Coinóculos bacterianos solubilizadores de fosfato

Los coinóculos bacterianos solubilizadores de fosfato usados en este estudio se seleccionaron por su alta capacidad in vitro para solubilizar fosfato tricálcico y por su efecto positivo en el desarrollo y crecimiento de maguey espadín (Agave angustifolia Haw.) en condiciones semi-controladas (^{Fernández-Téllez, 2016}). Las bacterias solubilizadoras de fosfato (BSF) empleadas pertenecen a los géneros Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter y Bacillus y se aislaron de suelos semiáridos cultivados con maguey espadín en el distrito de Tlacolula, Oaxaca (México). Cada cepa se reactivó mediante la inoculación en medio selectivo agar Sundara Rao y Sinha (SRS) (^{Sundara y Sinha, 1963}). Posteriormente, se prepararon suspensiones bacterianas individuales en solución salina estéril al 0.85% a una concentración celular de 1.5 × 10⁸ células ml^-1. Para preparar los pre-coinóculos bacterianos se tomó 0.1 ml de la suspensión bacteriana de cada cepa no antagónica, se inocularon conjuntamente en caldo nutritivo y se incubaron a 30 °C durante 48 h. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se tomaron 5 ml del pre-coinóculo bacteriano y se reinocularon en 45 ml de caldo nutritivo previamente esterilizado para posteriormente incubarse a 30 °C durante 48 h en agitación constante a 150 opm en una incubadora-agitadora. Para la obtención del coinóculo, el pre-coinóculo se centrifugó a 10 mil rpm durante 10 min. El pellet celular obtenido por centrifugación se diluyó a una concentración celular de 15×10⁸ células ml^-1 de acuerdo con la escala de Mc Farland. Bajo un diseño completamente al azar, se evaluaron cinco tratamientos: (T₁) Enterobacter sp. + Pseudomonas sp.; (T₂) Bacillus sp. + Pseudomonas sp.; (T₃) Acinetobacter sp.+ Pseudomonas sp.; (T₄) Pseudomonas putida (cepa comercial) y un control (sin coinóculo).

Material vegetal

Se utilizaron semillas de cuatro especies de agaves silvestres: tobalá (Agave potatorum Zucc.), sierrudo (Agave spp.), cuishe (Agave spp.) y coyote (Agave spp.) colectadas en el municipio de Santa Catarina Minas (96° 38´N, 16°47´O) a 1560 m., perteneciente al distrito de Ocotlán de Morelos, Oaxaca (México). Antes de iniciar el trabajo experimental se eliminaron las semillas rotas o con daños por insectos o patógenos, después se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1.5% durante 10 min., luego se lavaron repetidamente con agua destilada estéril. Previo a la siembra, las semillas de las cuatro especies de agave evaluadas se imbibieron en cada uno de los coinóculos bacterianos solubilizadores de fosfato durante 60 min., se incluyó también un control donde la imbibición de las semillas se hizo en agua destilada estéril. La siembra se llevó a cabo en charolas de unicel de 200 cavidades con suelo de la zona de colecta de las semillas, se depositó una semilla por cavidad y se realizaron riegos cada tercer día. El experimento se estableció en condiciones semi-controladas dentro de un macro túnel.

Variables evaluadas

Se realizaron observaciones diarias del número de plantas emergidas por tratamiento (E), con esta información se determinó el índice de velocidad de emergencia (IVE), para ello se utilizó la fórmula propuesta por ^{Maguirre (1962)}. Dos meses después de la siembra se determinó la longitud de la hoja (LH), el diámetro de tallo (DT) y la longitud de la raíz más larga (LR) con un vernier digital marca Mitutoyo, se determinó también el peso seco de hoja (PSH), peso seco de tallo (PST) y peso seco de raíz (PSR), para ello se utilizó una balanza analítica digital marca Ohaus. Para las variables E e IVE cada tratamiento consistió de cinco repeticiones con 20 semillas cada una, para las variables de crecimiento y biomasa se consideraron 10 plantas por tratamiento.

Análisis estadístico

Los datos se sometieron a análisis de varianza y pruebas de comparación múltiple de medias (Tukey 0.05), con el paquete estadístico SAS®, versión 9.1 (^{Statistical Analysis System [SAS], 2004}).

Efecto de coinóculos bacterianos solubilizadores de fosfato en la emergencia de especies silvestres del género Agave

