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Introducción
La cría y mantenimiento de colonias de mosquitos de importancia médica en condiciones de insectario son una parte crucial de la investigación operativa en salud pública, en específico para la prevención y control de enfermedades transmitidas por vectores. Actividades como la evaluación de estrategias operativas, evaluación de resistencia a insecticidas, pruebas de eficacia biológica, estudio de la biología y ecología de las especies, educación para la salud, y colecciones entomológicas, son algunos ejemplos en donde el material biológico producido es empleado para generar evidencias que fortalezcan la toma de decisiones en el programa de vectores en los diferentes niveles de gobierno en México.1Sin embargo, los procesos de crianza de mosquitos Aedes aegypti bajo condiciones de laboratorio a menudo representan un gran desafío debido a que se debe garantizar la homologación o sistematización de las colonias del material biológico. Uno de los grandes retos, es el método y fuente de alimentación. Las hembras de muchas especies de mosquitos son anautógenas2, es decir, deben ingerir sangre de vertebrados para adquirir las proteínas necesarias para la producción de huevos.3 Este tipo de reproducción es común en todos los vectores de agentes causales que se transmiten por la sangre y las transmiten a los humanos. Ejemplo de ello es el Aedes aegypti vector de arbovirus, flavivirus, togavirus entre otros.4 El sistema endócrino de los mosquitos se conforma por glándulas que producen hormonas con efectos sobre diversos procesos fisiológicos fundamentales para el crecimiento y desarrollo, entre otros, la reproducción. En el caso de los mosquitos Aedes aegypti, las hembras dependen de los nutrientes presentes en la sangre que ingieren y que funciona como materia prima para la yema y como un activador de la secreción de hormonas.5 En las instalaciones del Centro Regional de Control de Vectores de Oaxtepec de Servicios de Salud de Morelos; se produce la cepa silvestre de Aedes aegypti procedente de diversas localidades del estado Morelos y de otras entidades de México, para el desarrollo actividades tales como: vigilancia entomovirológica y monitoreo de resistencia a insecticidas, por lo que se requiere de una producción constante, abundante y estandarizada para apoyar la investigación operativa sobre diversas arbovirosis endémicas tales como: dengue, Zika, Chikungunya, por citar algunas. Históricamente en el insectario se ha utilizado la técnica de alimentación directa con sangre de conejo raza Nueva Zelanda. El objetivo de este estudio, fue evaluar el efecto de tres fuentes de sangre (conejo Nueva Zelanda, rata egipcia y humana) sobre el número de huevos por puesta y el porcentaje de eclosión de las larvas de Aedes aegypti en condiciones de insectario.
Materiales y métodos
Se realizó un estudio experimental con mosquitos hembras Aedes aegypti de 1 día post-emergencia con asignación aleatoria de la fuente sanguínea por jaula de emergencia.
Material biológico
Los huevos parentales de las cepas silvestres de Aedes aegypti, se obtuvieron de papeletas provenientes de localidades de riesgo de transmisión de arbovirosis, estratificadas de la vigilancia entomológica con ovitrampas en México. 6 Las condiciones para el crecimiento y mantenimiento de inmaduros y adultos (fase acuática y aérea) fueron de 26±2°C, 24±2°C de temperatura y 80±10%, 60±10% humedad relativa, respectivamente, con un fotoperiodo de 12L:12O. Para activar la embriogénesis, los huevos fueron sumergidos en 1,5 litros de agua declorada y desoxigenada en charolas de plástico (tamaño 25x20x5 cm), en cada charola se adicionó alimento a base de croqueta de ratón, molido y esterilizado7 (0.1g para las larvas de 1er estadio, 0.2g para las larvas de 3er y 4to estadio una vez al día), las larvas se crían y mantienen hasta llegar a la fase de pupa, en ésta etapa son sexadas por morfometría y transferidas a cámaras plásticas de emergencia con capacidad de 500ml.1Los adultos sanos emergidos son transferidos aleatoriamente a jaulas de emergencia 30x30x30cm, donde se les mantiene hidratados a través de torundas de algodón con solución glucosada al 10%; las cuales son retiradas 6 horas antes de la alimentación sanguínea. El número promedio de huevos por hembra fue cuantificado por ovipuesta; y el porcentaje de eclosión medido como el porcentaje del total de larvas nacidas sobre el número total de huevos, ambas variables medidas por cada tipo de alimentación sanguínea.
