Materiales y métodos

Origen del material vegetal. Los árboles parentales de M. guatapensis se encontraron en el municipio de Yarumal, norte del departamento de Antioquia a 2,265 m snm (7° 04’ 20.01’’N, 75° 26’ 45.31’’O; Figura 1), con una temperatura media de 14 °C y una precipitación media anual de 4,000 mm, correspondiente a un ecosistema de bosque pluvial montano bajo (bp-MB) (^{Idárraga-Piedrahita et al. 2011}) El criterio de selección para los árboles parentales se definió al evaluar el total de la población (96 individuos), aquellos que se encontraban en etapa reproductiva (fructificación).

Source: Esri, HERE, Germin, Intermap, incrementP Corp., GEBCO, USGS, FAO, NPS, NRCAN, GeoBase, IGN, Kadaster NL, Ordnance Survey, Esri Japan, METI, Esri China (Hong Kong), (c) OpenStreetMap contributors, and the GIS User Community

Figura 1 Localización de los árboles parentales de Magnolia guatapensis en la reserva Los Magnolios-Corporación Salvamontes. Yarumal-Antioquia, Colombia. 

A continuación, se describen las evaluaciones realizadas en las etapas de fruto, semilla y plántula.

Fruto.- Se colectaron ocho frutos cerrados en agosto de 2020, se dejaron expuestos a temperatura ambiente (22 °C) hasta que completaron su dehiscencia natural, trascurridos ocho días, las semillas y el forúnculo se retiraron del carpelo, se removió la sarcotesta de forma manual. Se midieron las siguientes variables: longitud y ancho de frutos (mm), peso fresco (g), peso seco del pericarpio (g), número de carpelos por fruto, longitud y ancho de los carpelos (mm), número de semillas por carpelo, número total de semillas por fruto, peso fresco del conjunto carpelar (mm), longitud del receptáculo (mm), peso fresco del receptáculo (g). Se hizo una descripción de los frutos, con los datos promedio de los mismos. Todas las mediciones se hicieron con balanza analítica (AXIS, ACN220G) y pie de rey digital (Digital Caliber, Stainless hardened 150mm 6" fracción).

Semillas.- Se obtuvieron 450 semillas, las cuales se clasificaron según el estado de desarrollo en: semilla madura, inmadura, perforada. Se consideró semilla madura, aquella con la sarcotesta totalmente formada y de coloración uniforme, semilla inmadura aquella de color negro en sarcotesta y testa, así como un tamaño reducido (< 3.0 mm) y semilla perforada o dañada, aquella que tenía lesiones notables por depredación. Se realizó el registro fotográfico de insectos asociados a estos daños. En las semillas se midió: peso de semillas (g), color, ancho y largo de la semilla (mm). Las semillas en buen estado se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 10 % por tres minutos y se enjuagaron con agua destilada. Se secaron a temperatura ambiente y se almacenaron en nevera a 16 °C hasta que fueron usadas en la investigación, con un tiempo máximo de 15 días. Las mediciones se hicieron con balanza analítica (AXIS, ACN220G) y pie de rey digital (Digital Caliber, Stainless hardened 150 mm 6" fracción).

Prueba de viabilidad con tetrazolio al 1 % (^{Jacobo-Pereira et al. 2016}).- Se tomaron 60 semillas separadas por el color de la testa, 15 de coloración clara y 45 de coloración oscura. Las semillas fueron cortadas trasversalmente y sumergidas en la solución de tetrazolio al 1 %, durante 48 horas a 30 °C en oscuridad. Los embriones que se colorearon de rojo intenso se consideraron viables y los que no adquirieron ninguna coloración se consideraron no viables. La viabilidad de las semillas (% V) se calculó con la ecuación reportada en ^{Jacobo-Pereira et al. (2016)} como:

Prueba de germinación de semillas (^{González-Zertuche & Orozco-Segovia 1996}).- Se realizaron ensayos de germinación con 320 semillas, se aplicaron dos tratamientos en el vivero del Jardín Botánico -JAUM-, y se hizo seguimiento durante 90 días. El sustrato utilizado consistió en una mezcla de tierra y arena, adquiridas en el vivero de JAUM, en proporción 2:1. Las semillas se dividieron en dos tratamientos (T1 suelo estéril, con 160 semillas) y (T2 suelo sin esterilizar, con 160 semillas), en donde la esterilización del suelo se realizó en caldera por 8 h, a 70 ºC. A las semillas se les removió la sarcotesta para romper la latencia física y posteriormente estas se dispusieron en bandejas plásticas negras de germinación de 30 × 50 cm. Se consideró germinación cuando hubo emisión de la radícula del embrión (^{Gallardo-Yobal et al. 2022}) o al observar el hipocótilo (^{Bewley & Black 1994}). Con los datos obtenidos se calculó: porcentaje de germinación, porcentaje de germinación acumulada e índice de velocidad de germinación (Tabla 1).