En comparación con el control T₂ incrementó el E y el IVE en las especies sierrudo y tobalá. El e incrementó 94.5% en sierrudo y 81.5% en tobalá. El IVE aumentó136.7% en sierrudo y 111.3% en tobalá. T₁, T₃ y T₄ no mostraron un incremento significativo en estas variables respecto al control (Cuadro 1). Resultados similares a los reportados en este estudio fueron obtenidos por ^{Kishore et al. (2005)} quienes encontraron incrementos respecto al control sin inocular de 95.3%, 97.9% y 96.3% en la emergencia de plántulas de Arachis hipogea con la inoculación de Bacillus firmis GRS 123, Bacillus megaterium GPS 55 y Pseudomonas aeruginosa GPS 21, respectivamente. Haameda et al. (2006) reportaron incrementos en los porcentajes de germinación de semillas de maíz con Pseudomonas sp. CDB 35 (89%) y Pseudomonas sp. BWB 21 (87%) con respecto al control. ^{Sharma et al. (2007)} obtuvieron 100% de germinación en semillas de Cicer arietunum con Pseudomonas fluorescens y Bacillus megaterium. ^{Demissie et al. (2013)} evaluaron germinación en semillas de Vicia faba, con relación al control, obtuvieron incrementos de 21.4% con el consorcio Pseudomonas sp. + Rhizobium spp. El T₂ empleado en este estudio incluye especies de los géneros Bacillus y Pseudomonas, lo que confirma que las especies bacterianas de estos géneros son buenas promotoras del crecimiento vegetal. ^{Gholami, Shahsavani y Nezarat (2009)} reportaron incrementos de 18.5% en la germinación de semillas de maíz con el uso de inoculantes bacterianos. Estos autores indicaron que el efecto positivo en la germinación de las semillas se podría deber a que las BSF producen hormonas que favorecen la germinación, como las giberelinas, las cuales promueven la actividad de enzimas específicas promotoras de la germinación tales como la α-amilasa que incrementa la asimilación de almidón, lo cual se ve reflejado en la longitud de la plúmula y la radícula.

Efecto de coinóculos bacterianos solubilizadores de fosfato en el crecimiento de especies silvestres del género Agave

Con respecto al control, la LH en sierrudo incrementó 40.6 y 34.3% con T₂ y T₁, respectivamente. En tobalá aumentó 40.0% con T2 y 32.0% con T₃ y en cuishe incrementó 14.6% con T₃. La LR incrementó 241.67% en sierrudo y 111.1% en cuishe con T₄. El DT únicamente incrementó en tobalá 50% con T₁ (Cuadros 2 y 3).

Estos incrementos en el crecimiento de las plántulas probablemente se pueden atribuir a dos factores: 1) a un incremento en la elongación y multiplicación celular debido a una mayor absorción nutrimental, principalmente de fósforo, promovido por la inoculación con las BSF (^{Bhattacharyya y Jha, 2012}) y; 2) a la producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal por las BSF (^{Podile y Kishore, 2006}; ^{Appanna, 2007}). ^{Bautista-Cruz et al. (2015a)} reportaron un incremento de 30.1% en la LR y de 34.7% en la altura de plántulas de Hylocereus undatus inoculadas con BSF.

^{Ghanem y Abbas (2009)} indicaron un aumento en la altura de la planta, número de ramas, número de vainas, peso del grano y rendimiento en Vigna radiata después de la inoculación con B. megaterium en suelos salinos. Otras investigaciones han reportado aumentos en la altura de plantas de arroz con la inoculación de P. fluorescens (^{Hameeda et al., 2008}; ^{Gandi y Sivakumar, 2010}). ^{Bautista-Cruz et al. (2015b)} encontraron incrementos de 13.6% en el DT y de 58.4% en la LR de plantas de Agave angustifolia Haw. con la inoculación de BSF. El incremento en la LR se puede atribuir al efecto positivo de los inoculantes, los cuales promueven una elevada acumulación de nutrientes en las raíces, así como también la producción de fitohormonas que estimulan un mayor desarrollo radical (^{Demissie et al., 2013}). ^{Vassilev, Vassileva y Nikoaeva (2006)} indicaron que las bacterias promotoras del crecimiento vegetal, como las BSF, también pueden sintetizar compuestos bioactivos que suprimen algunos organismos fitopatógenos de la raíz. Estos procesos en conjunto pueden incrementar la absorción de agua y nutrientes lo que contribuye a un mayor crecimiento radical. En este estudio, el T₄ (Pseudomonas putida) fue el inoculante que promovió una mayor LR, posiblemente porque muchas cepas de Pseudomonas producen acido-3-indol acético, el cual promueve la elongación radical y estimula el desarrollo de pelos radicales (^{Dowling y O’Gara, 1994}).

En comparación con el control, el PSH incrementó en sierrudo (331.2%), tobalá (700%) y coyote (400%) con T₁. El PSH también incrementó en sierrudo (325.0%) y en cuishe (112.5%) con T3. El PST aumentó 107.4% en sierrudo con T₁ y 64.2% en coyote con T₄. El PSR incrementó 171.4% en cuishe con T₁, 133.3% en sierrudo con T₂ y T₄ (Cuadros 4 y 5). ^{Bautista-Cruz et al. (2015b)} reportaron incrementos de 12.1 y 17.8% en el peso seco aéreo y de raíces en plantas de Agave angustifolia Haw. inoculadas con BSF. ^{Bautista-Cruz et al. (2015a)} obtuvieron un incremento de 23.3% en el peso seco de plantas de Hylocereus undatus inoculadas con BSF. ^{Demissie et al. (2013)} encontraron incrementos en el peso fresco total y peso de raíces de Vicia faba con Pseudomonas sp. + Rhizobium sp. El incremento observado en las variables morfométricas de las plántulas de los agaves silvestres se puede atribuir posiblemente a la acumulación de nutrientes en los tejidos vegetales, provenientes de fuentes orgánicas e inorgánicas de fosfato presentes en el suelo, mineralizadas y/o solubilizadas gracias a la actividad de las BSF.