Materiales y métodos

Área y especie de estudio. El estudio fue realizado en la localidad “La Estación” ubicada en el municipio de Peñamiller, Querétaro, en las coordenadas 21° 01' 25.4" N y 99° 44' 42.2" W a 1,290 m snm. El tipo de vegetación predominante de la localidad es el matorral xerófilo, donde se encuentran especies como Larrea tridentata, Fouquieria sp., Bursera sp., Myrtillocactus geometrizans, Cylindropuntia imbricata, C. leptocaulis, Lophophora diffusa y Coryphantha sp. El clima predominante es semiseco-semicálido (BS1h), con temperatura media anual de 19.6 °C y precipitación media anual de 334.9 mm (^{INEGI 2017}). Thelocactus leucacanthus se distribuye en los estados de Hidalgo y Querétaro (^{Anderson 2001}). Se reconocen dos subespecies, T. leucacanthus ssp. leucacanthus, que posee flores amarillas y se distribuye principalmente en Hidalgo y T. leucacanthus ssp. schmollii, que tiene flores con tonos que van de violeta a carmín y se ha reportado como microendémica de la zona árida de Querétaro (^{Anderson 2001}, ^{Guzmán et al. 2003}, ^{Sánchez et al. 2008}). La especie estudiada, T. leucacanthus ssp. schmollii tiene tallos globosos o cortamente cilíndricos, de color verde grisáceo, de hasta 15 cm de altura y 8 cm de diámetro. Presenta podarios dispuestos en aproximadamente 12 costillas. Su forma de crecimiento puede ser simple o cespitosa. Las flores son de color violeta carmín y los lóbulos del estigma y los estambres son de color amarillo (^{Bravo-Hollis & Sánchez-Mejorada 1991}, ^{Anderson 2001}). ^{Fernández-Muñiz (2017)} reportó que la floración comienza en marzo y termina en noviembre, con dos picos de floración, uno grande en mayo-junio y otro en agosto-septiembre.

Biología floral y sistema de apareamiento. Se registró la morfometría floral utilizando 30 flores de diversos individuos fijadas en alcohol etílico al 70 %. Se midieron los siguientes caracteres florales con un vernier digital (Mitutoyo, CD-6 "CX): 1) longitud total de la flor, 2) longitud del estilo, 3) longitud de los estambres más internos, 4) longitud de los estambres más externos, 5) longitud de la cámara ovárica y 6) diámetro de la cámara ovárica. Se contó el número de estambres, el número de lóbulos estigmáticos y el número de óvulos por ovario. Las medidas morfométricas de la flor y el número de estambres, lóbulos estigmáticos y óvulos se expresaron como valores promedios ± desviación estándar (DE). El índice de entrecruza propuesto por ^{Cruden (1977)} toma en cuenta algunas características florales como el diámetro de la corola y la separación espacial (hercogamia) o temporal (dicogamia) de las funciones sexuales, estos rasgos han sido utilizados para determinar el sistema de apareamiento (^{Ornduff 1969}, ^{Cruden 1977}); para ello se examinaron diferentes características florales en campo, en julio de 2018. Para la apertura floral se tomó en cuenta la apertura máxima promedio del perigonio durante la antesis (n = 27). Para determinar si había dicogamia se observó y determinó la hora de la dehiscencia de las anteras, la apertura y la receptividad de los lóbulos estigmáticos en 30 flores de diferentes individuos. La receptividad del estigma se evaluó con peróxido de hidrógeno para detectar la actividad de la peroxidasa (^{Dafni 1992}) cada hora desde el inicio de la antesis. Para evaluar la hercogamia se utilizaron los valores obtenidos de la morfometría floral, determinando si la longitud (altura) de los estambres más externos y el estilo son significativamente diferentes entre sí aplicando una prueba t de student pareada, empleando el programa Graphpad Prism 7.0.