Alimentación Sanguínea
Se evaluaron tres diferentes fuentes sanguíneas: conejo Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) figura 1A, rata egipcia (Rattus norvegicus) figura 1B y humana, figura 1C. La sangre de conejo y rata se obtuvo de los organismos criados en el bioterio del Centro Regional de Control de Vectores y fue administrada a través de alimentación directa. Los conejos fueron rasurados en la región dorsal y se colocaron en la jaula, en apego a los lineamientos establecidos en la guía operativa insectario6 y con un trato humanitario por parte del personal tomando en consideración la Norma Oficial 062-ZOO-1999, especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.8 Las ratas egipcias se inmovilizaron en un saco de tela tricot, exponiéndose dentro de la jaula. En ambos modelos el tiempo de exposición en las jaulas fue de 30 min. La sangre humana se suministró a través de una membrana artificial de algodón impregnada con la sangre y colocada sobre un recipiente con agua a 65°C, colocada dentro de la jaula por un periodo de 30 min.
Fuente: colección de fotografías 1ª. Miriam Vázquez Anzúrez, 1B y 1C. Mariana Irina González Fernández
Figura 1A Alimentación de hembras Aedes aegypti con sangre de conejo Nueza Zelanda. 1B. Alimentación de hembras Aedes aegypti con sangre de raja egipcia y 1C. Alimentación de hembras Aedes aegypti con sangre de sangre humana
Cuantificación del número de huevos por ovipuesta
En 3 jaulas, se colocaron 48 hembras y 69 machos de Aedes aegypti parentales de la misma edad y se procedió con la alimentación descrita anteriormente para cada fuente sanguínea. Una vez garantizada la alimentación se colocó una ovitrampa, con las siguientes características: recipiente negro de capacidad de 1L con 20ml agua declorada, con un papel filtro húmedo marca Whatman del número 1, colocado al interior sobre las paredes y fondo como sustrato de ovipostura, previamente con una cuadricula de 4x4cm. Esta secuencia se repitió 11 veces cada 3er día en cada una de las jaulas. En cada papel filtro, se contabilizó y registró el número de huevos puestos. Porcentaje de eclosión a las 48 horas posteriores a la alimentación sanguínea Se retiraron los filtros con huevos obtenidos de cada una de las jaulas y se embrionaron para continuar con el proceso de eclosión, que consiste en sumergir el papel filtro con los huevos de la filial 1 en charolas de plástico con la misma metodología de siembra de los huevos parentales descritos anteriormente1 y al segundo día se inició la contabilización y registro del número de larvas nacidas por cada uno de los tipos de fuente sanguínea hasta el día 7°.
Análisis estadístico
El número promedio de huevos por hembra; y el porcentaje de eclosión generados por cada tipo de alimentación sanguínea, fueron analizados con el software STATA versión 13, a través de la prueba no paramétrica de Kruskal-wallis considerando un valor de p ≤ 0.05 como estadísticamente significativo.
Resultados
Número de huevos por ovipuesta
En el cuadro 1, se puede observar que la cantidad de huevos puestos por las hembras Aedes aegypti por diferentes fuentes de alimentación sanguínea fue en promedio de 209.08 ±107.53 para la alimentación directa con sangre de conejo, de 671.25 ± 401.97 para la alimentación directa con sangre de rata y de 268.14 ± 230.06 para la alimentación con sangre humana. Se observó que existe diferencia significativa, entre el número de huevos puestos por las hembras Aedes aegypti alimentadas con diferentes fuentes de sangre (X2= 10.666, P < 0.0048); en donde, las hembras que consumieron sangre de rata generaron una mayor cantidad de huevos seguidas de la alimentación con sangre humana y finalmente con sangre de conejo, figura 2. Así mismo, se encontró que 50% de los filtros obtenidos de la jaula cuyas hembras fueron alimentadas con sangre de conejo, tenían 178 huevos o menos. En los filtros de las jaulas con alimentación con sangre de rata, 50% de ellos presentaron 623 huevos o menos y finalmente en 50% de los filtros obtenidos de las jaulas cuyas hembras se alimentaron con sangre humana presentaron 199 huevos o menos.
