Materiales y métodos

Ficus tuerckheimii formó parte del complejo F. aurea (^{Berg 2007}, ^{Ibarra-Manríquez et al. 2012}), pero ^{Hernández-Esquivel et al. (2020)}, con base en análisis cuantitativos del tamaño de la hoja y del sicono, la reconocen como una especie independiente, cuya distribución incluye México y Centroamérica. Se colectaron ramas con siconos en las diferentes fases de desarrollo en seis individuos de F. tuerckheimii, en junio del 2018, en dos localidades del estado de Veracruz (Coatepec y Xalapa), México. Se colectaron ejemplares botánicos (Eva María Piedra Malagón 612 al 619), en ambas localidades de estudio; un duplicado de cada número se depositará en el Herbario Nacional (MEXU). Para el establecimiento de las ocho fases típicas de desarrollo de los siconos, se utilizó la caracterización de ^{Smith & Bronstein (1996)} y ^{Piedra-Malagón et al. (2019)}. Las muestras se fijaron en FAA (formaldehído, etanol, ácido acético y agua destilada), fueron deshidratadas e incluidas en Paraplast, se obtuvieron cortes histológicos de entre 5-8 µm de grosor, con un micrótomo rotatorio American Optical 820, se tiñeron con safranina y verde rápido o algunos se usaron para aplicar la prueba histoquímica de vainillina para detectar taninos; las laminillas seleccionadas se fotografiaron con un microscopio óptico Olympus Provis AX70, que tiene adaptada una cámara digital Evolution MP 5.1. Los siconos seccionados longitudinalmente fueron fotografiados en un microsopio estereoscópico Carl Zeiss. Además, se procesaron distintas estructuras del sicono fijadas en FAA o etanol al 70 %, las cuales se deshidrataron, se llevaron a punto crítico, se adhirieron a portamuestras metálicos y se cubrieron con oro para obtener fotomicrografías con un microscopio electrónico de barrido Jeol JSM-5310LV (^{Márquez-Guzmán et al. 2016}). Un total de 30 siconos en cada etapa se midieron con un vernier y el programa Leica Application Suite Version 3.4.0, para determinar el largo (rango), ancho (rango), así como el promedio y desviación estándar de ambas medidas. El largo del sicono se midió desde su base hasta el ostíolo, mientras que el ancho se registró en una línea transversal al largo, en la parte media del sicono. Las diferencias en el tamaño de los siconos, entre las fases de desarrollo de los siconos, fueron evaluadas por medio de modelos lineales generalizados y comparaciones múltiples de medias (Prueba poshoc de Tukey), utilizando el paquete 'multcomp' (^{Hothorn et al. 2008}) en R (^{R Core Team 2018}).

Resultados

Desarrollo de los siconos. Fase A1. Los siconos se encuentran en posición axilar a las hojas, generalmente en pares, aunque a veces alguno de ellos puede abortar; son sésiles, cada uno está cubierto totalmente por dos brácteas basales, las cuales están fusionadas en la base (Figuras 1A, 2A). Los siconos presentan una estructura discoide en su base, la cual persiste a lo largo de todas las fases (Figura 1A-L). Al emerger de las brácteas, los siconos son esféricos, verdes, con la superficie lisa, glabros, con un largo y ancho promedio de 8.9 y 9.2 mm, respectivamente. En el ápice del sicono se localiza el ostiolo, conformado por brácteas ostiolares, con un borde formado por la parte apical de la pared (el anillo ostiolar) (Figura 2B-C). Las brácteas se dividen en: i) externas (o superficiales), ii) transicionales, ubicadas en la parte media del ostiolo y entrelazadas horizontalmente, y iii) internas o de la pared, con un arreglo inclinado hacia el interior de la cavidad del sicono (Figura 2A-B). Las brácteas externas o superficiales tienen mayor grosor con respecto a las demás y en su epidermis abaxial, que es la que está en contacto con el exterior, se observan células epidérmicas elongadas, formando varios estratos con aspecto en empalizada, llamadas tricomoides, de naturaleza secretora (Figura 2E); el mesófilo de estas brácteas está conformado por parénquima de células isodiamétricas, la epidermis adaxial es uniestratificada y presenta células taníferas (Figura 2F-G). Las células taníferas fueron detectadas por la coloración pardo-rojiza de los taninos condensados en la pared del sicono (datos no mostrados). Las brácteas transicionales se encuentran paralelas a las externas, son lanceoladas, delimitan pequeños espacios entre ellas, con un mesófilo parenquimático sin espacios intercelulares aparentes; su epidermis abaxial y la adaxial generalmente carecen de taninos. Las brácteas internas guardan un mayor contacto con la pared interna del receptáculo, no se entrelazan entre sí y tienen sus extremos libres, péndulos y verticales hacia el interior del sicono, mientras que sus epidermis carecen de taninos y el mesófilo está constituido por células parenquimáticas (Figura 2B, E). La pared del sicono es gruesa y en su interior se encuentran múltiples primordios florales que se intercalan, sin un orden aparente; los femeninos darán lugar a flores sésiles o pediceladas (Figura 2D). Los primordios masculinos se presentan en menor proporción que los femeninos. Cada botón floral se encuentra protegido por una bractéola que sobrepasa el tamaño de los botones florales y cubre a los sépalos (Figura 2D).