Sistema de cruza. Éste fue determinado utilizando los siguientes tratamientos de polinización en mayo de 2018 (^{Dafni 1992}): 1) Control (n = 30, de 10 diferentes individuos), flores con polinización abierta y natural; 2) Entrecruza manual (n = 29, de 10 plantas), se emascularon botones florales cercanos a la antesis y cuando ésta ocurrió los estigmas fueron saturados con una mezcla de polen de flores recién abiertas de al menos ocho individuos diferentes y se cubrieron; 3) Autocruza manual (n = 24, de 8 individuos), se cubrieron botones previos a la antesis y cuando abrieron, se polinizaron con su propio polen. En estos dos últimos tratamientos la polinización manual se realizó aproximadamente a las 12:30 h, cuando los lóbulos del estigma estaban completamente extendidos y receptivos, y se volvieron a cubrir inmediatamente; 4) Autocruza natural (n = 15, de 5 individuos), los botones florales sin emascular se cubrieron para evitar la intervención de polinizadores; y 5) Apomixis (n = 6, de 3 plantas), se emascularon botones florales previos a la antesis y se cubrieron inmediatamente sin ser polinizados. Para cubrir las flores se utilizaron bolsas de organza y pinzas de punta fina para colocar el polen en el estigma correspondiente a cada tratamiento. Se colectaron los frutos maduros aproximadamente 45 días después de la polinización para calcular el número de semillas formadas por fruto en cada tratamiento. Los tratamientos se compararon utilizando la prueba U de Mann-Whitney, debido a que solamente dos tratamientos formaron frutos, utilizando el programa Graphpad Prism 7.0.

Visitantes florales. Se registraron los visitantes florales en cuatro parches florales con una gran concentración de plantas en floración. Se observaron todas las flores posibles de cada parche (aproximadamente 50 flores) durante tres días por mes, en mayo, junio y octubre de 2018. Se registraron las visitas ocurridas en 10 minutos de observación, utilizando 20 minutos de descanso, sumando un total de 55 horas de observación (se realizaron de las 10:00 h a las 15:00 h, ya que previas observaciones mostraron que los visitantes comienzan a llegar a las 10:00 h, cuando las flores inician la antesis y cierran a las 14:00 h). También se registró el comportamiento de los visitantes, se estimó el promedio de visitas por flor por cada tipo de visitante (dividiendo el total de visitas de cada visitante sobre el número total de horas de antesis) y la carga de polen (número total de granos de polen) conespecífico que llevaban en el cuerpo (^{Ne’Eman et al. 2010}). Para identificar a los visitantes y determinar la carga de polen en el cuerpo, éstos se colectaron en cámaras letales de etanol al 70 % y se agitaron en el vórtex para desprender el polen de sus cuerpos. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 14,000 rpm durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 100 µl de agua con detergente para disminuir la tensión superficial. De esta solución se contaron los granos de polen en una muestra de 10 µl, por duplicado y se calculó el promedio, el cual se multiplicó por 10 (considerando que la muestra total fue de 100 µl) y así determinar el número de granos de polen conespecíficos que los visitantes llevaban en el cuerpo. Para asegurar que los granos de polen eran de la especie de estudio, se observó polen tomado directamente de las flores previamente colectadas y se comparó con el que portaban los visitantes.

Recompensas florales. Para determinar si las flores producen néctar, se analizó la morfo-anatomía del nectario floral; para esto se fijaron 10 botones florales y 10 flores en antesis de al menos cinco individuos diferentes en FAA (formaldehído, alcohol etílico al 96 %, ácido acético glacial, agua destilada; relaciones 10: 50: 5: 35, respectivamente) por 48 h. Posteriormente los botones y las flores fijadas se lavaron con agua para eliminar el exceso de fijador, se disectaron tanto longitudinal como transversalmente y se deshidrataron en una serie gradual de etanol (del 30 al 100 %), se incluyeron en Paraplast^©, se obtuvieron cortes histológicos de 6-10 μm de grosor con un microtomo rotatorio American Optical 820 y se tiñeron con safranina-verde rápido. También se realizaron diferentes pruebas histoquímicas: Lugol para detectar almidón, Rojo “O” de aceite para lípidos, Ácido Peryódico-Reactivo de Schiff (APS) para polisacáridos insolubles y Azul Negro de Naftol para proteínas (^{Márquez et al. 2016}). Las preparaciones histológicas fueron observadas en un microscopio Olympus Provis AX70 adaptado con una cámara digital y se tomaron fotomicrografías. Algunas muestras del nectario se deshidrataron, se llevaron a punto crítico en una desecadora CPD-030 Bal-Tec, se montaron en portamuestras metálicos, se cubrieron con oro en una ionizadora Denton Vacuum Desk-II y se observaron en el microscopio electrónico de barrido JSM-5310LV (Tokyo, Japan) para capturar imágenes digitales.