Porcentaje de eclosión
El porcentaje de larvas eclosionadas procedentes de los huevos de mosquitos Aedes aegypti embrionados entre las diferentes fuentes de alimentación sanguínea (tabla 1), no presentó diferencias estadísticamente significativas en su eclosión (X2= 0.192, P < 0.9083). En 50% de los filtros con huevos de hembras alimentadas con sangre de conejo, eclosionaron 37 larvas o menos. En los filtros con huevos de hembras alimentadas con sangre de rata, 50% de ellos eclosionaron 41 larvas o menos y finalmente en 50% de los filtros con huevos de hembras alimentadas con sangre humana eclosionaron 51 larvas o menos.
Tabla 1 Comparación entre el número de huevos de mosquitos Aedes aegypti y porcentajes de eclosión por fuente de alimentación sanguínea en condiciones de insectario.
| Aedes aegypti | ||
|---|---|---|
| Fuente de alimentación | Número de Huevos x ± SE | % Eclosión 𝐱 ± SE |
| Sangre de conejo | 209.08 ± 107.53 | 51.27 ± 21.71 |
| Sangre de rata | 671.25 ± 401.97 | 49.69 ± 29.13 |
| Sangre humana | 268.14 ± 230.06 | 51.36 ± 3.78 |
Fuente: base de datos de emergencia de larvas Aedes aegypti por fuente de alimentación
Discusión
Los resultados obtenidos en este estudio, son consistentes con otros ensayos sobre el efecto que tiene en el número de huevos por puesta y eclosión dependiendo de la fuente de alimentación sanguínea sobre los mosquitos Aedes aegypti en condiciones de insectario.3 Debido a que la cantidad de huevos por puesta de los mosquitos se ve afectada por factores como: la especie,9 tamaño corporal,2,10hospedero,11 ingesta de sangre12 y aminoácidos eritrocitarios.3,13La evidencia generada en los procesos de crianza bajo condiciones del insectario indica que la sangre humana no se recomienda para la producción de colonias de mosquitos por cuestiones de bioseguridad y bioética, ya que existen otras fuentes de alimentación sanguíneas que resultan ser bastante eficientes y fácilmente disponibles en comparación con la humana, tal como lo reporta Gunathilaka 201714 y Phasomkusolsil 2013, este último encontró que la cantidad media de huevos puestos por Aedes aegypti que se alimentó con sangre de oveja fue de 42.3 huevos + 14.0 significativamente menor que la sangre humana (101.0 huevos +21.0), la alimentación directa en sangre de hámster (95.0 huevos +13.1) y la sangre de conejillo de indias (61.7 huevos +13.6), a pesar de no haber sido estadísticamente significativos los porcentajes medios de huevos incubados asociados con cada fuente de sangre (P> 0.05).3 Sin embargo, de acuerdo con la literatura disponible, las hembras Aedes aegypti optan por sangre de mamíferos huéspedes con preferencia por la sangre humana en varias ocasiones durante su ciclo gonotrófico, inclusive en presencia de hospederos alternativos.14,15por lo que en este estudio la sangre humana se empleó como un control. Es importante considerar las técnicas apropiadas para inmovilizar aquellos vertebrados con comportamientos más defensivos, pero que resultan ser buena fuente de alimentación para garantizar así la supervivencia y reproducción de los mosquitos en el insectario16 a fin de garantizar posibles sesgos en cuanto a la ingesta de sangre por parte de las hembras de mosquitos por esta causa. Cabe señalar, que en este estudio, la membrana empleada para suministrar sangre humana no contaba con una fuente de dióxido de carbono (CO2). Lo cual influyó posiblemente en la alimentación de las hembras, ya que los mosquitos suelen ser atraídos, además de la temperatura, por la emisión de CO2 de los organismos vivos e impactar en el número de huevos por puesta de los mosquitos alimentados con sangre humana fuera menor que los alimentados con sangre de rata.
Conclusiones
El uso de sangre de rata egipcia como fuente de alimentación sanguínea para la producción de mosquitos Aedes aegypti en condiciones de insectario garantiza una buena producción de huevos de mosquitos; sin embargo es importante realizar más evaluaciones sobre la viabilidad de los huevos debido a que en este estudio los porcentajes de eclosión no fueron estadísticamente significativos. Y por lo tanto, es importante considerar el sustituir la fuente de alimentación empleada (sangre de conejo) en la producción de mosquitos Aedes aegypti en el insectario del Centro Regional de Control de Vectores, debido a que fue la que menos huevos produjo significativamente en comparación con la sangre de rata o humana.
Financiamiento
Ninguno.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses
