Materiales y métodos

Material vegetal. Consistió en una variedad mejorada, tres variedades nativas (una de testa color blanco con semillas grandes y dos de testa de colores oscuros de diferentes tamaños), y dos formas silvestres de Phaseolus coccineus L. colectadas en México en 2016 (Tabla 1 y Figura 1).

De las dos formas silvestres, el material del Tezcutzingo derivaba de una población con posibilidades de infiltración genética con cultivos de la misma especie y tenía semillas visiblemente más grandes; el material de Ocotitlán provenía de una población más aislada. De las variedades con testa color blanco, una era mejorada y la otra nativa; generalmente, se consideran con mayor grado de domesticación a las semillas con testas más claras (^{Fuller & Allaby 2009}). Por lo que los materiales representan un gradiente de domesticación.

Para obtener semilla recién cosechada, las colectas se sembraron en macetas de 5 kg de capacidad, aisladas espacialmente (6 km) para evitar el entrecruzamiento entre colectas. La semilla sobrante se está conservando en la colección de trabajo del Programa de Botánica del Colegio de Postgraduados en Montecillos, México.

Preparación de muestras. Se utilizaron seis lotes de 35 semillas cada uno para determinar: 1) biomasa en embrión, 2) concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en embrión; 3) número de amiloplastos en cotiledón, 4) biomasa en raíz, vástago y cotiledón remanente; 5) concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en raíz y vástago de plántulas desarrolladas en oscuridad; y 6) enzimas que degradan el almidón.

Biomasa de embrión. Se hidrataron 10 semillas por colecta durante 24 h a 25 ^oC para facilitar la separación del embrión de la testa. Las semillas se colocaron entre dos capas de papel filtro (Alstrom Núm. 541) humedecidos con 10 mL de agua destilada dentro de cajas Petri de 9 cm de diámetro. Posterior a la eliminación de la testa, cada uno de los embriones se secaron por separado en una estufa de secado marca Blue modelo M por 72 h a 75 °C y se pesaron en una balanza analítica Sciencetech modelo SA 120 (± 0.001 g).

Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en embrión. Los embriones individuales de cada colecta se pesaron, y se maceraron uno por uno, con agua destilada y etanol al 80 %. Se calentaron a 80 °C durante 40 min en baño María. La muestra se separó en: fase líquida, utilizada para la medición de glucosa, fructosa y sacarosa, y en fase sólida (50 mg), para la determinación de almidón. La fase sólida se colocó en baño María a 90 °C por cuatro h, se enfrió a temperatura ambiente, se secó a 60 °C por 12 h y se maceró. El contenido de almidón se determinó con el método de hidrólisis enzimática. Incluyó la despolimerización mediante la hidrólisis al sobrecalentar el almidón y la acción de las enzimas β-glucosidasa (10 U), α- amilasa (1 U) y acetato de sodio, marca Sigma Aldrich.

La concentración de glucosa, fructosa y sacarosa fue evaluada por el método enzimático propuesto por ^{Viola & Davies (1992)}. Se determinaron los glúcidos a través de la adición secuencial de las enzimas hexoquinasa (0.3U/10µL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH, 0.3U/10µL), fosfoglucosa-isomerasa (PGI, 0.3U/10µL) e invertasa (0.3U/10µL). En una microplaca con 96 pocillos se añadieron 5 µL de extracto etanólico, 155 µL de muestra de reacción y 10 µL de cada una de las enzimas. Se sometió a un periodo de incubación de 30 min a 37 °C, en la adición de la G6PDH y la PGI, y 45 min a 30 °C en la adición de la invertasa. La absorbancia fue medida con un espectrómetro de microplacas (Multiskan FC, Thermo Fisher Scientific Inc. EE.UU.) a una longitud de onda de 340 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una curva estándar de glucosa a 5 mM, con una R ² = 0.97.

Número de amiloplastos en el cotiledón. Cuatro semillas de cada ayocote se desinfectaron y escarificaron con un escalpelo en el lado opuesto al hilum, se colocaron en cajas Petri con discos de papel filtro y se humedecieron con agua destilada a temperatura constante de 25 °C. Una vez que la radícula emergió a través de la testa, en cada semilla se hicieron cuatro cortes histológicos en la parte media del cotiledón. Dichos cortes se fijaron en FAA, se deshidrataron gradualmente en alcoholes, se incluyeron e infiltraron en parafina en un cambiador automático de tejidos marca TISSUE-TEK II y se hicieron cortes con un micrótomo rotatorio marca ERMA INC. a 10 micras y se tiñeron con ácido peryódico y reactivo de Schiff (^{Johansen 1940}). El número de los amiloplastos (granos de almidón) se determinó en campos de 40x en un microscopio Zeiss, modelo Axioscope 2, y se transformó a número de amiloplastos por mm². Se obtuvieron imágenes con una cámara digital Amscope y el programa Image J.