Resultados

Biología floral y sistema de apareamiento. Durante el presente estudio se observó una gran cantidad de plantas en floración, específicamente en mayo de 2018 (Figura 1A), pero el resto del año la floración fue intermitente, ya que en varias salidas no se encontraron plantas en floración. En 2019 el despliegue floral observado fue menor con respecto al 2018 debido a las alteraciones del hábitat. Las flores de T. leucacanthus ssp. schmollii son diurnas, actinomorfas, infundibuliformes, perfectas y con tépalos de color rosa carmín brillante, los externos menos coloridos que los internos, con un tono plateado en el ápice (Figura 1B-D). El promedio de la longitud total de las flores es de 36.04 ± 4.02 mm y un diámetro de 51.21 ± 11.67 mm en el punto de apertura máximo del perigonio (Figura 1D). El estilo es de color blanco en su base y amarillo pálido en el ápice, su longitud es de 14.44 ± 1.69 mm; el estigma es de color amarillo, con lóbulos estigmáticos que varían en cantidad entre 6 a 12. La cámara del ovario es elipsoidal, con diámetro de 3.47 ± 0.6 mm y longitud de 3.5 ± 0.92 mm; el número de óvulos por flor tiene un intervalo de 42 a 203. El promedio de longitud de los estambres más internos es de 10.18 ± 1.44 mm y de los estambres más externos de 14.8 ± 1.82 mm y el número promedio de estambres fue de 746.87 ± 241.6 (Figura 1C, Tabla 1). La longevidad de las flores de T. leucacanthus ssp. schmollii en la población de estudio es de un solo día. La antesis comienza alrededor de las 10:30 h, la máxima apertura se da entre las 13:00 h (n = 11) y las 14:00 h (n = 13). El cierre floral ocurre entre las 14:00 (n = 10) y 15:00 h (n = 9; Figura 2). Las anteras son dehiscentes desde el inicio de la antesis, a diferencia de los lóbulos del estigma que generalmente permanecen cerrados y erectos (n = 23). Aproximadamente tres horas después del comienzo de la antesis, los lóbulos del estigma (n = 17) se extienden por completo (Figura 1D), aunque en algunas flores (n = 8) los lóbulos requirieron una hora más para extenderse. Por tal motivo se propone que T. leucacanthus ssp. schmollii presenta dicogamia, particularmente protandria incompleta, de acuerdo con los tipos de protandria propuestos por ^{Lloyd y Webb (1986)}, ya que a pesar de que la dehiscencia de anteras es previa a la receptividad del estigma, estos eventos coinciden parcialmente.

Figura 1 Individuos adultos de Thelocactus leucacanthus ssp. schmollii en el sitio de estudio y atributos florales evaluados para determinar el sistema de apareamiento. A) Individuo cespitoso mostrando los tallos reproductivos al iniciar la floración. B) Flor en antesis mostrando las anteras dehiscentes, los lóbulos del estigma extendidos y los tépalos brillantes. C) Parámetros para determinar la hercogamia y morfometría floral (1, longitud total de la flor; 2, longitud del estilo; 3, longitud de los estambres más internos; 4, longitud de los estambres más externos; 5, longitud de la cámara ovárica; 6, diámetro de la cámara ovárica). D) Medición de la apertura floral. Escala: A = 10 cm, B = 1 cm, C-D = 2 cm. 

Figura 2 Apertura floral a lo largo del día de Thelocactus leucacanthus ssp. schmollii (n = 27). Se muestra el diámetro del perigonio de flores durante la antesis. Los puntos representan el promedio del diámetro del perigonio ± la desviación estándar en función de la hora del día. La antesis comienza alrededor de las 10:30 horas y termina a las 15:00 horas. La línea sólida delimita el tiempo de dehiscencia de las anteras (fase masculina) y la línea discontinua, la hora en que el estigma es receptivo (fase femenina). 

De acuerdo con la prueba t de student pareada, la diferencia en la longitud de los estambres más largos y del estilo (la distancia que separa a las anteras y el estigma) no es significativa; (t = 1.112; df = 29; P = 0.1375). Lo que indica que la distancia que separa al estigma de las anteras no es suficiente para evitar la autopolinización, por lo que las flores de la población estudiada de T. leucacanthus ssp. schmollii no presentan hercogamia.

Con base en la información anterior, se determinó que el taxón estudiado tiene un valor de 4 en el índice de entrecruza de ^{Cruden (1977)}, ya que las flores tienen un diámetro mayor a 6 mm, presentan protandria y no tienen hercogamia. Por lo tanto, el sistema de apareamiento en T. leucacanthus ssp. schmollii es de xenogamia obligada.

Sistema de cruza. Las semillas de T. leucacanthus ssp. schmollii sólo se producen por vía sexual, debido a que no se desarrollaron semillas en el tratamiento de apomixis. La formación de frutos y semillas sólo ocurrió en los tratamientos control y entrecruza manual (Tabla 2), sin diferencia significativa en el promedio de semillas producidas entre estos dos tratamientos (U = 355.5; P = 0.1582; Tabla 2).

