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Introducción
Los aspectos más importantes en la producción de maíz son la presencia de plagas (que incluye enfermedades), y la fertilización. El control de las plagas se lleva a cabo con plaguicidas (Sennoi et al., 2013), mientras que la fertilización es a través del empleo de fertilizantes sintéticos. Ambas prácticas contaminan los mantos freáticos (Rebolledo et al., 2016) y el suelo (Sun et al., 2016), afectan la salud humana (Sturza et al., 2016) e inciden en la emergencia de patógenos resistentes a los pesticidas (Avenot et al., 2016).
Una de las principales enfermedades que se presentan en el cultivo del maíz a nivel mundial es conocida como “carbón de la espiga”, cuyo agente causal es el Sporisorium reilianum. Este patógeno puede llegar a causar elevadas pérdidas económicas. Se presenta en etapa de plántula causando una infección sistémica y los síntomas se manifiestan hasta la floración en el cultivo, remplazando la inflorescencia (Ghareeb et al., 2011). Bajo condiciones óptimas, la germinación de teliosporas se presenta en el suelo, se produce un basidio con cuatro basidiosporas, que se presentan en una forma similar a las levaduras. Cuando los tejidos son jóvenes, dos basidiosporas que son compatibles se fusionan y forman hifas dicarióticas infectivas que penetran las células epidermales de las plantas usando un apresorio. Posteriormente, el micelio se observa en todos los tejidos de las plantas, pero la esporulación solo se observa en la floración masculina y femenina (Ghareeb et al., 2011). Los factores determinantes en la presencia de la enfermedad son la temperatura (20-30 °C); la humedad relativa (15-25%); la densidad de teliosporas en el suelo; la susceptibilidad de las plantas de maíz; la fertilidad; el pH del suelo, así como la densidad de población (Matyac y Kommedahl, 1985).
El control de esta enfermedad se ha llevado a cabo, principalmente, empleando variedades resistentes; sin embargo, los genotipos no mantienen su resistencia de forma constante, esto depende de las condiciones ambientales. Otras formas de manejar la enfermedad son manteniendo la humedad relativa dentro de un rango aceptable durante la primera fase de desarrollo del cultivo, cuando las infecciones se presentan, además de otras prácticas culturales como son la rotación de cultivos. El control químico es recomendado, sin embargo, solo se ha llegado a un control del 30% (Pérez y Bobadilla, 2004). Por lo tanto, el control biológico es una alternativa viable en un esquema de manejo integrado de un cultivo (Compant et al., 2005).
Trichoderma es uno de los microorganismos antagonistas de patógenos que más han sido estudiados debido a su éxito (Bae et al., 2016). Patógenos como Rhizoctonia solani Bipolaris orizae, Fusarium spp, y Sclerotium rolfsii han sido controlados (Asad et al., 2014). Los probables mecanismos de control ejercidos por Trichoderma spp pueden afectar directamente al patógeno, ya sea por competencia de nutrientes, antibiosis o micoparasitismo, o indirectamente a través de la reducción de la resistencia de la planta (Saber et al., 2017). Escasa información sobre el control biológico de esta enfermedad ha sido generada (Mercado et al., 2014) por lo cual, los resultados de este estudio son un aporte valioso en cuanto al control sobre S. reilianum.
Por otro lado, los fertilizantes químicos han jugado un papel importante para mejorar el rendimiento de los cultivos en una agricultura intensificada (Ju et al., 2006), haciendo dependiente al productor de estos compuestos sintéticos. Sin embargo, el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados y los bajos resultados en cuanto a eficiencia en la agricultura, ha dado como resultado la reducción en la calidad del agua y emisiones de gases de efecto invernadero (Ju et al., 2009; Gabriel y Quemada, 2011; Cui et al., 2013). Trichoderma spp., también ha sido empleado en la agricultura como biofertilizante para aumentar tanto el crecimiento de las plantas, como el rendimiento de cultivos (Buysens et al., 2016).
El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de cepas de Trichoderma en el control de Sporisorium reilianum y aumentar el rendimiento en un cultivo de maíz en el Valle del Mezquital, Hidalgo, dando respuesta a la cuestión de si es posible o no controlar Sporisorium reilianum y aumentar el rendimiento del cultivo de maíz, a través de la inoculación de Trichoderma.
