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Los licopodios son plantas terrestres que forman un clado monofilético diferente de los helechos y espermatofitas, por lo que se considera un grupo basal dentro de las plantas vasculares (Kenrick & Crane 1997). Comparten características similares con los isoetes, selaginelas y helechos tales como: la dispersión por medio de esporas y un ciclo de vida con gametofitos y esporofitos independientes.
Los gametofitos de los licopodios en su mayoría son aclorófilos y mico heterótrofos, por lo que su relación simbiótica con hongos micorrízicos es indispensable para su desarrollo y supervivencia en las primeras fases de vida (Whittier 2006, Leake et al. 2008, Winther & Friedman 2008), el caso contrario es el esporofito, que, por ser autótrofo, no depende totalmente de esta relación para su nutrición y desarrollo. Por otra parte, las micorrizas son asociaciones simbióticas en las que la planta obtiene nutrientes minerales esenciales y el hongo obtiene carbono de su huésped. Se ha documentado que existen interacciones de grupos basales de Lycopodiaceae con hongos del orden Glomales (Glomeromycota) formando micorrizas arbusculares (MA), que están presentes en ambas fases de vida de la planta. (Read et al. 2000, Winther & Friedman 2008). De acuerdo con Smith & Smith (1997) existen dos tipos morfológicos de MA el tipo Arum en donde las hifas se sitúan en los espacios intercelulares e intracelulares y finalmente forman arbúsculos terminales (típicas de herbáceas y plantas cultivadas) y el tipo Paris donde las hifas se sitúan solo en el espacio intracelular y se forman estructuras de intercambio llamados pelotones (características de helechos, gimnospermas y angiospermas silvestres), con arbúsculos poco desarrollados o no están presentes (Smith & Smith 1997). En el caso concreto de los licopodios se ha reportado la presencia del tipo Paris con arbúsculos poco desarrollados o ausentes (Read et al. 2000).
Las asociaciones fúngicas con los licopodios están poco o nada estudiadas en México, aunque existen trabajos sobre el tema realizados fuera de México en los que se han documentado MA y endófitos septados oscuros en licopodios y equisetos (Fernández et al. 2008, Jumpponen 2001, Muthuraja et al. 2014, Winther & Friedman 2008).
Trabajos previos han demostrado que los licopodios terrestres son susceptibles a la micorrización. Se han obtenido secuencias moleculares pertenecientes a hongos del género Glomus Tul. & C. Tul., en raíces de Lycopodium y Huperzia (Winther & Friedman 2008), así como presencia de estructuras típicas de hongos MA del tipo Paris en Palhinhaea cernua (L.) Vasc. & Franco (Lycopodium cernuum L., Muthuraja et al. 2014) que no presentan arbúsculos y después de la penetración se forman pelotones intercelularmente (Read et al. 2000). También se ha observado colonización por hongos septados oscuros (HSO) en Huperzia selago, H. serrata (Takashima et al. 2014) y Austrolycopodium paniculatum (Fernández et al. 2008).
A diferencia de los hongos MA, los HSO pertenecen al filo Ascomycota y se trata de fases anamórficas de ascomicetos que poseen hifas septadas melanizadas que colonizan tejidos de la raíz sin causar un daño aparente (Jumpponen 2001). Aparentemente estas asociaciones no son del tipo micorrízico (Treu et al. 1995) y otros autores como Jumpponen (2001) consideran que bajo ciertas condiciones funcionan como micorrizas, sin embargo, se desconoce el papel fisiológico y ecológico que juega esta asociación en esta etapa del ciclo de vida (Jumpponen & Trappe 1998).
Estudios recientes basados en evidencia molecular, citológica, funcional y paleontológica han sugerido que los Glomeromycota y Mucoromycotina (un linaje basal o hermano de Glomeromycota), también formaron asociaciones simbióticas a la par con grupos basales como hepáticas y antoceros (Rimington et al. 2015).
Determinar las interacciones que tienen los hongos con plantas de grupos basales, como los licopodios, permiten entender la importancia de estos hongos en la diversificación de las plantas vasculares (Merckx & Bidartondo 2008). Además, conocer el estatus micorrízico de los licopodios es importante para desarrollar programas para un manejo adecuado con fines de conservación, ya que algunas especies del género Phlegmariurus deben encontrarse en alguna categoría de riesgo debido a la continua pérdida y fragmentación de los hábitats naturales (Armenta-Montero et al. 2015).
