Introducción

A nivel mundial, el cáncer pulmonar es un serio problema de salud pública, representa una de las principales causas de mortalidad. En México, ocupa la cuarta causa de muerte general por cáncer. Los pacientes hispanos con esta patología tienden a ser diagnosticados en etapas tardías de la enfermedad, en comparación con los de origen no hispano ⁽¹⁾. La tasa de supervivencia no supera 10% en la mayoría de los países. 80% de los cánceres de pulmón pertenecen a la estirpe histológica carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), que incluye el carcinoma epidermoide, el adenocarcinoma y el carcinoma de células grandes ⁽²⁾. Una de las estrategias que ha revolucionado el tratamiento personalizado del cáncer pulmonar, ha sido la identificación de características moleculares (mutaciones o amplificaciones génicas) que son responsables de la supervivencia tumoral y que han permitido tratamientos dirigidos contra blancos específicos que actúan de forma selectiva. El pronóstico de los pacientes cuyos tumores expresan estas alteraciones moleculares y son tratados con terapias específicas, es más favorable al de la población general con cáncer de pulmón. Una de las dianas terapéuticas para el CPNM es la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés), que está activada en 43-83% de los pacientes. EGFR forma parte de la vía de señalización de varios procesos celulares críticos, como el crecimiento, la proliferación y la motilidad celulares, así como la organogénesis y angiogénesis. Además, se ha demostrado que tiene una función fundamental en la transformación y progresión tumoral ⁽³⁾. El gen EGFR (7p13-p12) se identificó como protooncogén, constituido por 28 exones que ocupan un segmento de 75 kb y codifican una proteína precursora de 1,210 aminoácidos con masa molecular de 170 kDa ⁽⁴⁾.

EGFR, es una glicoproteína transmembranal compuesta de un dominio extracelular amino-terminal para la unión de ligandos, una hélice transmembranal hidrófoba, un dominio citoplasmático con el dominio tirosina-cinasa y una región carboxilo-terminal con residuos de tirosina y elementos reguladores del receptor. Cuando esta vía es activada, por unión de ligandos en el dominio extracelular, produce oligomerización del receptor que activa el dominio tirosina-cinasa y autofosforilación, de ambos dominios del receptor. De esta manera, se induce una cascada de señales que lleva a la proliferación celular, protección frente a apoptosis, mayor supervivencia y transcripción génica ⁽⁵⁾. La activación de este receptor supone, tanto un beneficio de proliferación como un freno a la apoptosis, al estimular rutas oncogénicas como la vía RAS/MAPK ⁽²⁾. Por consiguiente, los inhibidores de tirosina-cinasa (ITK), como Gefitinib (Iressa®), Erlotinib (Tarceva®) y Afatinib (Giotrif®), son utilizados en el tratamiento de CPNM ya que inhiben de forma irreversible al EGFR, interrumpiendo la señal de crecimiento y produciendo un efecto antitumoral ⁽⁶,⁷⁾.

Las células tumorales de CPNM pueden presentar mutaciones especificas en el gen EGFR que se comportan como elementos predictivos de respuesta a los fármacos ITK ⁽³⁾. Pacientes con tumores positivos a mutaciones en el gen EGFR, responden mejor y muestran mayor sobrevida con tratamientos ITK en comparación con pacientes que desarrollan tumores negativos a mutaciones específicas en EGFR, quienes responden solo en 10% ⁽²⁾. De esta manera, el tratamiento contra cáncer de pulmón ha mejorado, al implementarse dianas terapéuticas dirigidas al EGFR. La expresión de EGFR es 20 veces mayor en el tumor que lo normal y correlaciona con un peor pronóstico, que deriva en un mayor índice de proliferación y capacidad invasiva, así como en una reducción de la sobrevida ⁽⁸⁾. Dos mutaciones principales del gen EGFR ocupan 90% de todas las observadas en cáncer de pulmón. La primera del E746-A750, NM-005228.4 (EGFR): c.2235-2249delGGAATTAAGAGAAGC (p.Glu746-Ala750del, rs121913421), es una deleción del nucleótido 9 al 24 en el exón 19 que comprende los codones 746-750 y corresponden de 45% a 50% de las mutaciones. La segunda, L858R, NM-005228.3(EGFR):c.2573T>G (p.Leu858Arg, rs121434568) es una mutación puntual en el nucleótido 2573 (CTG>CGG) en el exón 21, que resulta en sustitución de leucina por arginina en el codón 858, que se encuentra hasta en 45% de las mutaciones en EGFR⁽⁹⁾. Estas mutaciones aumentan la actividad de EGFR y confieren susceptibilidad al inhibidor, debido a cambios conformacionales que aumentan la sensibilidad de la célula mutada a las señales del EGFR. Cuando se administra un inhibidor, la activación del EGFR que es necesaria para la supervivencia celular, se interrumpe, provocando la muerte celular ⁽¹⁰⁾. El tratamiento con ITK en tumores positivos a mutación en EGFR, ha logrado una tasa de respuesta global superior al 80% como tratamiento de primera línea y ha alcanzado una supervivencia global que supera los 15.4 meses ⁽⁸⁾. La proporción de casos reportados con la mutación va dependiendo de la población analizada; el porcentaje más elevado se ha encontrado en Asia (40%), mientras que en la zona occidental del mundo la frecuencia es menor (5% a 20%) ⁽⁸, ¹¹⁾.