Materiales y Métodos
Este proyecto se desarrolló en la Universidad Politécnica de Francisco I. Madero, ubicada a 20°13’31.9’’N y 99°05’20.8’’W en el municipio de Tepatepec, Hidalgo. La fase experimental in vitro se realizó en el Laboratorio de Fitopatología de la misma institución, mientras que la fase experimental en campo se ubicó en el área agrícola. La investigación se llevó a cabo durante los ciclos de cultivo 2015-2016, bajo un manejo del cultivo recomendado para la región.
Material vegetal
Las semillas de maíz variedad Cimarrón empleadas para el establecimiento de los experimentos fueron proporcionadas por el INIFAP-Hidalgo, mismas que se encontraban libres de cualquier tratamiento químico, aparentemente sanas y sin daño alguno.
Material fúngico
Trichoderma
Se utilizaron cinco cepas de Trichoderma, tres de ellas (C1VM14, C2VM14 y C3VM14) fueron aisladas de los suelos del campo experimental de la Universidad Politécnica de Francisco I. Madero. La cepa Trichoderma C1VM14 fue aislada de una parcela donde se realiza investigación con labranza de conservación o labranza cero en el cultivo de maíz. Las cepas Trichoderma C2VM14 y Trichoderma C3VM14 fueron aisladas de dos parcelas donde se estableció un cultivo de lechuga. La identificación taxonómica de las cepas nativas se hizo mediante las claves reportadas por Chaverri et al. (2003). Las cepas restantes: Trichoderma viride (C4TVBr) y Trichoderma harzianum (C5THBr) fueron proporcionadas por la Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC por sus siglas en portugués) en Brasil.
Las cepas se activaron mediante la siembra en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA® Baker) y fueron incubadas a una temperatura de 28±2 °C durante 7 días. Cuando las colonias estuvieron maduras, se extrajo la masa fúngica de los medios de cultivo. El micelio obtenido fue mezclado por separado con agua estéril, para obtener así suspensiones de propágulos de las cepas.
Para determinar las concentraciones de suspensiones de cepas Trichoderma (1x106 UFC mL1) una cantidad de conidios fue contada en cámara Neubauer. Posteriormente la absorbancia de estas concentraciones fue medida empleando un espectrofotómetro de UV visible (Hach, Dr 6000, Germany).
Sporisorium reilianum
La cepa del hongo patógeno Sporisorium reilianum fue proporcionada por la Universidad Autónoma de Chapingo en conjunto con la Universidad Politécnica de Pachuca. Se reactivó con medio de cultivo YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose), y se mantuvo a temperatura de laboratorio.
Las esporas del hongo fueron mezcladas con suelo húmedo (1:100) 18 horas antes de su inoculación en las semillas de maíz.
Control de Sporisorium reilianum
Establecimiento de cultivos duales Trichoderma-Sporisorium
Bajo un Diseño Completo Aleatorizado, los hongos tanto patógeno como antagonista, fueron sembrados en cada extremo de la caja de Petri sobre medio de cultivo YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose). Para cada cepa de Trichoderma se establecieron cinco repeticiones. Los cultivos duales se mantuvieron a una temperatura de 25 °C en una incubadora (Scientific ®). Se realizaron observaciones de crecimiento cada 24 horas.
Para evaluar el porcentaje de colonización de Trichoderma sobre Sporisorium reilianum se utilizó la fórmula (Rollan et al., 1999):
Donde:
DRCT/SCP= Distancia recorrida por la colonia de Trichoderma sobre la colonia del patógeno en el eje que separa las dos colonias.
DEPS= Distancia entre los dos puntos de siembra. Los datos fueron tomados diariamente con un vernier digital hasta que la colonia de alguna de las cepas de Trichoderma cubrió completamente al patógeno.
Incidencia
Para la variable incidencia de la enfermedad fue necesario llevar a cabo revisiones del cultivo cada 15 días, y cuando la enfermedad se presentó, las revisiones se hicieron cada semana, contando el número de plantas por tratamiento que mostraron síntomas. Estos se observaron a los 98 días después de la siembra, coincidiendo con la época de floración (estación de verano). Después de colectar todos los datos se obtuvo el porcentaje de plantas enfermas por tratamiento.