Capacidad de imbibición de las semillas.- Se tomaron 30 semillas seleccionadas al azar, se determinó el peso inicial, posteriormente se sumergieron en agua durante 48 horas, luego se determinó de nuevo su peso y se consideró que la diferencia entre el peso final y el peso inicial correspondía al agua absorbida.

Crecimiento de plántula.- Se seleccionaron 73 plántulas de M. guatapensis de 90 días de vida que desarrollaron 1 a 2 hojas verdaderas, se trasplantaron a bolsas de vivero de 15 × 30 cm y se evaluó el efecto de la aplicación de Glomus spp. en el crecimiento de la plántula, a través de dos tratamientos: T1 con 37 plántulas que se inocularon con: 40 g de inoculo comercial de Glomus spp., que tenía 402 esporas g-1 (Inoculo suministrado por Biofertilizar, nombre comercial) y T2 con 36 plántulas sin aplicación de inoculo comercial. Para los ensayos se utilizó un sustrato compuesto por una mezcla de tierra estéril y arena estéril en proporción 2:1, este fue esterilizado de igual forma que el sustrato usado para pruebas de germinación. Durante 240 días (de febrero a septiembre de 2021), se tomaron medidas semanales de altura de tallo (cm), diámetro de tallo (cm) y el ancho y largo de las hojas (cm). Estas medidas se tomaron semanalmente con un pie de rey digital (Digital Caliber, Stainless hardened 150 mm 6" fracción).

Área foliar.- El área foliar (AF) se estimó, siguiendo la metodología de ^{Álvarez et al. (2012)}, a partir del hallazgo del modelo lineal más adecuado. Para hallar la ecuación se seleccionaron 10 plantas de cada tratamiento y se midieron 30 hojas en ancho y largo, con el programa ImageJ, en el que, cada hoja se ubicaba sobre una superficie blanca y con un pie de rey digital (Digital Caliber, Stainless hardened 150 mm 6" fracción) se tomaba una imagen con cámara digital (CANON DC 7.4V), posterior a esto se ingresaban las imágenes al programa ImageJ, para hallar el área foliar de cada una.

Con el largo y ancho de la hoja se aplicó la siguiente ecuación:

AF: área foliar; c: constante; L: largo de la hoja; A: ancho de la hoja.

Para evaluar la germinación de semillas y el crecimiento de plántulas se hizo un diseño experimental completamente al azar con un factor. En la Tabla 3. se describen los factores, variables independientes evaluadas y los análisis estadísticos realizados.

Colonización con hongos micorrízicos.- Para el análisis de colonización se colectaron raíces finas de siete plántulas de M. guatapensis de once meses de edad del tratamiento (T1) y siete plántulas del tratamiento (T2). Estas se lavaron con agua destilada y se escogieron con ayuda del estereoscopio (Nikon, C-LED), se sumergieron en KOH al 10 % durante 48 horas para aclarar el tejido. Posteriormente las raíces se sumergieron en hipoclorito de sodio al 1 % durante 20 minutos y en Azul de Tripán al 0.05 % para colorear hifas, vesículas y arbúsculos de HMA en las raíces (^{Koske & Gemma 1989}).

El porcentaje de colonización se determinó mediante el método de intersecciones de portaobjetos (^{McGonigle et al. 1990}). En una caja de Petri se colocaron las raíces finas previamente teñidas y se cortaron fragmentos de 1.5 a 2 cm de largo. Posteriormente se tomaron cinco fragmentos de 1.0 cm al azar y se montaron en portaobjetos con PVLG (Polivinil-lacto-glicerol) como medio, haciendo una presión suave o squash, los fragmentos de raíces se ubicaron de forma paralela con respecto al eje horizontal del portaobjetos y se observaron con un aumento de 40x. en microscopio (Nikon Elipse E200). Se examinaron 100 intersecciones contando hifas, vesículas y arbúsculos. Los campos colonizados se definieron por la presencia de estructuras intracelulares e intercelulares. El porcentaje de colonización se determinó mediante la siguiente fórmula (según ^{McGonigle et al. 1990}):