La determinación de mutaciones del gen EGFR es considerado un valioso biomarcador para la aplicación de tratamientos ITK en pacientes con CPNM metastásico o quimioresistentes, quienes requieren monitoreo y seguimiento. Adicionalmente, se ha propuesto como un método no invasivo la determinación de mutaciones EGFR en ADN circulante, como una alternativa para evitar biopsias repetidas para monitoreo en la práctica clínica. La cantidad de tejido tumoral obtenido por biopsia es a menudo insuficiente, especialmente en CPNM avanzado, planteando la interrogante de si el ADN circulante puede ser utilizado como una biopsia líquida sustituta, para la detección no invasiva de las mutaciones deEGFR. Ensayos clínicos han demostrado consistencia entre muestras de tumor y de suero con una tasa de 79.7 a 92.9% ⁽⁷, ¹²⁾. Así mismo, un metaanálisis sugiere, que la sangre puede ser usada como sustituto de tejido tumoral para la determinación de mutaciones EGFR⁽¹³⁾. Por otra parte, la presencia de éstas en tejido sano, puede indicar una predisposición genética para el desarrollo de cáncer de pulmón y/o un indicio temprano de carcinogénesis ⁽⁵⁾. Sin perder de vista, que estas dos mutaciones específicas de EGFR se asocian a una buena respuesta al tratamiento con ITK.

En la población de Yucatán, se desconoce la frecuencia de las mutaciones del gen EGFR, tanto en casos de CPNM como en muestras de personas sanas, información de relevancia para contribuir en la toma de decisión del tratamiento personalizado, así como para determinar la proporción de la población local que puede resultar beneficiada debido a la buena respuesta con ITK. El objetivo de este trabajo fue evaluar la frecuencia de las mutaciones del E746-A750 exón 19 y L858R exón 21 del gen EGFR, en muestras de biopsia de CPNM y en muestras de suero de población abierta de Yucatán.

Material y métodos

Se incluyeron 101 muestras de sangre periférica pertenecientes a sujetos voluntarios adultos no relacionados, que acudieron al banco de sangre del Hospital Regional sede Mérida, Yucatán. Se seleccionaron donadores sin manifestaciones de enfermedades crónico-degenerativas, con estudio de electrocardiograma normal y prueba de esfuerzo negativa; sin antecedente familiar de algún tipo de cáncer; con lugar de nacimiento en Yucatán, en al menos, dos generaciones. 86.14% fueron hombres y 13.86% mujeres con promedio de edad 46.2 ± 7.3 y media de peso, talla e IMC de 70.2 ± 12.5kg, 1.62 ± 0.07 m y 26.9 ± 3.8 kg/m², respectivamente.

Los sujetos seleccionados manifestaron participación voluntaria mediante consentimiento informado. El procedimiento y selección de sujetos se llevó a cabo de acuerdo con las buenas prácticas, siguiendo los lineamientos éticos de la Declaración de Helsinky y manteniendo la confidencialidad de los participantes.

Se incluyeron 19 muestras de biopsia de carcinoma pulmonar no microcítico, mediante donación y autorización de la colección biológica del Departamento de Patología de la Unidad Médica de Alta Especialidad del Centro Médico Nacional “Dr. Ignacio García Téllez” del IMSS, Mérida, Yucatán. A partir de sus registros, se seleccionaron muestras de tejido embebido en parafina con diagnóstico citopatológico confirmado de CPNM de tipo adenocarcinoma en 100% de los casos, independientemente de sexo y edad, nueve de las cuales procedían de pacientes del sexo masculino y 10 del femenino.