Fase A2. La caracterización morfológica descrita en la primera fase es similar, con un incremento de tamaño del sicono (en promedio, 10.7 mm de largo y 9.5 mm de ancho); el ostiolo está hundido con respecto al anillo ostiolar (Figuras 1B, 2H-J). Las brácteas de transición presentan características similares a las observadas en la Fase A1, en tanto las internas son ligeramente laxas, separadas unas de otras y sus extremos libres se extienden hacia el interior del sicono (Figura 2H-I); los tricomoides se registran en la superficie de las brácteas ostiolares externas y en el anillo ostiolar (Figura 2I-J, L). La pared que forma el receptáculo de la inflorescencia presenta múltiples estratos parenquimáticos, con algunas células taníferas dispersas (Figura 2L). Las flores femeninas maduran y los estigmas están receptivos formando un sinestigma (Figura 2H, K).

Fase B. Continúa el crecimiento del sicono (12.1 mm de largo × 11.1 mm de ancho, en promedio), el cual adquiere una tonalidad verde pálido, con máculas verde amarillentas a ligeramente rojizas y, a partir de esta fase, las brácteas basales lo cubrirán sólo parcialmente (Figura 1C-E). Esta fase se caracteriza por la entrada de las avispas al sicono (Figuras 1F, 2M-O), que polinizarán las flores femeninas (Figura 2Q), lo que se asocia con el color rojizo que presenta el anillo ostiolar y las brácteas del ostíolo (Figura 1E-F). Las brácteas externas presentan abundantes tricomoides, que forman casi la mitad de su grosor e incluso se extienden hacia la parte interna y externa del anillo ostiolar (Figura 2O-P), en tanto que las brácteas de transición e internas se notan menos compactas (Figura 2P). En la base y parte externa del anillo ostiolar se registran osmóforos con estomas (Figura 2R-S).

Fase C1. Al inicio de esta fase el ostíolo y el anillo ostiolar se tornan verdes con máculas verde amarillentas (Figura 1G), mientras que el sicono aumenta nuevamente de tamaño con respecto a la fase previa, con un promedio de largo y ancho de 13.9 y 13.5 mm, respectivamente. El ostiolo permanece ligeramente cóncavo (Figura 3A-C). Las brácteas externas pierden su rigidez, principalmente las más externas y los tricomoides siguen siendo evidentes, pero van colapsándose (Figura 3H). Las brácteas de transición presentan una disposición más curva, con espacios pequeños entre sí, las brácteas internas más delgadas, descendentes, firmes entre ellas, debido al desarrollo de los frutos y a las agallas que contienen a las larvas de las avispas; las polinizadoras se encuentran muertas en la cavidad siconial (Figura 3A, D). Los osmóforos se distinguen como áreas abultadas, secretoras y con estomas abiertos (Figura 3E-G).

Fase C2. El sicono tiene una apariencia similar a la de la fase anterior (Figura 1G), pero se registró una disminución de sus dimensiones (promedio de 11.2 mm en su largo y ancho). Las brácteas ostiolares intermedias se ven más compactas; el ostiolo se observa ligeramente plano a cóncavo (Figura 3I-K) y los tricomoides de las brácteas externas se reducen (Figura 3M). Las agallas con larvas de avispas (ovarios con tonalidad negra) y los frutos (pardos pálidos) continúan su desarrollo en el interior del sicono, lo que conlleva a una evidente reducción de la cavidad siconial (Figura 3I, L).