Visitantes florales. Los visitantes florales observados en T. leucacanthus ssp. schmollii fueron abejas, escarabajos y hormigas. La conducta y la tasa de visitas de las abejas pertenecientes a las familias Halictidae, Apidae, Megachilidae y Andrenidae, indica que son los posibles polinizadores. La mayoría de las veces aterrizaban en el estigma y después forrajeaban las anteras, aunque no siempre lo hacían en este orden, pero tocaban alguno o ambos verticilos sexuales. De la familia Halictidae se registraron tres morfoespecies pertenecientes a los géneros Lasioglossum, Augochlora y Agapostemon (Figura 3A-C). Del género Lasioglossum se identificó el subgénero Dialictus (Figura 3A). De la misma manera de la familia Apidae se encontraron tres morfoespecies, correspondientes a los géneros Exomalopsis, Diadasia y Ceratina (Figura 3D-F). De la familia Megachilidae se registraron dos morfoespecies pertenecientes a los géneros Ashmeadiella y Dianthidium (Figura 3G-H). De la familia Andrenidae se registró una morfoespecie del género Pseudopanurgus (Figura 3I).

Figura 3 Abejas que visitan las flores de Thelocactus leucacanthus ssp. schmollii, tasa de visitas y carga de polen de los visitantes. A-C) Familia Halictidae. A) Lasioglossum sp. (subg. Dialictus). B) Augochlora sp. C) Agapostemon sp. D-F) Familia Apidae. D) Exomalopsis sp. E) Diadasia sp. F) Ceratina sp. G-H) Familia Megachilidae. G) Ashmeadiella sp. H) Dianthidium sp. I) Pseudopanurgus sp. (Andrenidae). J) Gráfica del número de visitas por flor por hora de cada tipo de visitante y el número de granos de polen que llevaban en el cuerpo (escala 1:1000). Lasioglossum sp. (subgénero Dialictus) es la más frecuente, seguida de Pseudopanurgus sp. Las visitas de Diadasia sp. no fueron tan frecuentes, pero su carga de polen es similar a la de Lasioglossum sp. (subgénero Dialictus). 

Los visitantes más frecuentes son individuos del género Lasioglossum (subg. Dialictus), su tasa de visita fue de 4.2 visitas por flor, por hora (v/f/h) y fueron los que tuvieron un mayor número de granos de polen en el cuerpo. Seguidos por la morfoespecie del género Pseudopanurgus, con visitas de 2.6 v/f/h y con carga de polen alta. La morfoespecie del género Exomalopsis tuvo 2.2 v/f/h, pero su carga de polen fue baja. El resto de las morfoespecies tuvieron una tasa menor a 1 v/f/h. Aunque las visitas de Diadasia sp. no fueron tan frecuentes, la carga de polen conespecífico en su cuerpo fue notable, pues se acercó mucho a la carga de polen de la morfoespecie de Lasioglossum (subg. Dialictus) (Figura 3J). Las visitas de todos los insectos fueron más frecuentes entre las 12:00 y las 13:30 h; antes y después de este intervalo las visitas fueron muy escasas.

También se observaron ocasionalmente hormigas del género Monomorium (subfamilia Myrmicinae) caminando alrededor de los botones florales y algunas veces de las flores en antesis, sin una conducta en específico. Asimismo, escarabajos del género Trichochrous (familia Melyridae) entran hasta la base del tubo floral, posiblemente para consumir tejido de esta zona, ya que algunos escarabajos analizados tenían restos de tejido floral en su aparato bucal. Sin embargo, ninguno de ellos toca los verticilos sexuales, por lo que se descarta que sean polinizadores.

Recompensas florales. El taxón de estudio presenta un nectario pequeño, ubicado por debajo de la zona de inserción de los filamentos estaminales más internos (Figura 4A, C), específicamente en el hipantio; tiene forma de anillo, por lo tanto, es un nectario hipantial de tipo anular (Figura 4A). A lo largo de la epidermis del nectario se observan nectarostomas abiertos (Figura 4B), los cuales son estomas que no pueden regular su apertura y cierre de acuerdo con ^{Nicolson et al. (2007)}. A través de los nectarostomas se secreta el néctar producido por el parénquima secretor del nectario, el cual se ubica por debajo de la epidermis; está compuesto por células secretoras de tamaño pequeño con respecto al resto del nectario, son compactas y tienen un citoplasma denso. Adyacente al tejido secretor se localiza el parénquima subnectarífero, que se distingue por presentar células más grandes que el parénquima nectarífero, con vacuolas conspicuas, citoplasma poco denso y no secretoras; además, este parénquima se encuentra asociado a haces vasculares (Figura 4D).