A partir de un 1 ml de sangre periférica se purificó el ADN genómico del suero, mediante el método de Bounce con solventes orgánicos. Para la determinación de las mutaciones EGFR, en muestras de parafina para biopsias de CPNM, se siguió un método directo para la amplificación por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), aplicando el estuche comercial Phusion Human Specimen Direct PCR de la marca Thermo Scientific.

La identificación las mutaciones del E746-A750 exón 19 y L858R exón 21 del gen EGFR, se ejecutó mediante la técnica de PCR oligo-alelo específica, siguiendo el protocolo propuesto por Dahse et al., ⁽¹⁴⁾, que propone para del E746-A750 exón 19, cuatro cebadores, dos externos (19P y 19Q) y dos internos complementarios (19A y 19B), en tres reacciones independientes de PCR: PQ que amplifica un fragmento de 444 pb como control interno de la reacción, AQ amplifica un fragmento de 325 pb en presencia del alelo normal o sin deleción (alelo 1) y PB amplifica un fragmento de 134 pb en presencia del alelo mutado o con deleción (alelo 0). En tanto que, para la detección de la mutación L858R exón 21, el protocolo de Dahse et al, propone tres secuencias de cebadores, uno externo 21P y dos internos complementarios 21A y 21B para amplificar en dos reacciones independientes: 21P-A amplifica un fragmento de 137 pb específico para el alelo normal T; y 21P-B que amplifica un fragmento de 134 pb correspondiente al alelo mutante G ⁽¹⁴⁾. En todas las reacciones de PCR, se utilizó como control negativo una reacción sin ADN. Los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% durante una hora a 120 voltios. Cabe mencionar que, para la mutación del E746-A750 exón 19, amplificaron 79 del total de 101 muestras de suero.

Se utilizó el programa SNPStats (https://www.snpstats.net) para determinar la distribución de las frecuencias genotípicas de acuerdo al equilibrio de las poblaciones según Hardy Weinberg; así como para estimar las frecuencias genotípicas y alélicas para ambos grupos de muestras. Las frecuencias genotípicas encontradas para ambas mutaciones en EGFR, fueron comparadas estadísticamente con la frecuencia descrita para otras poblaciones usando tablas de contingencia en el paquete RxC (http://www.physics.csbsju.edu/stats/contingency.html)

Resultados

En las muestras de suero, se encontró para la mutación del E746-A750 exón 19, la presencia de dos genotipos, el homocigoto silvestre o sin deleción (1/1) y el genotipo heterocigoto (1/0), siendo éste el más frecuente (73.42%). Es interesante destacar la ausencia del genotipo homocigoto mutante o con deleción (0/0) en las muestras de suero. La frecuencia de la mutación por deleción E746-A750 exón 19 fue 36.71% para la población estudiada. La distribución de las frecuencias genotípicas para la mutación del E746-A750 no se ajustaron al equilibrio de las poblaciones según el teorema Hardy-Weinberg (p = 0.0001), explicado debido a la ausencia de homocigotos con la mutación del E746-A750 (0/0). Para la mutación L858R exón 21 de EGFR se encontraron los tres genotipos esperados en las muestras de suero, siendo el genotipo heterocigoto (T/G) el más frecuente con 54.46%. La frecuencia para la mutación L858R (T>G) exón 21 fue 50.99%. La distribución de las frecuencias genotípicas para la mutación L858R en el gen EGFR, se ajustaron al equilibrio de Hardy-Winberg en las muestras de suero de la población general (p = 0.43) (Cuadro 1).

Para el grupo de muestras de biopsias CPNM, se encontraron los tres genotipos para la mutación del E746-A750 exón 19, siendo el más frecuente el genotipo heterocigoto con 63.16%. El genotipo homocigoto con deleción (0/0) se encontró en 10.52% de las muestras de biopsia. La distribución de las frecuencias genotípicas para ambas mutaciones de EGFR en las muestras de biopsia, se ajustaron al equilibrio de las poblaciones Hardy Weinber (p = 0.36). La frecuencia de cada una de las mutaciones EGFR correspondió a 42.11% en las biopsias. Para la mutación L858R exón 21, se presentaron los tres genotipos esperados, para el heterocigoto T/G correspondió la mayor frecuencia con 73.68%.