Por lo anterior el objetivo del presente trabajo es documentar la presencia de simbiontes micorrizicos en Phlegmariurus reflexus (Lam.) B. Øllg, especie de licopodio neotropical, que se encuentra en el sureste mexicano, a elevaciones de 300-2,400 m snm. Se encuentra en sitios abiertos, así como bosques húmedos y encinares (Mickel & Smith 2004). Se trata de una planta erecta terrestre de 9 a 30 cm con ramificación isodicotómica y hojas lanceoladas dispuestas en espiral (Figura 1).
Materiales y métodos
El muestreo de raíces se realizó en marzo del 2019, en un fragmento de bosque mesófilo de montaña ubicado en el municipio San Andrés Tlalnelhuayocan, Veracruz (19° 30.700´ N´, 97° 00.099´ W) en la parte central del estado de Veracruz, a 1,570 m snm. El sitio presenta una temperatura media anual de 19 °C y una precipitación anual 1,500 mm. Se trazaron dos transectos de 1 × 15 m, en cada uno se tomaron muestras de raíces de tres esporofitos individuales diferentes de Phlegmariurus reflexus, separados cada uno por 5 m, haciendo un total de seis plantas muestreadas. Las raíces se almacenaron en frascos con solución FAA (Formol-Alcohol-Ácido acético).
En el laboratorio, las raíces se lavaron con agua de la llave para remover el suelo y musgo y se procedió a cortarlas en fragmentos de 1 cm. Para el clareo y tinción se utilizó la técnica de Phillips & Hayman (1970) modificada para raíces no lignificadas, la cual consiste en colocar los fragmentos en frascos de cristal donde se agregó hidróxido de potasio (KOH) al 10 % en baño maría a 120 °C durante 20 minutos. Se removió el KOH con agua potable y peróxido de hidrógeno (H2O2). Para la tinción de hifas, arbúsculos y vesículas se utilizó azul de tripano al 0.05 % en baño maría a 120 °C por 20 minutos. Posteriormente se lavaron con agua y se colocaron en frascos con lacto glicerol para preservación hasta su observación al microscopio. Para evaluar y cuantificar el grado de colonización se utilizó la técnica de Giovanetti & Mosse (1980) utilizando un microscopio estereoscópico STEMI DV4 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) tanto para la revisión como para la toma de fotografías. Las muestras de raíces fueron montadas en alcohol polivínilico lacto glicerol (PVGL) para su preservación. Las fotografías se tomaron en un microscopio Primo Star Iled (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) con una cámara NIKON S100 (Tokio, Japón).
Resultados
Por muestra examinada de cada planta, se observaron estructuras típicas de micorrizas arbusculares y otras estructuras fúngicas asociadas a los fragmentos de raíz, en porcentajes variables (Figura 2). En total, se analizaron 850 segmentos de raíces, de los cuales 100 muestras (11.7 %) presentaron estructuras fúngicas. Todas las plantas muestreadas, presentaron evidencia de colonización por MA, aunque el número de fragmentos obtenidos fue variable por cada planta revisada, dichos valores se muestran en la Tabla 1. Los porcentajes de colonización variaron entre 6.83 y 17.14 % con promedio de 11.7 %.
Tabla 1 Segmentos muestreados (1 cm largo) y porcentaje de colonización.
| Muestra | Segmentos muestreados | Segmentos colonizados | Porcentaje colonización |
|---|---|---|---|
| 1 | 145 | 15 | 10.3 |
| 2 | 70 | 12 | 17.1 |
| 3 | 177 | 25 | 14.1 |
| 4 | 211 | 28 | 13.2 |
| 5 | 117 | 8 | 6.8 |
| 6 | 130 | 12 | 9.2 |
| TOTAL | 850 | 100 | 11.7 |
Se observaron estructuras típicas de MA, en su mayoría hifas intracelulares y vesículas (Figura 3A-B, vesículas con hifas intracelulares (Figura 3C), pelotones intracelulares en las primeras capas del córtex de la raíz y esporas aún adheridas a la raíz (Figura 3D), micro esclerocios (Figura 3E) e hifas intracelulares septadas (Figura 3F) éstas dos últimas estructuras características de hongos septados oscuros.
Figura 3 Estructuras simbióticas presentes en Phlegmariurus reflexus. A. Vista general de la raíz mostrando hifas intracelulares y vesículas. B-C. vesículas, D. pelotones intracelulares en las primeras capas del córtex y esporas aún adheridas, E. micro esclerocios, F. hifas intracelulares septadas características de endófitos septados oscuros.