Para comparar los resultados de las plántulas se repitió este procedimiento a partir de la muestra de la rizosfera de cinco árboles adultos presentes en la Reserva Los Magnolios, en Yarumal-Antioquia. Para ello, se seleccionaron las raíces más finas, las cuales se ubicaron en tubos de ensayo con KOH al 15 %, previamente calentado al baño María. Los tubos de ensayos se sumergieron al baño María por periodos de cinco minutos y una vez transcurrido el tiempo, las raíces se observaron al estereoscopio (Nikon, C-LED). Para estas muestras se realizaron ocho cambios de KOH al 15 %. Posteriormente las muestras se sometieron a peróxido de hidrogeno (H₂O₂) por periodos de tiempo cortos (1-2 minutos). Para la etapa de blanqueamiento y acidificación, las muestras se cubrieron con HCL al 5 % (1 min) y 2 % (1,5 minutos). Los demás pasos fueron iguales a los descritos para las plántulas.

Análisis estadísticos. Se realizaron análisis de varianza para las respuestas cuantitativas y análisis de regresión logística, para las respuestas dicotómicas. Se utilizó el software R v. 4.3.1 (R Core Team 2023) para Windows, para obtener los resultados. En la Tabla 3 se resumen los análisis realizados en cada proceso evaluado.

Resultados

Fruto. El fruto de Magnolia guatapensis presenta una forma elipsoide (Figura 2A), mide entre 21.18 a 50.82 mm de largo y 8.50 a 35.56 de ancho (Figura 2B), con un peso fresco de 8.91 a 21.87 g, presenta de 10 a 14 carpelos de 16.35 a 36.66 mm de largo y 8.00 a 26.69 mm de ancho, con un peso del conjunto carpelar de 3.39 a 15.37 g, presenta un receptáculo de 26.76 a 53.08 mm y 0.57 a 1.46 g de peso (Figura 2C). En cada carpelo se encontraron 1-2 semillas (Tabla 2). Se ha encontrado con flores en febrero y marzo y la producción de frutos se registró entre los meses de julio y septiembre.

Figura 2 Características del fruto, la semilla y la plántula de Magnolia guatapensis. A) Fruto cerrado. B) Detalles en carpelos. C) Semillas. D) Detalles en semilla. E) Corte longitudinal en semilla de testa oscura. F) Corte longitudinal en semillas de testa clara. G) Germinación de semilla. H) Emisión de hipocótilo. I) Características en cotiledones, primordio foliar y hoja verdadera. J) Planta juvenil de M. guatapensis 

Semilla. La semilla de M. guatapensis es cordiforme, mide entre 15.24 a 20.14 mm de ancho y 14.75 a 21.75 mm de largo, con un peso entre 0.12 a 0.74 g. (Figura 2D). De 164 semillas colectadas en ocho frutos, el 50 % de las semillas estaban sanas, el 30 % perforadas y el 20 % de las semillas eran inmaduras. El color de las semillas sin sarcotesta varió entre café y beige (Figura 2E).

Viabilidad. La viabilidad media de las semillas de M. guatapensis fue del 23 %, de acuerdo a la prueba con tetrazolio. Sin embargo, según un análisis de regresión simple, se encontraron diferencias en la viabilidad según el color de la sarcotesta de la semilla (P = 0.0001; Tabla 3), de modo que las semillas de sarcotesta clara o beige presentaron una viabilidad de 53 % y las de color oscuro-café de 13 % (Figura 2F).

Germinación de semillas. La germinación inició a los 25 días, el pico máximo de germinación fué a los 38 días y finalizó a los 89 días (Figura 3A) M. guatapensis presenta germinación epígea (Figura 2G), el embrión tiene dos cotiledones foliáceos, y midieron 19.09 mm de ancho por 18.48 mm de largo en promedio. El hipocótilo es de color rojizo y la raíz permanece confinada en el área del micrópilo (Figura 2H).

Figura 3 Germinación de semillas de Magnolia guatapensis. A. Porcentaje de germinación, B. Germinación acumulada. 

La germinación de semillas de M. guatapensis fué mayor cuando el suelo fue esterilizado (57 %), comparado con la germinación en suelo sin esterilizar (24 %) (F = 51.45, P = 0.0001; Tabla 3). En el suelo esterilizado se obtuvo la mayor germinación al día 38, en que germinó el 33 % del total de semillas bajo ese tratamiento. En suelo sin esterilizar no hubo una máxima de germinación, el comportamiento de este fue similar entre los 50 y 65 días después de la siembra, sin superar un 6 % de germinación por fecha. La germinación acumulada máxima se obtuvo a los 65 días en ambos tratamientos, sin embargo, esta fue mayor en el tratamiento de suelo esterilizado (Figura 3B).