Figura 4 Morfología e histoquímica del nectario de Thelocactus leucacanthus ssp. schmollii. A-B) Micromorfología al microscopio electrónico de barrido. C-D) Secciones longitudinales. E-L) Pruebas histoquímicas. A) Vista panorámica del nectario hipantial anular (coloreado en amarillo), se encuentra por debajo de la inserción de los filamentos. B) Acercamiento a un nectarostoma con restos de secreciones (flecha) de néctar. C) Nectario (flechas) por debajo de la inserción de los filamentos, con haces vasculares (cabezas de flechas) cercanos al nectario. D) Acercamiento al nectario, se observa el parénquima nectarífero y subnectarífero, además de un haz vascular (cabeza de flecha). E-F) Histoquímica de Rojo “O” es positiva sólo en los lípidos de la cutícula (flechas). La cabeza de flecha señala un haz vascular. G-H) Histoquímica de lugol, fue positiva para almidón (puntos oscuros morados) en el parénquima nectarífero y en algunas células del parénquima subnectarífero. I-J) Prueba de APS, positiva para polisacáridos insolubles en el parénquima nectarífero (en magenta) y en algunas células del parénquima subnectarífero. K-L) Histoquímica de Azul Negro de Naftol, positiva para proteínas en el parénquima nectarífero; las cabezas de flecha señalan haces vasculares asociados al nectario. cs, células secretoras; e, estilo; f, filamento; n, nectario; pn, parénquima nectarífero; ps, parénquima subnectarífero. 

En cuanto a las pruebas histoquímicas aplicadas al nectario, la de Rojo “O” de aceite resultó positiva para lípidos sólo en la cutícula, debido a los compuestos cerosos de ésta y dio negativo para el resto del tejido nectarial (Figura 4E-F). La prueba de lugol resultó positiva a almidón tanto en el parénquima nectarífero y subnectarífero, pero la mayor abundancia de almidón se observó en las células secretoras nectariales (Figura 4G-H). La prueba de Ácido Peryódico-Reactivo de Schiff (APS) muestra una gran concentración de carbohidratos insolubles en las células del parénquima nectarífero y poco en las células del parénquima subnectarífero (Figura 4I-J). Con la prueba de Azul Negro de Naftol se observa una gran cantidad de proteínas en el parénquima nectarífero comparado con el subnectarífero (Figura 4K-L), confirmando una mayor concentración proteínica en las células secretoras. Se intentó cuantificar el néctar con capilares de vidrio de 10 µL, sin embargo, la cantidad de néctar que produce T. leucacanthus ssp. schmollii es muy pequeña para que suba por el capilar.

Observaciones sobre la fragmentación del hábitat por actividades antropogénicas. Durante las visitas realizadas a la población de T. leucacanthus ssp. schmollii, en el transcurso de dos años (2018 y 2019), se observó que el hábitat de esta población se fue degradando drásticamente por la actividad humana. En las últimas visitas se observó que los individuos de T. leucacanthus ssp. schmollii estaban en malas condiciones por falta de agua y sombra debido a la erosión y actividades de limpia de terreno para otros fines, lo que provocó que muchos de los ejemplares se encontraran desenterrados, con coloración amarillenta y algunos muertos. Al terminar las visitas a la población, se encontró una gran parte del sitio de estudio completamente deforestado (Figura 5A), comparado con la primera visita en el 2018 (Figura 5B), donde se observa mayor vegetación. No se pudo estimar el número de ejemplares que fueron destruidos o maltratados debido a que no se hizo un censo de las plantas que había en la población al inicio del estudio, ya que se removieron las etiquetas a las plantas marcadas cuando se recogieron los frutos formados de los tratamientos de polinización. Thelocactus leucacanthus ssp. schmollii no es la única cactácea en peligro en esta localidad, se observaron personas saqueando ejemplares de Lophophora diffusa (peyote), posiblemente para su consumo (debido a que produce efectos psicotrópicos); con el paso del tiempo los individuos de L. diffusa se encontraban en menor cantidad.

Figura 5 Fotos panorámicas del sitio de estudio de Thelocactus leucacanthus ssp. schmollii en Peñamiller, Querétaro. A) Sitio deforestado en la última visita registrada en agosto del 2019. B) Sitio con vegetación abundante y mayor número de plantas en las primeras visitas del presente estudio, en marzo del 2018. 