Discusión
Como se mencionó anteriormente la presencia de MA y otras asociaciones fúngicas se presentaron en todas las plantas muestreadas. El tipo de colonización encontrado fue Paris lo cual corresponde con lo reportado previamente para licopodios (Fernández et al. 2008, Muthuraja et al. 2014, Winther & Friedman 2008), es importante mencionar la ausencia de arbúsculos, que es característica de este tipo de colonización, aunque se ha observado que en licopodios y otros grupos de plantas basales, éstas estructuras pueden o no estar presentes, particularmente se ha observado que gametofitos mico heterótrofos y esporofitos autótrofos de licopodios comparten simbiontes fúngicos (Read et al. 2000), cuya función es participar en el intercambio de nutrientes a nivel intergeneracional (Leake et al. 2008), además de que existen tipos intermedios como un continuum entre Arum-Paris (Dickson 2004).
Se observaron hifas y micro esclerocios típicos de hongos septados oscuros. (Figura 3E-F). Estas estructuras son similares a lo reportado para Austrolycopodium paniculatum (Fernández et al. 2008). Los hongos septados oscuros también han sido reportados para el género Huperzia (Takashima et al. 2014), por lo que esta asociación podría estar más extendida en la familia Lycopodiaceae. A pesar de que esta asociación no se considera micorrízica, se ha demostrado que los hongos endófitos oscuros se relacionan con la producción de metabolitos secundarios con funciones antibióticas y antifúngicas que le permiten mantener una mayor sanidad en los tejidos de diversas plantas (Chadha et al. 2014).
En relación con el porcentaje de micorrización éste varió en todas las plantas muestreadas (6.8-17.1 %) con un promedio de 11.7 %. Como se puede observar en la Tabla 2, este valor es parecido al reportado por Sudová et al. (2011) para el grupo más cercano como es el de los isoetes (4.0-13.15 %), pero no sucede así en el caso de los helechos, cuyos porcentajes varían del 23-36 %, considerado un grupo que representa una línea evolutiva más alejada (Schneider 2012). Dentro del grupo de los licopodios los porcentajes mencionados en este trabajo son similares a los citados previamente para otros géneros de licopodios como Huperzia y Lycopodium (Takashima et al. 2014, Fernández et al. 2008).
Tabla 2 Comparación de porcentajes de colonización de Phlegmariurus reflexus (especie de estudio) otros licopodios y helechos.
| Especie | Micorrización (%) | Cita |
|---|---|---|
| Licopodios | ||
| Austrolycopodium paniculatum (Desv. ex Poir.) Holub | 9.5 | Fernández et al. 2008 |
| Huperzia selago (L.) Bernh. ex Schrank & Mart. | 9.77 ± 7.96 | Takashima et al. 2014 |
|
H. serrata (Thunb.) Trevis. |
11.7 ± 10.7 |
Takashima et al. 2014 |
| Isoetes | ||
| Isoetes echinospora Durieu | 13.3 ± 1.9 | Sudová et al. 2011 |
|
I. lacustris L. |
4.0 ± 2.4 |
Sudová et al. 2011 |
| Helechos | ||
| Blechnum appendiculatum Willd. | 23 ± 10 | Lara-Pérez et al. 2015 |
| B. schiedeanum (C. Presl) Hieron. | 31 | Lara-Pérez et al. 2015 |
| Marattia sp. | 23 | Lara-Pérez et al. 2015 |
| Alsophila firma (Baker) D.S. Conant | 23 ± 10 | Lara-Pérez et al. 2015 |
| Cyathea bicrenata Liebm. | 25 ± 19 | Lara-Pérez et al. 2015 |
| C. divergens Kunze | 36 ± 16 | Lara-Pérez et al. 2015 |
La evidencia recabada demostró que Phlegmariurus reflexus se encuentra en simbiosis con hongos formadores de MA, encontrándose evidencias de estas asociaciones en las raíces de las plantas analizadas. La ausencia de arbúsculos está documentada para este grupo de plantas, aunque sería necesario realizar muestreos más intensivos para descartar que no se trata de un continuum o de una ausencia temporal.
Aunque no está clara la función ecológica que realizan los hongos endófitos septados oscuros en los licopodios, se detectó la presencia de estructuras que coinciden con estos hongos, esto también ha sido citado anteriormente en otros géneros de licopodios, por lo que esta asociación podría estar más extendida en la familia Lycopodiaceae.
El porcentaje de colonización promedio fue 11.8 % el cual no difiere de manera significativa con lo que se ha encontrado en otros estudios para licopodios. Sin embargo, es deseable realizar estudios en otros géneros o especies de Lycopodiaceae, para documentar los diversos porcentajes de micorrización.
Como un primer trabajo exploratorio la evidencia de la presencia de MVA y hongos endófitos septados en raíces de P. reflexus, sirve de base para posteriores estudios en este tema, ya que como se mencionó en la introducción son muy pocos los trabajos realizados en grupos de plantas basales en México.