Capacidad de imbibición de las semillas. La capacidad de imbibición según la coloración de la semilla no presentó diferencias significativas (P = 0.815). La velocidad de germinación fue mayor en el tratamiento de suelo estéril (16.1 %) que en el suelo sin esterilizar (10.5 %). En tratamiento con suelo esterilizado se obtuvo el mayor valor a los 55 días, mientras que en suelo sin esterilizar se obtuvo a los 65 días (Figura 3B).

Crecimiento de plántulas. Durante 240 días, las plántulas crecieron hasta 8.15 cm y desarrollaron hasta 8 hojas (Figura 2I). Las plántulas sin aplicación de Glomus spp. presentaron una mayor altura de 5.65 cm, de aquellas con aplicación del HMA que presentaron una altura de 5.38 cm (F = 28.4, P = 0.00; Tabla 3, Figura 2J). El diámetro de tallo de las plántulas con aplicación de Glomus spp fue mayor 0.19 cm que aquellas a las cuales no se aplicó 0.18 cm (F = 20.4, P = 0.00; Tabla 3). Para el área foliar, la ecuación lineal hallada con los datos fue:

Esta ecuación tuvo un alto porcentaje de predictibilidad (91 %), lo cual se consideró suficiente para la determinación del área foliar. Las plántulas con aplicación de Glomus spp. tuvieron mayor AF que las plántulas sin el hongo (F = 10.52, P= 0.01, Tabla 3, Figura 4A). En síntesis, sobre el crecimiento de las plántulas de M. guatapensis, la altura fue mayor en el tratamiento sin aplicación de Glomus spp, pero el diámetro del tallo y área foliar fue mayor en el tratamiento con aplicación de Glomus spp (Figura 4B).

Figura 4 Plántulas y árboles parentales de Magnolia guatapensis. A) plántula inoculada con Glomus spp. comercial, B) Característica de la raíz, C) coloración en tejido radicular, D) árboles parentales en Reserva Los Magnolios, E) raíz de árbol parental y F) vesículas en raíz de árbol parental. 

En las plántulas no se registró colonización de HMA, ni siquiera en aquellas a las cuales se les adicionó Glomus spp (Figura 4C). En contraste, en las raíces provenientes de los árboles adultos (Figura 4D) se observaron abundantes estructuras de HMA asociados a las raíces de M. guatapensis, de modo se encontró 80.2 % de colonización (Figura 4E), fueron observadas hifas, arbúsculos y vesículas (Figura 4F).

Las semillas fueron atacadas por el hongo Fusarium sp. y por larvas del género Siaria sp.; en las plántulas se identificaron como agentes patógenos Colletotrichum sp. y Oidium spp. a nivel foliar.

Discusión

Los frutos de Magnolia guatapensis son más pequeños que M. polyhypsophylla (Lozano) Govaerts y comparte rasgos morfológicos con M. coronata M. Serna, Velásquez, César A. & Cogollo, como la forma elipsoide, número de carpelos que varía entre 9 a 11, además de contener 1 a 2 semillas por carpelo (^{Serna et al. 2009}). Las semillas de M. guatapensis son particularmente atípicas, ya que presentan un endospermo proporcionalmente reducido y una estructura a manera de hueso, en comparación con lo descrito para especies como M. sínica (Y.W. Law) Noot., de origen asiático, que tiene una endotesta café, endospermo abundante y embrión subdesarrollado (^{Lin et al. 2022}).