Discusión

Biología floral y sistema de apareamiento. Las flores de T. leucacanthus ssp. schmollii son hermafroditas, dicógamas, diurnas e infundibuliformes. Generalmente la longevidad floral en Cactaceae es de uno o dos días (^{Mandujano et al. 2010}), en el caso de las flores de T. leucacanthus ssp. schmollii se limita a unas cuantas horas, por lo que su oportunidad para ser visitadas y polinizadas es restringida y de alto riesgo, debido a que presentan dicogamia y probablemente son autoincompatibles, lo que podría limitar aún más el número de cruzas compatibles, comprometiendo la producción de semillas. En cambio, algunas cactáceas que no son polinizadas el primer día siguen abriendo días consecutivos, como en Mammillaria grahamii (^{Bowers 2002}) y las especies de Strombocactus (^{Camacho-Velázquez 2020}). Además de la falta de polinización, la longevidad floral también puede verse influenciada por las condiciones ambientales. Se ha reportado que en Ariocarpus trigonus la falta de radiación solar (por estar nublado) provoca una disminución en la duración de la antesis por día, ocasionando que las flores abran un día más de lo usual (^{Martínez-Peralta & Mandujano 2012}).

La dicogamia presente en las flores de T. leucacanthus ssp. schmollii es de tipo protándrica debido a que la liberación del polen es previa a la receptividad del estigma. Sin embargo, estos sucesos se sobrelapan en algún momento, por lo que la protandria es incompleta en este taxón, según lo propuesto por ^{Lloyd & Webb (1986)}. La presencia de protandria también se ha reportado en algunas otras cactáceas, por ejemplo, en Hylocereus sp. (^{Pimienta-Barrios & Del Castillo 2002}), Pilosocereus royenii (^{Rivera-Marchand & Ackerman 2006}), en el género Ariocarpus (^{Martínez-Peralta et al. 2014b}) y en Echinocereus pentalophus (^{Reyes-Tovar 2019}).

Los ejemplares analizados de T. leucacanthus ssp. schmollii de la localidad de estudio no presentan una separación espacial entre el estigma y las anteras, por lo que no son hercógamas. Este resultado difiere de los estudios realizados por ^{Martínez-Ramos et al. (2017)} y ^{García-Becerril (2020)} para otra población (Agua de Ángel, Querétaro) de la misma subespecie, donde las flores presentan hercogamia. Los resultados opuestos, pueden revelar que cada población de T. leucacanthus ssp. schmollii presenta exigencias reproductivas particulares que se ven reflejadas en sus atributos florales. En cuanto al sistema de apareamiento, con base en el índice de entrecruza propuesto por ^{Cruden (1977)}, la población estudiada de T. leucacanthus ssp. schmollii es xenógama, por lo que requiere de vectores para el transporte de polen entre las flores de individuos genéticamente distintos.

Sistema de cruza. Los resultados obtenidos a partir de las polinizaciones controladas confirmaron lo predicho con el sistema de apareamiento, ya que T. leucacanthus ssp. schmollii presenta un sistema de cruza por entrecruza estricto, ya que no se formaron semillas en los tratamientos de autopolinización manual y natural. Con base en la formación de frutos solamente en los tratamientos control y de entrecruza, es claro que la formación de semillas en el grupo control se dio por polinización cruzada. El sistema de entrecruza se ha reportado en aproximadamente 83 especies de la subfamilia Cactoideae, como en Stenocactus anfractuosus, Coryphantha cornifera (^{Fuentes-Mayo 2012}), Cleistocactus baumannii y C. smaragdiflorus (^{Gorostiague & Ortega-Baes 2016}). La falta de producción de semillas en los tratamientos de autopolinización en T. leucacanthus ssp. schmollii, puede indicar la presencia de un sistema de incompatibilidad, que evita la formación de semillas por autocruza (^{De Nettancourt 1997}, ^{Eaves et al. 2014}); o por los efectos de la depresión endogámica, que se pueden presentar a partir del desarrollo del embrión o a niveles posteriores como la germinación o la supervivencia de la plántula (^{Mandujano et al. 1996}), pero no fue analizado en el presente estudio. La prueba U de Mann-Whitney señala que no hubo diferencias significativas en la producción de semillas entre los tratamientos control y de entrecruza manual, lo que podría indicar que no hay una limitación de polinizadores en T. leucacanthus ssp. schmollii en el sitio de estudio; sin embargo, hace falta corroborarlo con un tratamiento de polen suplementario, como el realizado en otras cactáceas (^{Martínez-Peralta & Mandujano 2016}).