Variables relacionadas con el rendimiento
Colonización de tejido vegetal por Trichoderma
Para la colonización de Trichoderma sobre diferentes tejidos de la planta de maíz (raíz, tallo y hojas), se seleccionaron 100 semillas. Las semillas fueron desinfestadas superficialmente con hipoclorito de sodio al 2% durante un minuto, se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron bajo condiciones de laboratorio. Las semillas secas, fueron colocadas en algodón estéril previamente humedecido con agua destilada estéril sobre un plato, éstos fueron cubiertos con bolsas plásticas, para permitir la germinación de las semillas y evitar la contaminación.
Para la inoculación de las semillas, se prepararon suspensiones con Trichoderma a una concentración de 1x106 UFC mL1 de cada una de las cinco cepas, empleando la misma metodología descrita arriba. Después de germinadas las semillas, cuando el hipocótilo tenía dos centímetros de largo, diez semillas para cada cepa del hongo fueron inoculadas con 20 µL de suspensión (en el hipocótilo), se incluyó un testigo sin tratar. Posteriormente, cuando las plantas alcanzaron 15-20 cm de altura se trasplantaron a macetas, las cuales contenían 3.5 kg de suelo previamente esterilizado en autoclave (FELISA®). Se utilizaron 10 macetas por tratamiento (seis tratamientos). Una evaluación de colonización se llevó a cabo 15 días después del trasplante, cada planta se consideró una unidad experimentada bajo un Diseño Completo Aleatorizado. Éstas fueron seccionadas en raíz, tallo y hojas. De cada sección se cortaron cinco fragmentos, los que se transfirieron a cajas de Petri con PDA (papa-dextrosa-agar). El experimento in vitro consistió de seis tratamientos incluyendo al control, con cuatro repeticiones y cinco réplicas por cada Caja de Petri. Cada 24 horas durante siete días se tomaron datos de cada una de las repeticiones establecidas (fragmentos colonizados) para tejido evaluado, cuando las colonias de los hongos fueron fácilmente reconocidas por su típica esporulación. La fórmula empleada para determinar colonización de tejido fue (De Souza et al., 2008):
Donde:
NFC= Número de fragmentos de tejido colonizado por Trichoderma por repetición.
NFT= Número de fragmentos totales por repetición.
Crecimiento de plantas de maíz
Para evaluar el crecimiento de plantas de maíz y conocer si Trichoderma tenía la capacidad de promover el crecimiento, se estableció una parcela experimental de 696 m2. Se empleó un diseño de bloques completos aleatorizados, que consistió de cuatro bloques con seis tratamientos cada uno.
Al momento de la siembra, las semillas fueron asperjadas (3 mL) con la suspensión de la cepa de Trichoderma correspondiente. Al mismo tiempo, se le agregaron 5 gr de suelo mezclado con esporas del patógeno antes de ser cubiertas con suelo de campo.
Los datos de altura de las plantas fueron tomados cuando apareció la primera hoja verdadera. Para ello se seleccionaron al azar diez plantas en cada uno de los tratamientos, en cada bloque, así como del testigo. La altura de cada planta fue tomada con un flexómetro, el cual se colocaba de la parte basal de la planta hasta la última hoja verdadera. La toma de datos se realizó hasta que la planta espigó.
Rendimiento
El rendimiento fue evaluado al momento que los granos de maíz mostraron una humedad del 14%, la cual fue tomada con un medidor de humedad en granos (John Deere ®). Para calcular el rendimiento fueron cortadas al azar 10 mazorcas de cada uno de los tratamientos con Trichoderma, así como del testigo. Los granos fueron separados del raquis con la finalidad de pesarlos por separado empleando una balanza granataria. De esta forma se obtuvieron peso de granos, raquis y total (considerando a una mazorca), se tuvieron por lo tanto, 10 repeticiones por tratamiento, por bloque, incluyendo al testigo. Las medias obtenidas por tratamiento fueron empleadas para hacer el cálculo para una hectárea y obtener el rendimiento.
Análisis estadístico
Los datos (medias de dos ciclos de cultivo) se sometieron a pruebas de normalidad (Shapiro Wilk) y homostacidad (Barret). Aquellos que no cumplían, como es el caso de los porcentajes, se transformaron con raíz cuadrada; para facilitar la interpretación de los resultados, estos se mostraron como valores sin transformar. La curva del progreso de la colonización por Trichoderma se calculó por medio del método de los polígonos, y las áreas resultantes fueron sometidas a análisis de varianza y a pruebas de separación de medias (Tukey, α = .05), esto se llevó a cabo mediante el programa Statistical Analysis System, versión 9 para Windows. Este mismo programa fue empleado para las variables restantes. El experimento in vitro fue repetido en dos momentos diferentes con todos los tratamientos y repeticiones.
Resultados y Discusión
Control de Sporisorium reilianum
Cultivos duales Trichoderma-Sporisorium
La colonización del antagonista sobre el patógeno mostró diferencias estadísticas significativas (P=0.013). La cepa antagonista con la mayor cobertura de colonización sobre S. reilianum fue la C2VM14 nativa (Cuadro 1), mientras que la cepa que tuvo la menor colonización sobre el patógeno correspondió a la C5THBr, una cepa no nativa.
Cuadro 1 Colonización in vitro de Sporisorium reilianum e incidencia en un cultivo de maíz para cada uno de los tratamientos
| Fuentes de variación | Medias de Incidencia* | Medias de colonización |
|---|---|---|
| T | (%) | ABC |
| 21.875a | 0 c | |
| C1VM14 | 17.875a | 352.12 ba |
| C2VM14 | 17.625a | 399.06 a |
| C5THBr | 15.875a | 238.54 b |
| C3VM14 | 12.875a | 238.93 b |
| C4TVBr | 8.310b | 332.02 ba |
| R2 | 0.44 | 0.64 |
*Medias con letras iguales indican que no hay diferencia estadística significativa (Prueba de Tukey; p ≤ .05). C1VM14= cepa nativa de Trichoderma aislada de suelo cultivado con lechuga, C2VM14 y C3VM14= cepa nativa de Trichoderma aislada de suelo con labranza cero, C4TVBr= Cepa no nativa de Trichoderma viride aislada de suelo cultivado con cacao y C5THBr= Cepa no nativa de Trichoderma harzianum aislada de suelo cultivado con cacao, T= testigo.
Fuente: elaboración propia.
Trichoderma spp ha sido reconocido en diversos estudios como inhibidor del crecimiento de patógenos debido a su rápido crecimiento, inhibiendo a fitopatógenos como son Fusarium spp (90.65%), Verticillium dahliae (75%), Alternaria alternata (63%) and Colletotrichum capsici (71%) (Kouipou et al., 2016, p. 8-20, Sharma et al., 2017, p. 12-17), patógenos de importancia en la agricultura por las pérdidas que causan en cultivos de importancia agrícola.
De forma similar a lo mostrado en este estudio, se ha encontrado a T. viride con un porcentaje significativo de colonización sobre Colletotrichum gloeosporioides, mientras que Trichoderma harzianum obtuvo los menores valores (Landero et al., 2015), ambas son cepas no nativas, lo que indica en este caso que las condiciones de desarrollo de estas cepas no condicionaron su efectividad como antagonista.
Incidencia
De acuerdo con el análisis de varianza se encontró diferencia estadística significativa entre tratamientos (P=0.03). El testigo presentó el mayor valor (21.875 %), mientras que el menor valor en incidencia se encontró con el tratamiento C4TVBr con una media de 8.310 %, el resto de los tratamientos tuvo un comportamiento similar al testigo (Cuadro 1). Lo anterior demuestra que para el presente trabajo solo Trichoderma viride (C4TVBr) tuvo actividad biocontroladora sobre S. reilianum. Otros autores mencionan que cuando Trichoderma fue inoculado en plantas de pepino, la reducción de daños causados por Fusarium oxysporum fue significativamente variada, lográndose hasta un 71.67 % con Trichoderma asperellum (Saravanakumar et al., 2016).
En diferentes estudios se ha demostrado que Trichoderma spp tiene un amplio espectro en el control de patógenos de importancia agrícola en campo como son: Curvularia orizae, Botrytis cinerea, Fusarium spp., Pythium spp., Rhyzoctonia spp., Cylindrocarpon destructans, entre otros (Zeilinger y Omann, 2007; Sunpapao et al., 2018; Young et al., 2018). De manera específica, Trichoderma viride ha sido encontrado como biocontrolador de hongos del suelo (Hao et al., 2000), y S. reilianum es un hongo que sobrevive en las mismas condiciones, para después infectar a plantas de maíz.
Variables relacionadas con el rendimiento
Porcentaje de colonización por Trichoderma spp. en diferentes tejidos de la planta de maíz
El porcentaje de colonización de Trichoderma muestra diferencias estadísticas significativas entre raíz, tallo y hojas (P=0.0004). La mayor colonización se presentó en tejido de raíz. El mayor porcentaje de colonización fue más alto en las partes más cercanas al punto donde la suspensión de esporas fue originalmente aplicada, y más bajo en partes alejadas del punto de aplicación (Cuadro 2). Los testigos de cada tejido no mostraron desarrollo del hongo. Al respecto, cuando cepas de Trichoderma spp fueron inoculadas en cacao se tuvo un comportamiento similar, aunque a diferencia del presente estudio, una cepa de Trichoderma spp no pudo colonizar las partes aéreas de las plantas de cacao (De Souza et al., 2008). Ya se ha demostrado que las raíces son más fácilmente colonizadas por cepas de Trichoderma¸ que otros órganos de la planta (Tlapal et al., 2014, p. 61-74). También se pudo observar que dos cepas obtuvieron la mayor colonización (C1VM14 y C5THBr), una fue una cepa nativa y la otra una no nativa, lo que indica que para este estudio es indiferente el entorno de desarrollo de estas cepas (Cuadro 2).
Cuadro 2 Medias de colonización de raíces, tallos y hojas de plantas de maíz por Trichoderma spp., así como diferencias entre tratamientos
| Tejido vegetal | Colonización (%) | Tratamiento | Colonización (%) |
|---|---|---|---|
| Raíz | 53.33a* | C1VM14 | 50.00a* |
| Tallo | 31.64b | C2VM14 | 33.33b |
| Hoja | 19.99c | C3VM14 | 16.60c |
| Testigo | 0d | C4TVBr | 33.33b |
| R2 | 0.92 | C5THBr | 50.00a |
| Testigo | 0.00d | ||
| R2 | 0.93 |
*Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey P≤.05). Los datos fueron transformados a raíz cuadrada; sin embargo, para una mejor interpretación, las medias son presentadas en las unidades en que fueron tomados los datos. C1VM14= cepa nativa de Trichoderma aislada de suelo cultivado con lechuga, C2VM14 y C3VM14= cepa nativa de Trichoderma aislada de suelo con labranza cero, C4TVBr= Cepa no nativa de Trichoderma viride aislada de suelo cultivado con cacao y C5THBr= Cepa no nativa de Trichoderma harzianum aislada de suelo cultivado con cacao.
Fuente: elaboración propia.
Crecimiento de plantas de maíz
Los datos analizados demuestran que existe diferencia estadística altamente significativa entre tratamientos (P<0.0001). El crecimiento se vio influenciado positivamente con los tratamientos C1VM14, C2VM14, C4TVBr y C5THBr, los cuales fueron estadísticamente diferentes al testigo, con el que se encontró el menor valor (Cuadro 3). Caso contrario, Tlapal et al. (2014) encontraron que cuando se inoculó Trichoderma harzianum y otros tratamientos a base de bacterias no se encontraron diferencias estadísticas significativas en la variable crecimiento de plantas. Sin embargo, se ha demostrado que diferentes especies de Trichoderma son promotoras del crecimiento de plantas cultivadas (Rojan et al., 2010; Fontenelle et al., 2011; Larsen et al., 2017).
Cuadro 3 Rendimiento de un cultivo de maíz y altura de plantas inoculadas con cepas de Trichoderma
| Fuentes de variación | Medias de Rendimiento* (g) | Rendimiento obtenido por hectárea (kg) |
Medias de altura (mm) |
|---|---|---|---|
| C5ThBr | 132.13a | 13,213 | 1073.94a |
| C4TvBr | 111.44ba | 11,144 | 986.73a |
| C3VM14 | 103.35ba | 10,335 | 560.43b |
| C1VM14 | 102.19b | 10,219 | 1001.19a |
| C2VM14 | 101.32b | 10,132 | 1013.83a |
| T | 95.18b | 9,518 | 506.92b |
| R2 | 0.60 | 0.72 |
*Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey P≤.05). C1VM14=Cepa nativa de Trichoderma aislada de suelo cultivado con lechuga, C2VM14 y C3VM14= cepa nativa de Trichoderma aislada de suelo con labranza cero, C4TVBr= Cepa no nativa de Trichoderma viride aislada de suelo cultivado con cacao y C5THBr= Cepa no nativa de Trichoderma harzianum aislada de suelo cultivado con cacao, T= testigo.
Fuente: elaboración propia.
Al respecto de las discrepancias mencionadas, se ha encontrado que existen diferencias en cuanto al comportamiento y síntesis de metabolitos secundarios entre especies y cepas que se han desarrollado en condiciones ambientales diferentes, lo cual puede explicar la diferencia de resultados (Polizzi et al., 2011; Bulgarelli et al., 2013; Kai et al., 2016).
Rendimiento
Cuando los datos obtenidos de rendimiento fueron analizados, se encontraron diferencias estadísticas altamente significativas (<.0001) entre los diferentes tratamientos. La cepa C5THBr no nativa mostró el mayor valor de rendimiento (Cuadro 3), el cual aumentó en un 38.8% comparado con el testigo; cabe hacer notar que fue con esta misma cepa que se obtuvo la mayor altura de las plantas de maíz. La cepa C2VM14 nativa mostró el menor valor de rendimiento, pero con ésta se obtuvo el mejor control in vitro del patógeno. Esta información indica que cepa C5THBr no nativa tiene una mejor función como biofertilizante que como antagonista en el cultivo de maíz en zonas semiáridas.
Buysens et al., (2016) encontró resultados parecidos cuando se hicieron inoculaciones de Trichoderma al suelo, donde posteriormente se estableció un cultivo de papa, el rendimiento incrementó debido a que el tamaño de los tubérculos fue mayor. Por su parte, Xue et al. (2017) demostraron que con la inoculación de Trichoderma spp en un cultivo de trigo, el rendimiento aumentó en un 11.0%, valor menor que el obtenido en el presente trabajo.
Conclusiones
En cuanto a control de Sporisorium reilianum, se observó que la cepa C2VM14 nativa de Trichoderma fue la que mostró la mayor colonización del patógeno (ABC 399.06), siendo diferente estadísticamente del resto de los tratamientos. Por otro lado, con la aplicación de la cepa C4TVBr no nativa, la incidencia de la enfermedad solo se presentó con un valor de 8.31%, mientras que el testigo alcanzó el máximo valor (21.875%). La colonización por Trichoderma sobre las diferentes secciones de una planta de maíz mostró diferencias estadísticas significativas, presentándose la mayor colonización en las raíces (53.3%), mientras que las hojas fueron las menos colonizadas (19.9%). En lo que a crecimiento de plantas se refiere, las cepas tuvieron un comportamiento similar, mostraron una influencia positiva en la altura, a excepción de la C3VM14 nativa. El rendimiento aumentó con la inoculación de las cepas C3VM14 nativa, C4TVBr no nativa y C5THBr no nativa, notándose un incremento hasta del 38.8% con esta última, y hubo diferencia estadística significativa con el resto de los tratamientos. Lo anterior nos indica que para este estudio las cepas de Trichoderma tanto nativas como no nativas pueden tener un efecto en el control de Sporisorium reilianum, así como en el aumento del rendimiento del cultivo del maíz. Es relevante mencionar que es necesario continuar con estudios acerca de las cepas en cuestión y evaluar otras variables de interés para tener mayor conocimiento sobre la forma en que se logra el control y el aumento del rendimiento.