La comparación de la distribución de las frecuencias genotípicas entre muestras de suero y las de biopsia, arrojó diferencias significativas para la mutación del E746-A750 (p = 0.014), debido a que el genotipo mutante (0/0) se encontró, únicamente, en las muestras de biopsia. En tanto, no se encontró diferencia significativa en la distribución alélica para la mutación del E746-A750, ni para las frecuencias genotípicas y alélicas para la mutación L858R, entre las muestras de biopsia CPNM y las de suero (p = 0.538).

La combinación genotípica TG/1-0 fue la más frecuente para ambos grupos de muestras, debiendo destacar que la combinación genética doble mutante (GG/0-0), es decir la presencia simultánea de homocigotos para ambas mutaciones en la misma muestra, no se encontró en ningún grupo de muestras estudiadas. De las nueve combinaciones genéticas esperadas, se mostraron ocho en las biopsias de CPNM y seis en las muestras de suero. No se encontró diferencia estadísticamente significativa en la comparación de la distribución de las frecuencias de las combinaciones genotípicas EGFR L858R / del E746-750 entre muestras de biopsia de CPNM y suero (p = 0.120).

Discusión

El presente estudio contribuye al conocimiento sobre la frecuencia y distribución de las dos mutaciones del gen EGFR más relevantes e implicadas en la respuesta al tratamiento para cáncer de pulmón, la L858R en el exón 21 y la mutación por deleción E746-A750 en el exón 19, en un grupo de muestras de biopsia de pacientes con CPNM y de sueros de personas sanas. Las mutaciones en el gen EGFR se han descrito más frecuentemente en cáncer de pulmón que, en otro tipo, de manera que la identificación de mutaciones en el gen EGFR representa uno de los marcadores más predictivos para la aplicación de terapias ITK en CPNM ⁽⁶⁾. Particularmente, en la población estudiada se demostró la presencia de mutaciones en EGFR en ambos grupos de muestras, en las biopsias CPNM, 42.11% para cada mutación y para suero 36.71% con la deleción E746-A750 y 50.99% para la L858R. De acuerdo con la distribución de las combinaciones genotípicas solamente 5.26% de las biopsias de CPNM y 2.53% de los sueros, son negativos para la presencia de al menos una mutación de las analizadas, lo que sugiere que, en la población de la región de Yucatán, un número importante de pacientes, mayor a 90%, puede resultar beneficiado, con buen pronóstico y respuesta favorable con la selección de un tratamiento personalizado con ITK, basado en el genotipo EGFR, contribuyendo además con un aumento en la tasa de sobrevivencia y calidad de vida, con menores efectos secundarios.

Así mismo, los resultados aportan información sobre las expectativas de detección de mutaciones de EGFR en suero; por un lado, estima la proporción de sujetos de la población general que tendrían una respuesta favorable a ITK y por otro, aporta evidencia para la detección de las mutaciones EGFR como una alternativa ante la limitación de obtención de biopsia o la cantidad de material biológico suficiente para el estudio. El análisis en tejido tumoral sigue siendo el método recomendado para la detección de la presencia de mutaciones deEGFR. Un reporte previo demostró la viabilidad de utilizar ADN circulante libre a partir de muestras de sangre de pacientes con CPNM avanzado como un sustituto para biopsias de tejido. A 78% de los pacientes se le detectaron mutaciones deEGFRen ADN circulante libre. El tiempo medio de supervivencia global fue menor en los pacientes con la mutación L858R que en aquellos con la deleción en el exón 19 en ADN circulante (13.7 versus 30 meses). Para los pacientes con la mutación L858R en biopsia, el tiempo medio de supervivencia global fue de 13.7 meses y 27.7 meses para aquellos en los que no se detectó la mutación circulante. Para los pacientes con mutaciones deEGFRen ADN circulante, sólo el tratamiento con erlotinib fue un predictor independiente de la enfermedad para la supervivencia libre de progresión. Se colocó a la mutación L858R enEGFRcomo un factor pronóstico y predictivo de la supervivencia en determinados pacientes, con niveles de sensibilidad de 78% y especificidad de 100%, así como la importancia de la biopsia liquida en la monitorización de los pacientes ⁽¹⁵⁾. Ensayos clínicos han apoyado la consistencia entre las muestras de biopsia de tumor y suero con un índice aproximado de 79.7 a 92.9% (7,12,15). Así mismo, un metaanálisis ha evidenciado que la sangre es un sustituto del tejido tumoral para detectar mutaciones en EGFR⁽¹³⁾.