En otras especies de plantas se ha observado que una buena carga de polen en el estigma (carga estigmática), puede aumentar el número de semillas producidas, ya que mayor número de granos de polen conespecífico incrementa la competencia entre los granos de polen y los tubos polínicos, que se traduce en un mayor número de semillas (^{Snow 1986}, ^{Bertin 1990}, ^{Mitchell 1997}).

Al presentar T. leucacanthus ssp. schmollii un sistema de entrecruza estricto, se promueve el intercambio genético, lo que genera un aumento en la heterocigosidad y la adecuación de su progenie; evitando o disminuyendo la depresión por endogamia (^{Charlesworth & Charlesworth 1987}, ^{Eguiarte et al. 1992}, ^{Barrett 2014}). Sin embargo, la especie depende de vectores que transporten eficientemente el polen entre flores de individuos genéticamente diferentes, volviéndose un reto la ocurrencia de la fecundación, lo cual es determinante para su éxito reproductivo, debido al corto tiempo de vida de sus flores y a la presencia de protandria incompleta.

En otra población de T. leucacanthus ssp. schmollii^{García-Becerril (2020)} reportó un sistema de cruza mixto, con una ligera tendencia a la autocruza, ya que el éxito reproductivo a nivel de fruit set fue ligeramente mayor en el tratamiento de autocruza manual que en el de entrecruza forzada. Esa localidad, denominada Agua de Ángel en Peñamiller, Querétaro, se encuentra aproximadamente a una distancia de 7.84 km en línea recta de la población del presente estudio. Esta diferencia posiblemente se deba a que la subespecie a lo largo del tiempo ha respondido de distinta forma a las presiones selectivas de cada localidad, manifestándose en estrategias reproductivas diferentes. En la población estudiada por ^{García-Becerril (2020)} algunos individuos parecieran estar perdiendo el sistema de incompatibilidad, lo que resulta en una vía para asegurar la reproducción a través de la autofecundación cuando las posibilidades de entrecruzarse se agotan.

Visitantes florales. Los caracteres florales que exhibe T. leucacanthus ssp. schmollii son típicos de plantas melitófilas (^{Faegri & Van Der Pijl 1979}, ^{Domínguez & Pérez 2013}). Sus flores presentan antesis diurna, un color rosa brillante, forma infundibuliforme, con una superficie de aterrizaje (el estigma), así como polen y néctar como recompensas. De acuerdo con la conducta y constantes visitas, las abejas son los potenciales polinizadores de este taxón, pues se observa polen abundante en sus cuerpos y estructuras colectoras (escopas, corbículas, etc.). Además, la mayoría de las veces aterrizan en el estigma, después forrajean las anteras y se van a otras plantas de otros manchones, transfiriendo así el polen entre individuos. Con base en los rasgos evaluados, Lasioglossum sp. (subg. Dialictus) es una de las abejas polinizadoras más importantes en el sitio de estudio, así como Pseudopanurgus sp. y Diadasia sp. Sin embargo, las demás abejas no pueden ser descartadas, pues existen muchos factores que influyen en la polinización y que no se tomaron en cuenta en este estudio, como la temporada de floración y la cantidad de recompensa, entre otras (^{Golubov et al. 2010}, ^{Ne’Eman et al. 2010}), por lo que se necesitan estudios más específicos que se centren en observaciones más detalladas a lo largo del tiempo. Las abejas son polinizadoras importantes en varias especies de Cactoideae, como en Astrophytum asterias (^{Martínez-Ávalos 2007}), Echinocereus schmollii (^{Vázquez-Díaz et al. 2016}), Echinocereus pentalophus (^{Reyes-Tovar 2019}), Mammillaria grahamii (^{Bowers 2002}), Lophophora diffusa (^{Briseño-Sánchez 2016}), así como ciertas especies de los géneros Ariocarpus (^{Martínez-Peralta & Mandujano 2012}, ^{Martínez-Peralta 2014}, ^{Martínez-Peralta et al. 2014a}, ^b), Echinocactus (^{Jiménez-Sierra 2008}) y Ferocactus (^{Del Castillo 1994}).