Fase C3. Nuevamente la apariencia del sicono es similar al observado en la Fase C2 (Figura 1G), pero su tamaño promedio es mayor al de las dos fases previas (16.8 mm tanto en largo como en ancho). El anillo ostiolar delimita al ostiolo, de manera que éste ocupa ahora una posición más profunda (Figuras 1G, 3N, Q-R); los tricomoides de las brácteas externas reducen su tamaño y se desintegran y éstas se separan ligeramente unas de otras y tienen un menor diámetro que las brácteas de transición, en tanto que las internas, se observan laxas (Figura 3R). Las flores masculinas completan casi su desarrollo, al igual que los frutos y las avispas; la cavidad siconial casi desaparece (Figura 3O-P).

Fase D. Los siconos en esta etapa se tornan amarillentos (Figura 1H-I) y son tenuemente blandos al tacto; su tamaño promedio es de 16.4 mm de largo y 17.2 mm de ancho; la apariencia del ostíolo es similar a la fase previamente descrita (Figuras 1G, 4B-C). Internamente, las anteras de las flores masculinas están maduras (Figura 4A). Las brácteas externas están conformadas por células de parénquima, con tricomoides secretores (Figura 4C-D); las de transición e internas presentan una disposición irregular, con mayores espacios entre ellas (Figura 4B, D) y los osmóforos se encuentran colapsados (Figura 4E). Las avispas macho cavan túneles en la pared del sicono (Figura 1I), que permite que salgan las avispas hembra fecundadas y con polen.

Fase E. Los siconos son rojizos, tanto en la pared externa e interna, muy blandos al tacto, con un sabor ligeramente dulce y su tamaño promedio, cuando se compara con todas las fases previas, es el mayor (20.9 × 22.9 mm de largo y ancho, respectivamente); se observan orificios en el sicono (Figura 1J), que es la evidencia externa de los túneles por los que escaparon las avispas hembra; la cavidad siconial es amplia (Figura 4F). El ostiolo mantiene una disposición cóncava (Figura 4H); las brácteas externas e intermedias adquieren una disposición ordenada y muy juntas entre sí, en tanto que las internas se separan, presentando una apariencia más laxa (Figura 4G, I). Las flores femeninas y masculinas están senescentes, se observan agallas huecas, sin avispas dentro de ellas y las semillas se encuentran maduras en el interior de los frutos (Figuras 1K, 4F).

Análisis del tamaño de los siconos. Con excepción de la Fase C2, el largo y ancho del sicono mostró un incremento gradual. Con respecto a la primera de estas dimensiones, las etapas de desarrollo mostraron diferencias estadísticamente significativas (F_7,224 = 1,417, P < 0.000). La Fase E fue la que presentó la diferencia más notable (Figura 5A). Por su parte, la comparación considerando el ancho de los siconos, también fue significativa (F_7,224 = 1,247, P < 0.000) y coincide con el primer análisis respecto a la distintividad de la Fase E, aunque el ancho del sicono también es contrastante para otras fases (Figura 5B).

Avispas polinizadoras y cleptoparásitas. Se recolectaron durante las fases de desarrollo B y D del sicono las avispas polinizadoras de ambos sexos del género Pegoscapus sp. Las hembras son aladas (Figura 6A-B), con lamelas en las mandíbulas (Figura 6C). Las avispas presentan corbículas en el mesosoma (cavidades para el transporte de polen), peines coxales (Figura 6E-F) y un ovipositor (Figura 6A-B, D). Por su parte, los machos presentan una morfología contrastante, ya que son ápteros, ciegos y no tienen estructuras para transportar polen (Figura 6G-H). En la fase D, también se identificó la presencia de avispas hembras no polinizadoras (Idarnes sp.), que se caracterizan porque tienen ojos rojos y su ovipositor es más largo (Figura 6I) del que presentan las avispas polinizadoras; la dimensión del ovipositor le permite atravesar la pared del sicono desde el exterior y ovipositar flores femeninas durante la fase B. En esta misma etapa, se encontraron avispas macho de Idarnes sp., que al igual que los de su sexo en Pegoscapus sp., carecen de alas y visión (Figura 6J-K).

Discusión

Desarrollo de los siconos. Las diferencias morfológicas externas más evidentes a lo largo de las fases de desarrollo del sicono de F. tuerckheimii, son el incremento gradual de su tamaño, que difiere de manera significativa entre ellas, así como los cambios de color de la pared siconial y del ostíolo (Figuras 1 y 5). Lo anterior concuerda, en lo general, con lo documentado para F. aurea (^{Hernández-Sosa & Saralegui-Boza 2001}) y en menor medida con F. petiolaris (^{Piedra-Malagón et al. 2019}). Las diferencias entre esta última especie y F. tuerckheimii es que la pared externa del sicono de F. petiolaris presenta tricomas y que, en la Fase E, despliega una coloración verde amarillenta. Los únicos tricomas externos encontrados en la especie incluida en el presente estudio corresponden a los tricomoides, tanto en las brácteas externas del ostíolo, como en el anillo ostiolar (Figuras 2-4).

Los siconos muestran una morfología externa similar cuando inician su desarrollo (fases A1 y A2), con incrementos de tamaño no estadísticamente significativos (Figura 5), si bien internamente se presentan cambios importantes en las brácteas ostiolares y en la maduración de las flores pistiladas (Figura 2). Durante la Fase A1 se destacó una estructura discoide en la base de los siconos, más evidente en la medida que éstos se desarrollan (Figura 1). Esta estructura es característica del complejo F. aurea, ya que no se ha observado en otras especies de la sect. Americanae y permite el desarrollo del pedúnculo de los siconos (^{Hernández-Esquivel et al. 2020}). No fue posible esclarecer el origen anatómico de esta base discoide, lo que demanda un estudio detallado. La inclusión de otras especies del complejo F. aurea aportaría información valiosa sobre la posible relevancia sistemática de esta estructura.

La Fase B es reconocida, con mayor facilidad, por la presencia de las avispas polinizadoras en el interior del sicono, un evento que pudo ser inferido por el registro de alas atrapadas en las brácteas ostiolares externas (Figura 2N-O), y también, directamente, al observarlas entre las últimas brácteas ostiolares internas, a punto de entrar hacia la cámara siconial (Figura 2M). Además, la observación de distintos siconos en fase B, indica la presencia de 2 a 3 avispas hembra de Pegoscapus sp. en su interior (Figura 1F), lo que concuerda con lo registrado para otras especies (^{Bronstein & Hossaert-McKey 1995}, ^{Gibernau et al. 1996}, ^{Hernández-Sosa & Saralegui-Boza 2001}, ^{Piedra-Malagón et al. 2019}), aunque en uno de los siconos se observaron más hembras (Figura 3A). Hasta donde se conoce, el color rojizo del ostíolo y del anillo ostiolar en esta fase de desarrollo (Figura 1E-F), que permite su contraste del resto de la pared siconial, no ha sido destacado previamente para otras especies del género.

La forma del ostíolo se ha relacionado con la morfología de la avispa polinizadora. ^{Ramírez (1974)} y ^{Verkerke (1989)} mencionan que en los representantes de la sect. Americanae, todas las brácteas se entrelazan para formar una vía helicoidal hacia la cavidad del sicono, un arreglo que coincide al encontrado en F. tuerckheimii (Figura 1F). ^{Ramírez (1974)} también indicó que las avispas del género Pegoscapus tienen adaptaciones morfológicas que les permiten la entrada a través del ostíolo (e. g. apéndices mandibulares pequeños y con lamelas; Figura 6C). Este tipo de ostíolo es descrito por ^{Machado et al. (2013)} en F. enormis, especie restringida a Sudamérica, quienes también encontraron, en las brácteas ostiolares externas, los tricomoides, de naturaleza secretora, lo que concuerda con F. tuerckheimii (Figuras 2-4). Se ha encontrado que la interacción Ficus-Agaonidae puede estar vinculada por la emisión de compuestos volátiles del sicono (^{Grison-Pigé et al. 2002a}, ^b) y es posible que los tricomoides y osmóforos puedan desempeñar un papel relevante al respecto; su comprobación demanda la realización de estudios particulares a futuro. La presencia de peines coxales en las patas delanteras y de las corbículas en la avispa polinizadora de F. tuerckheimii (Figura 6E-F) es indicadora de una polinización activa (^{Kjellberg et al. 2001}, ^{Jousselin et al. 2003}, ^{Zhang & Yang, 2017}). Este tipo de polinización se asocia con siconos monoicos (sistema reproductivo característico de las especies de la sect. Americanae) y que presentan sinestigma (^{Verkerke 1989}, ^{Jousselin et al. 2003}), estructura registrada en el presente estudio (Figura 2H, K).

La Fase D, en F. tuerckheimii, puede ser inferida por la consistencia ligeramente blanda al tacto del sicono y por su coloración primordialmente amarilla (Figura 1H-I). Este color de sicono se ha observado también en otras especies incluidas anteriormente en el complejo F. aurea, que son similares en distintos aspectos de su biología reproductiva (^{Hernández-Esquivel et al. 2020}). Uno de ellos es que en F. aurea, los orificios para que las avispas hembra salgan del sicono, se ubican en su pared (^{Hernández-Sosa & Saralegui-Boza, 2001}), evento que también fue observado en la especie bajo estudio (Figura 1I-J). Cabe destacar que, en otras especies, estos orificios pueden ser cavados a través del ostíolo, como acontece en F. petiolaris (^{Piedra-Malagón et al. 2019}).

Por otro lado, la Fase E resultó la más contrastante entre las descritas para F. tuerckheimii, ya que el sicono alcanza sus mayores dimensiones (Figura 5), además de que se torna rojo y ligeramente dulce, ambas características que comparte con las especies previamente incluidas dentro del complejo F. aurea (^{Ibarra-Manríquez et al. 2012}, ^{Hernández-Esquivel et al. 2020}). ^{Herre (1996)} destaca que entre las especies que estudió en Panamá, del subg. Urostigma (ahora subg. Spherosuke), existe una asociación de siconos pequeños, que maduran de color rojo y que son dispersados por aves, características que coinciden con el síndrome de dispersión ornitócora asociado a cierto grupo de especies de Ficus (^{Lomáscolo et al. 2008}, ²⁰¹⁰). ^{Herre (1996)} también asocia estos atributos con una producción de frutos asincrónica, aunque no es claro si se refiere a una asincronía poblacional o la que puede desplegar un individuo. Si bien determinar esta estrategia fenológica no fue un objetivo del presente trabajo, las observaciones de campo realizadas a lo largo del estudio muestran que la asincronía en la copa de un individuo es posible, ya que en una ramilla se pueden registrar siconos en distintas fases de desarrollo, tanto en la localidad de estudio (Figura 1), como en otras regiones de México. Esta estrategia reproductiva también se registró en F. petiolaris por ^{Piedra-Malagón et al. (2019)}. ^{Smith & Bronstein (1996)} indican que la asincronía individual observada en F. insipida y F. petiolaris puede explicarse por la baja densidad de árboles a nivel regional, para permitir la persistencia de las avispas polinizadoras. Por su parte, ^{Bronstein & Patel (1992)} destacan que la maduración asincrónica o sincrónica de F. aurea, dependerá de que existan condiciones adecuadas para el vuelo de los polinizadores. Este tema es sin duda relevante para el entendimiento de la relación mutualista entre F. tuerckheimii y las avispas que lo polinizan y sería interesante realizar estudios futuros.

Con respecto a las avispas que se encontraron en los siconos de F. tuerckheimii, ^{Ramírez (1970)} destacó que en esta especie existen dos polinizadoras del género Pegoscapus (P. carlosi Ramírez y P. mariae Ramírez). A pesar de que ^{Wiebes (1995)} reconoce ambas especies y las incluye dentro de la clave del género, separar las especies con base en la morfología que despliegan no es totalmente confiable, ya que se han detectado especies crípticas (^{Molbo et al. 2003}). Ante estos problemas taxonómicos, el nivel de determinación de las especies de Pegoscapus (avispas polinizadoras) e Idarnes (avispas parásitas) en el presente estudio, se limita sólo a nivel del género.

El presente trabajo aporta información para caracterizar el desarrollo del sicono de F. tuerckheimii, especialmente el reconocimiento por medio de características externas e internas de las fases críticas (B y D), en las que interactúa con avispas polinizadoras o parásitas. También deja abierta una serie de interrogantes que será interesante resolver a futuro, como la naturaleza anatómica de su disco basal, determinar las especies de polinizadoras y parásitas con las que interactúa en las localidades de estudio, cuantificar el grado de asincronía de los siconos a nivel individual o poblacional, la amplitud de la fauna de frugívoros que dependen de la disponibilidad de siconos en Fase E o si lo encontrado en la presente investigación, es similar en otras localidades de México y Centroamérica. Ante la limitada información que existe para el desarrollo de los siconos para las especies americanas, se espera que el presente estudio motive la realización de investigaciones similares en otras especies y localidades del Neotrópico.