La viabilidad medida a través de la prueba de tetrazolio fue de 23 % y a través de ensayos de germinación en suelo esterilizado fue de 57 %. Estas diferencias sugieren que se debe ajustar la prueba del tetrazolio para Magnolia guatapensis, ya que esta es una medida indirecta de la viabilidad basada en la actividad metabólica del tejido vivo de la semilla (^{Mackay 1972}) y las especies tienen diferentes respuestas según el tiempo de inmersión en la sustancia, la concentración del compuesto y la temperatura (^{Milošević et al. 2010}). En otras especies de Magnolia se ha descrito que sus semillas poseen latencia física, como en M. punduana (Hook. f. & Thomson) (^{Iralu & Upadhaya 2016}). La viabilidad de la semilla en M. guatapensis es menor a la registrada en otras especies como M. perezfarrerae A. Vázquez & Gómez-Domínguez sec. Talauma y M. sharpii Miranda sec. Magnolia, que mostraron un 92 y 87.5 % de viabilidad respectivamente, ambas especies de México, categorizadas en peligro de extinción (EN) (^{Vásquez-Morales & Ramírez-Marcial 2019}). M. pugana, por su parte, presentó una viabilidad de 67 % y M. iltisiana, un 80 % (^{Saldaña-Acosta et al. 2001}, ^{Jacobo-Pereira et al. 2016}). La baja viabilidad de las semillas de M. guatapensis incide en el desarrollo exitoso de los individuos y en consecuencia mayor dificultad para el establecimiento de plántulas en su hábitat natural ya que, al tener semillas de alto vigor, se aseguran poblaciones de plantas adecuadas en diferentes condiciones de campo (^{TeKrony & Egli 1991}). La diferencia observada en la viabilidad y su relación con la coloración de la testa de las semillas constituye un dato interesante para trabajos de propagación de M. guatapensis, ya que sugiere que aquellas de color beige tienen un mayor potencial para germinar. ^{Del Tredici (1981)} en M. virginiana L. describió que, una vez retirada la sarcotesta, se observaron diferentes colores de la testa, variando entre oscura, clara y moteada. Sin embargo, no relacionó esta descripción con la viabilidad de la semilla.

La germinación de M. guatapensis es epígea e inicia a los 25 días, el mayor porcentaje de germinación se obtiene entre el día 38 y el día 40. El tratamiento con mayor germinación se dio en suelo estéril, el incremento de la germinación podría deberse a que en suelos estériles los microorganismos que pueden suprimir la germinación como por ejemplo Fusarium sp, no estarían presentes (^{Balshor et al. 2017}, ^{Eldridge et al. 2021}). Algunas semillas que germinaron al final del periodo de observación tuvieron un bajo vigor, medido a través del crecimiento de la plántula. Este resultado es similar a lo hallado en otros trabajos, donde las plántulas provenientes de semillas que germinaron más rápido presentaron un mejor desarrollo, lo que favorece la supervivencia en el tiempo (^{González-Zertuche & Orozco-Segovia 1996}). La capacidad para germinar y emerger rápidamente es una característica del vigor de la semilla, el cual es considerado un rasgo complejo que incluye la capacidad de la semilla para germinar y de las plántulas para crecer normal y uniformemente (^{Reed et al. 2022}, ^{Eren et al. 2023}).

Se evidenció la presencia de HMA en un 80.2 % de colonización en las raíces de árboles adultos. Esto contrastó con lo hallado en las plántulas de once meses a las cuales se les había adicionado Glomus spp. Aunque las plántulas presentaron mayor diámetro del tallo y mayor área foliar, estas diferencias no pueden relacionarse con la colonización de raíces por HMA. Sin embargo, la tasa de crecimiento de especies leñosas puede estar relacionada entre otros aspectos como la distribución de biomasa a las hojas en un momento determinado, además de la biomasa inicial, que viene determinada en los primeros estadios por el peso de la semilla (^{Villar-Montero et al. 2008}). El establecimiento de una colonización exitosa de raíces inicia con señales bioquímicas entre simbiontes, que incluye la regulación de los mecanismos defensivos de la planta (^{Rodríguez 2013}). Existen además otros componentes relevantes para la compresión de la infección por HMA en raíces de plantas leñosas como el tipo de suelo y la profundidad, la temperatura y la vegetación (^{Levisohn 1957}). El proceso de colonización puede requerir un tiempo, que puede tardar hasta dos años, el cual varía según las especies involucradas y la efectividad del inoculo (^{Camarena-Gutiérrez 2012}, ^{López-Ráez et al. 2012}). Para hacer seguimiento a la dinámica del proceso de micorrización se usa un estudio destructivo de raíces en periodos de tiempo, que permita evaluar la actividad enzimática de las raíces (^{Pérez et al. 2015}) y la presencia de hifas, vesículas y arbúsculos.

Este trabajo demostró que las primeras etapas de M. guatapensis son críticas para la supervivencia de los individuos, lo cual se infiere de una viabilidad baja de la semilla y un vigor bajo de las plántulas en crecimiento. Las plántulas presentaron dificultad para tolerar factores ambientales adversos relacionados con el ataque de patógenos y dificultad para establecer relaciones con Glomus spp. no nativo. La inoculación con HMA nativos se sugiere como una alternativa que debe ser evaluada, así como la comparación con las relaciones simbióticas que establecen las plántulas que se encuentran en su hábitat natural, ya que la comprensión del proceso de establecimiento de la simbiosis es fundamental para la propagación exitosa de la especie.