Los demás visitantes florales de T. leucacanthus ssp. schmollii (hormigas del género Monomorium sp.) no se definieron como polinizadores porque raramente visitan flores abiertas y no tocan los verticilos sexuales. Mientras que los escarabajos (Trichochrous sp.) se pueden considerar como florívoros, pues entran al tubo floral sin tocar los verticilos sexuales y se alimentan de los tejidos del fondo del tubo floral o hipantio. Algunos autores han reportado que escarabajos del género Trichochrous son polinívoros y que buscan refugio en las flores de especies como Echinocereus pentalophus (^{Reyes-Tovar 2019}) y Lophophora diffusa (^{Briseño-Sánchez 2016}).

Recompensas florales. Las flores de T. leucacanthus ssp. schmollii presentan una zona nectarial pequeña y abierta, ubicada en la parte inferior del tubo floral, formando un anillo en el hipantio, por lo que presenta un nectario de tipo hipantial según la clasificación de ^{Bernardello (2007)}. De acuerdo con las pruebas histoquímicas, el nectario de este taxón sí produce néctar. La prueba de Azul Negro de Naftol indica que las células secretoras tienen mucha actividad metabólica, detectada por la gran cantidad de proteínas presente en ellas. Además, la presencia de almidón en el nectario indica que tiene un tejido de reserva. Se ha visto que la tasa de secreción de néctar está relacionada con la presencia de almidón y cantidad de agua almacenada por la planta. Al haber un almacén de almidón, la tasa de secreción es más rápida que si se produjeran los carbohidratos directamente por fotosíntesis (^{Nicolson et al. 2007}). El volumen de néctar que produce T. leucacanthus ssp. schmollii es muy poco para ser cuantificado, sin embargo, al observar los nectarostomas en microscopio electrónico de barrido se detectaron secreciones a través del ostiolo y sobre la epidermis del nectario. Otras especies de la subfamilia Cactoideae producen poco néctar, como Melocactus andinus y M. schatzlii (5.3 μl y 4.4 μl respectivamente, ^{Nassar et al. 2007}). En Lophophora diffusa (^{Briseño-Sánchez 2016}) y en las especies de Strombocactus (^{Camacho-Velázquez et al. 2019}) tampoco fue posible cuantificar el néctar. Se ha observado que la secreción por nectarostomas es común en las cactáceas (^{Fuentes-Pérez 2004}, ^{Almeida et al. 2013}, ^{Gudiño et al. 2015}, ²⁰¹⁸, ^{Camacho-Velázquez et al. 2019}, ^{Villalpando-Martínez et al. 2020}). Por otra parte, los únicos visitantes florales de T. leucacanthus ssp. schmollii que llegan hasta la zona del nectario son los coleópteros (Trichochrous), pues las abejas sólo forrajean las anteras para obtener polen. Esto aunado a la gran cantidad de anteras que presenta el taxón, indica que la principal recompensa para los polinizadores es el polen, aunque también ofrecen néctar.

Fragmentación del hábitat por actividades antropogénicas. La degradación del hábitat, la sobreexplotación de recursos y el cambio climático son factores que amenazan la biodiversidad, porque alteran el equilibrio de las poblaciones (^{Ramawat et al. 2014}). En la población de Agua de Ángel de T. leucacanthus ssp. schmollii estudiada por ^{Fernández-Muñiz (2017)} se propuso que la propagación clonal podría asegurar la permanencia de la población, debido al bajo reclutamiento por vía sexual. Sin embargo, presenta una ligera tendencia a decrecer, debido al saqueo y a la mortalidad de plantas en etapa reproductiva; por lo que es importante proteger a los individuos reproductivos para mantener a las poblaciones como lo sugiere ^{Fernández-Muñiz (2017)} para cactus endémicos del desierto Chihuahuense. Algo similar ocurrió en una población de Ariocarpus retusus en una localidad de Tamaulipas, México. En esa población, arrasaron con aproximadamente 2,000 plantas debido a que el terreno se destinó a la construcción de una presa captadora de agua, causando un daño irreversible a la población de esta especie (^{Arroyo-Cosultchi et al. 2014}).

Las características intrínsecas y extrínsecas que presenta T. leucacanthus ssp. schmollii en la localidad de estudio, la hacen vulnerable y en riesgo de desaparecer. Aunado a esto se considera un taxón microendémico de Querétaro, por lo que es indispensable realizar un estudio demográfico exhaustivo para determinar su área de distribución real, que, junto con la información generada sobre su biología reproductiva, permitiría plantear programas concretos de conservación y propagación. Asimismo, se propone reevaluar su estatus de conservación en futuras revisiones de las diferentes listas de especies amenazadas tanto nacionales (NOM-059-SEMARNAT-2010) como internacionales (Lista Roja de la IUCN y los Apéndices de CITES).