN), 28.29 % de fibra detergente ácida (FDA) y 35.49 % de extracto libre de nitrógeno (AOAC, 2006). El pasto se deshidrató en un horno de aire forzado a 56 °C por 24 h, para luego pulverizarlo a 300 rpm por 2 min y tamizarlo con una malla de 1 mm. El contenido de materia seca de la muestra fue de 94 %.
Cultivo in vitro
Los tratamientos se sometieron a un proceso de digestión in vitro durante 96 h, de acuerdo a la técnica de Theodorou et al. (1994). El cultivo se efectuó en botellas de vidrio de 125 ml, herméticamente selladas con tapón de goma. Los frascos contuvieron al forraje sustrato (0.99 g), 90 ml de una solución de saliva artificial y 10 ml de líquido ruminal como agente inoculante. Para la extracción de líquido ruminal se seleccionaron dos vacas Holstein secas e intactas, con un peso promedio de 540 ± 30 Kg. Los animales se alimentaron con una dieta de 80 % forraje (ensilado y rastrojo de maíz) y 20 % de alimento concentrado comercial. El método de colecta del líquido ruminal fue por sondeo orogàstrico, insertando una sonda de polietilene) con punta roma por vía oral, los animales se sedaron antes de cada colecta con 0.25 mg por kg de peso con clorhidrato de xilazina. La sonda se acopló a una bomba manual de vacío, depositando el líquido ruminal en un contenedor térmico herméticamente sellado a temperatura de 38.5 °C. Durante la extracción del fluido ruminal, la primera porción obtenida se descartó, por su alto contenido de saliva. El cultivo se realizó a 39 °C, la medición de la producción de gas se llevó a cabo con un manometro digital portátil (Lutron PS) cada 60 min, durante las primeras 8 h de cultivo, para posteriormente operarse a intervalos de 4 h, hasta la conclusión a las 96 h.
Tratamientos
Nueve frascos por tratamiento se sometieron a cultivo, en aceite de Persea americana, aceite de Thevetia peruviana y un grupo control (0 g). Cada tratamiento se manejó con las siguientes proporciones: 0 % (0 g aceite y 1 g de sustrato), 1 % (0.01 g aceite y 0.99 g sustrato), 2 % ( 0.02 g aceite y 0.98 g sustrato), 3 % (0.03 g aceite y 0.97 g sustrato), 4 % (0.04 g aceite y 0.96 g sustrato), 5 % (0.05 g aceite y 0.95 g sustrato) y 6 % (0.06 g aceite y 0.94 g sustrato), el pasto sustrato se administró en base a su materia seca previamente calculada (94 %).
Medición de metano
Para la cuantificación de la producción de CH4 en las muestras incubadas, se tomaron 2 ml de biogás en los frascos de cultivo, que se almacenó en tubos plásticos de 15 ml de capacidad, herméticamente sellados y libres de aire, que contenían 13 ml de una solución salmuera ácida (pH = 4), preparada con cloruro de sodio granulado a saturación, en 1 000 mi de agua destilada, ajustando el pH con ácido clorhídrico. Las muestras de biogás se inyectaron a un volumen de 0.5 cm3, con una jeringa de vidrio y aguja calibre 22s marca Hamilton, en un cromatógrafo de gases Varian Chrompack CP 3800, utilizando H+, aire comprimido y N2 como gases de acarreo en una columna de acero inoxidable, revestida de silica gel, con 7.5 m de longitud y un diámetro interno de 0.25 mm. Como estándar de referencia se utilizó metano al 99.99 % de pureza. Se calculó el promedio de CH4 por cm3 de biogás inyectado para poder estimar la producción total acumulada de metano por g de materia seca del forraje sustrato, en función de la producción total de biogás acumulado por tratamiento.
Análisis de digestibilidad
Para la determinación de la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS), se procedió a filtrar el residuo sólido de los frascos al final de la fermentación in vitro, utilizando filtros grado 54 (Whatman). Una vez recuperados los residuos se llevaron a deshidratación. Para evaluar la digestibilidad de la fibra detergente neutra (DIVFDN), se tomaron 50 ml de solución FDN en los residuos de la producción de gas, que se colocaron en un autoclave a 105 °C por una hora, para luego filtrar en crisoles Goosh del numero uno, posteriormente se deshidrataron a 65 °C por 12 h. El cálculo de DIVMS se realizó por diferencia de peso entre la muestra inicial y la materia seca (MS) final del residuo de producción de gas, mientras que la DIVFDN se calculó teniendo en cuenta el contenido de la FDN de la muestra entre el contenido de FDN de la muestra intacta (Van Soest et al. 1991).
Variables evaluadas
Las variables analizadas fueron: producción acumulada de gas (PG), producción de CH4 en cm3 g-1 de MS de sustrato, digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS %) y digestibilidad in vitro de la fibra neutro detergente (DIVFDN %).
Análisis de datos
Los datos se analizaron bajo el procedimiento GLM, aplicándose contrastes ortogonales entre los niveles (dosis) de cada tratamiento (aceite), y de la interacción tratamiento x nivel, la diferencia entre los tratamientos se determinó mediante mínimos cuadrados. En todos los análisis se utilizó el paquete estadístico SAS 9.0 para Windows.
Resultados
El perfil de ácidos grasos de los aceites de TP y AG (Tabla 1), muestra que la concentración de ácidos grasos insaturados fue alta con valores del 70 y 80 %, respectivamente; predominando el ácido oleico, que representó casi 50 % de los ácidos grasos.
Tabla 1 Perfil de ácidos grasos y su concentración en aceite de semillas de adelfa amarilla (Thevetia peruviana) y frutos de aguacate (Persea americana).
Producción de gas
La producción promedio fue de 224 cm3 g-1 de MS del sustrato en TP y de 223 cm3 g-1 en AG, observándose una disminución significativa en los tratamientos de 4, 5 y 6 % de ambos tipos de aceites. Se observó un efecto lineal del nivel de inclusión de aceite sobre la producción de gas in vitro, así como una interacción del tratamiento x nivel (p < 0.0001) (Tabla 2).
α Indica diferencia significativa en las columnas (p < 0.0001), CME= Cuadrado medio del error, Significancia= p < 0.0001 indica diferencia significativa.
Tabla 2 Medias de cuadrados mínimos de los efectos de la inclusión de aceites de adelfa amarilla (Thevetia peruviana) y frutos de aguacate (Persea americana) sobre la producción acumulada de gas (PG) y metano (CH4) en condiciones in vitro.
Producción de metano
La adición de aceite de TP y AG, afectó la producción de CH4 entre 19 y 30 cm3 a partir del tratamiento de 3 % de aceite, respecto al tratamiento control, observándose la menor producción de metano en los niveles del 5 y 6 % de ambos aceites. Se observó un efecto lineal y cuadrático de la dosis de aceite y de la interacción tratamiento x nivel (p < 0.0001), sin encontrar un efecto del tipo de aceite (Tabla 2).
Digestibilidad del forraje
La DIVMS, mostró una disminución (p <0.001), con la adición de aceite de TP y AG en los tratamientos con más de 3 %, lo que tuvo impacto en la DIVFDN que muestraron un comportamiento similar. El tratamiento control presentó una DIVMS promedio del 67.2 %, que se redujo hasta 11 % en el tratamiento con 6 % de aceite. El contenido de FDN del sustrato fue del 71.2 %. Sin embargo, durante el proceso de producción de gas in vitro, el tratamiento control presentó una DIVFDN promedio de 52.52 %, la cual se redujo hasta 37 % en los tratamientos con los mayores contenidos de aceites. Tanto en la DIVMS como en DIVFDN se observó un efecto lineal y cuadrático con la dosis de aceite y de la interacción dosis x aceite (p < 0.0001), sin encontrarse efecto del tipo de aceite (Tabla 3).
α Indica diferencia significativa en las columnas (p < 0.0001), CME= Cuadrado medio del error, Significancia= p < 0.0001 indica diferencia significativa.
Tabla 3 Medias de cuadrados mínimos para la digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) y de la fibra detergente neutra (DIVFDN) en pasto estrella de África (Cynodon plechstostachyus) incubado con distintos niveles de aceites de Thevetia peruviana y Persea americana.
Discusión
En general se ha reportado que existe una correlación negativa entre la inclusión de aceites esenciales, fuentes de ácidos grasos, aceites puros y modificados con respecto a la producción de gas in vitro (Mohammed et al. 2004, Abdalla et al. 2012). En este sentido, Castagnino et al. (2015) encontraron que en tratamientos con aceites poliinsaturados y glicerol, la producción de gas in vitro disminuye del 12 al 20 % y afecta los parámetros de fermentación. Al respecto Nanon et al. (2014), encontraron que utilizando aceites esenciales de pasto limón (Cymbopogon citratus), ajo (Allium sativum) y jenjibre (Zingiber officinale) en dosis de 200 mg kg-1 de MS, la producción de gas y digestibilidad se mantuvieron en un nivel alto, por lo que los aceites favorecieron la producción de gas in vitro, aunque en proporciones menores a la utilizadas en el presente estudio. Por otra parte, se ha reportado que los aceites de canola (Brassica napus) y girasol (Helianthus annuus) poseen un perfil de ácidos grasos similar a los de TP y AG, y son capaces de aumentar la eficiencia en el crecimiento bacteriano en niveles inferiores al 5 % sobre la materia seca (Dewhurst et al. 2000), por lo que favorecen la producción de gas. No obstante, en el presente estudio la producción de gas se redujo a partir del tratamiento con 4 % de aceite.
Aunque en los aceites de TP y AG que se evaluaron en este trabajo, no se realizaron análisis químicos para metabolitos secundarios, se observó un comportamiento similar al de algunos aceites esenciales, encontrados por Lin et al. (2013) al utilizar aceites esenciales combinados con fumarato, quienes observaron una disminución paulatina en la producción de gas, en función de la adición de dichos aceites, siendo significativa al agregar 200 mg L-1 de solución, con una producción promedio de gas de 91 ml, aunque con menor cantidad de sustrato (750 mg) con respecto al presente estudio (999 mg).
En cuanto a la disminución de la metanogénesis, algunos autores han encontrado una reducción lineal entre la producción de metano in vitro y el aumento en la proporción de aceites (Sallam et al. 2010, Grainger y Beauchemin 2011). En este tópico existe una mayor variabilidad de resultados, ya que aspectos como el tipo de forraje, cantidad, tipo de aceite, perfil de ácidos grasos y metodología de cultivo influyen; por lo que resulta difícil establecer un parámetro de referencia sobre el nivel de inclusión y la respuesta en la reducción de metano. En la presente investigación se encontró efecto de la dosis, sin que el tipo de aceite afectara la metanogénesis, por lo que ambos aceites se comportaron de manera similar. En general, algunos estudios sugieren que la cantidad y tipo de ácidos grasos poseen diferente potencial reductor de la metanogénesis; al respecto, Soliva et al. (2003), encontraron un mayor resultado en la mitigación de metano in vitro utilizando ácido laúrico no esterificado (C12) en comparación con el ácido mirístico (C14). En el presente trabajo, no se detectó diferencia entre los dos tipos de aceites en la producción de gas y de metano, dada la similitud en el perfil de los ácidos grasos.
En algunas situaciones un alto nivel de aceite en cultivos ruminales, no se relaciona de forma directa con la producción de metano. Al respecto Storlien et al. (2012), reportaron que con 5 % de aceites de cañóla, girasol e hígado de bacalao, se tuvo una producción de gas similar entre el control y los tratamientos, pero no tuvo efecto sobre la producción de metano, lo que contrasta con lo observado en el presente estudio, donde la inclusión del 3 % de aceites de TP y AG, tuvo una producción de gas similar al control, pero redujo de forma significativa la producción de CH4. En condiciones in vitro, la reducción de la metanogénesis puede estar ligada a la reducción de la fermentación, producción de gas, y digestibilidad del sustrato por niveles altos de aceite (Patra y Yu 2012), lo que no se observó en el presente trabajo, ya que con 3 % de ambos aceites, se mantuvo la producción de gas y digestibilidad del forraje, afectando únicamente la producción de CH4.
El porcentaje de DIVMS y DIVFDN fueron afectados con niveles altos de aceite (4 al 6 %), ambas variables mostraron un comportamiento similar, aspecto que coincide con lo reportado por Nanon et al. (2014), quienes encontraron un comportamiento lineal y cuadrático de DIVMS y DIVFDN con aceite de jengibre, similar al del presente estudio. Sin embargo, al comparar los indicadores de digestibilidad del presente trabajo contra los reportados por Martínez et al. (2006) con aceites de plantas del género Thymus, se infiere que la naturaleza de los aceites tiene un impacto d i recto sobre la fermentación y digestibilidad del forraje, ya que estos autores observaron una disminución del 30 % en la digestibilidad con niveles bajos del 2 % de aceite. Es posible que la baja digestibilidad se relacione con la presencia de metabolitos secundarios, que pueden ser tóxicos para la flora ruminal.
Uno de los principales retos en materia de mitigación de metano a nivel experimental, radica en el hecho de que aunque se logre mitigar la metanogénesis se debe evitar una disminución lineal de la digestibilidad, ya que guarda una relación directa con la productividad animal y el consumo voluntario de alimento (Beauchemin y McGinn 2006).
El presente estudio es el primero sobre comportamiento biológico del aceite de Thevetia peruviana en fermentación in vitro, dados los antecedentes de toxicidad de la planta a nivel de sus hojas, tallos, inflorescencias y frutos (Odhiambo et al. 2012). Los parámetros de producción de gas y digestibilidad obtenidos con los aceites de TP y AG del presente trabajo, indican que se puede considerar el uso de ambos aceites en estudios in vivo que contemplen su evaluación como aditivos alimenticios y mitigadores de la metanogénesis.
Conclusiones
Al adicionar 3 % de aceite de Thevetia peruviana y de frutos de aguacate en cultivos ruminales con pasto estrella de África, se puede reducir la metanogénesis sin afectar la producción de gas y la digestibilidad del forraje in vitro. Además de que se observa un efecto lineal y cuadrático de la dosis de aceite sobre la producción de metano y digestibilidad del forraje.