La frecuencia de cada mutación EGFR estudiada, se encontró en 42.11%, de las biopsias, siendo significativamente diferente a lo descrito para otras poblaciones étnicamente relacionadas de México, Colombia y Costa Rica, que determinó 55.9% para la deleción E746-A750 del exón 19 y 23.9% para la L858R del exón 21 ⁽³⁾. El Instituto Nacional de Cancerología (INCAN) de la Ciudad de México ha descrito una frecuencia de 63.9% para la mutación del exón 19 y 26% para la del exón 21 ⁽¹⁶⁾. También hay que tomar en cuenta, que el INCAN atiende a pacientes de todo el país, razón que podría aumentar ligeramente la frecuencia observada. En pacientes mexicanos sometidos a terapia dirigida con ITK en primera, segunda y tercera línea de tratamiento, los resultados fueron favorables, ya que la tasa de respuesta global fue de 62%, la sobrevivencia libre de progresión de 15.1 meses y la sobrevida global alcanzó los 16.4 meses, que es mayor de lo que se reporta para la quimioterapia ⁽¹⁶⁾. Las industrias farmacéuticas, han demostrado que los tratamientos con terapia dirigida, son más eficientes y menos tóxicos que la quimioterapia en pacientes que presentan mutaciones en el gen EGFR. La mediana de supervivencia libre de progresión es, aproximadamente, de 14 meses con fármacos ITK frente a 4.6 meses para la quimioterapia, también la tasa de respuesta objetiva es superior, con 83% para los ITK y 36% para quimioterapia ⁽²⁾. En otras poblaciones, no relacionadas étnicamente, se han descrito frecuencias significativamente menores; como en Francia con 4.9% para la mutación en el exón 19 y 5.9% para la del exón 21 ⁽¹⁷⁾. La frecuencia de mutaciones en el gen EGFR muestra diferencias significativas entre subgrupos étnicos y raciales, teniendo la mayor frecuencia los asiáticos no latinos (57%), seguido de latinos (23%), no latinos blancos (22%) y no latinos negros (10%) ⁽¹⁸⁾.

El análisis de las combinaciones genotípicas en el gen EGFR (L858R / del E746-A750), muestra que los genotipos más severos, es decir las combinaciones con homocigotos mutantes de la deleción, sólo están presentes en las biopsias de CPNM, lo cual sugiere la inestabilidad genómica característica de un tejido tumoral. Estos genotipos severos, representan un indicador en la identificación en tejido circulante de pacientes afectados con CPNM, para la óptima aplicación de la terapia con ITK y que a su vez resaltan la diferencia en marcadores EGFR circulantes entre sujetos afectados y sanos, como lo demuestra este estudio por la ausencia de tales combinaciones genotípicas en muestras de suero de sujetos sanos voluntarios de población abierta. La limitación en el tamaño de muestra de las biopsias CPNM, no tuvo efecto en la detección de las dos mutaciones EGFR, debido a que la selección de las muestras de estudio estuvo dirigida en la caracterización clínica y citopatológica idónea de CPNM, ya que, a pesar del bajo número de muestra, se detectaron ambas mutaciones y ocho de nueve combinaciones genotípicas. La combinación genotípica de dobles mutantes GG / 0/0, no se presentó en ningún tejido, abriendo la posibilidad, de que ésta no sea compatible con la vida.

En conclusión, la frecuencia de las mutaciones del gen EGFR en la población general local de Yucatán, estimada a partir de muestras de sueros, fue de 36.71% para la deleción del E746-A750 en el exón 19 y 50.99% para L858R en el exón 21. En tanto que, la distribución de las mutaciones en muestras de biopsia de cáncer de pulmón, resultó en 42.11% para cada mutación EGFR. El genotipo homocigoto para la deleción del exón 19 (0/0) solo se presentó en biopsia y ausente en muestras de suero de sujetos sanos, sugiriendo que la severidad de las mutaciones puede reflejar la inestabilidad genómica propia del tejido tumoral. Las combinaciones genotípicas obtenidas en el gen EGFR con presencia de al menos una mutación sugiere que, aproximadamente, 90% de la población estudiada, tendría buen pronóstico y buena respuesta al tratamiento con ITK.