Detección de enzimas degradadoras de almidón. En cotiledones de semillas escarificadas y en germinación se detectó la presencia de enzimas en cada colecta. Para ello se utilizó un gel nativo discontinuo de acrilamida con amilopectina de papa en una cámara de electroforesis Bio Rad.

El contenido del gel separador fue: 1.25 mL de acrilamida: bisacrilamida 30:08, 6.25 µL de amortiguador pH 8.8 (3M), 10 mg de amilopectina de papa en 500 µL de agua destilada, 2 µL de CaCl₂ (100 mM), 5 µL de MgCl₂ (100 mM), 2.625 mL de agua destilada, 5 µL de TEMED, y persulfato de amonio al 10 por ciento. El contenido del gel apilador fue: 310 µL de bis-acrilamida: bisacrilamida 30:08, 620 µL de amortiguador TRIS a concentración de 0.5M, 1.52 mL de agua destilada, 5 µL de TEMED, 30 µL de persulfato de amonio al 10 % preparado con 30 mg de persulfato en 300 µL de agua destilada.

La separación de enzimas se hizo con 20 mg del cotiledón de semillas escarificadas y embebidas por 24 h a 25 °C, condiciones que permitieron homogeneizar el tiempo de germinación de las semillas. Las muestras se colocaron en tubos Eppendorf con 50 mL de amortiguador de extracción: 2.5 mL de acetato de sodio a concentración de 0.5 M y pH 5.5, 275 µL de CaCl₂ a concentración de 100 mM, 275 µL de MgCl₂ a concentración de 100 mM, 2.5 mL de etilenglicol, 25 µL de DTT (1 mM), 19.425 mL de agua destilada, y 50 µL de inhibidores de proteasa en 5 mL de agua destilada (concentración del 1 %).

Las muestras se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 min y el sobrenadante se colocó en tubos Eppendorf con 20 µL del amortiguador de carga (1/3 del volumen del extracto) y 5 µL de cada muestra. La fuente de poder se ajustó a 50 Voltios durante 4 h. El contenido del amortiguador de incubación fue: 5 mL de acetato de sodio, pH 5.5 a una concentración de 50 M, 500 µL de CaCl₂ a 1 mM, 500 µL de MgCl₂ a 1 mM, y 44 Ml de agua destilada.

El gel se tiñó con una solución de lugol de 20 % de KI y 10 % de I. Con esta tinción, los productos de la hidrólisis de la amilopectina y su electroforesis se tiñen de diferentes colores: las endoamilasas crean bandas incoloras, las β-amilasas bandas de color marrón más claro, y la acción de las enzimas desramificadoras crean bandas de color azul pálido (^{Kafekuda & Duke 1984}).

Biomasa en raíz, vástago y cotiledón remanente. Dos lotes de 15 semillas de cada colecta con pesos uniformes se escarificaron y colocaron en cajas Petri en una germinadora ESCO Isotherm a 20 °C hasta que emergió la radícula a través de la testa. Se trasplantaron a bolsas para cultivo de 15 × 25 cm con fuelle color negra calibre 500 (1 kg de capacidad) con vermiculita como sustrato y se mantuvieron en oscuridad a 22 ± 2 ^oC y 72 ± 1 % de humedad relativa hasta el inicio de marchitamiento del ápice del vástago, considerado como el fin de movilización de reservas de los cotiledones a la plántula. Una vez alcanzado este punto las plántulas de un lote se separaron en raíz, vástago y cotiledón remanente, se determinó su peso fresco y seco en una balanza analítica (± 0.001 g). El secado del material se realizó en un estufa de secado a 72 h a 70 ºC.

Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en raíz y vástago. Un grupo de cuatro plántulas fue separado en vástago, raíz y el remanente de los cotiledones. A cada órgano se le aplicó el procedimiento descrito en el caso del embrión, excepto en el remanente de los cotiledones. Las variables registradas fueron biomasa o peso seco del embrión, peso seco de raíz, vástago y remanente de cotiledones de la plántula (en g), concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en embrión, raíz y vástago (en µmoles g^-1 de peso seco), número de amiloplastos por mm² en tejido de cotiledón e identificación de enzimas en la degradación del almidón.

Diseño experimental y análisis estadístico. Los tratamientos fueron: una variedad mejorada (Blanco Tlaxcala), tres variedades nativas (Nombre de Dios, Tlayacapan, Zitlaltepec, y dos colectas silvestres (Tetzcutzingo y Ocotitlán), lo que equivale a seis tratamientos; se distribuyeron en un diseño completamente al azar. La unidad experimental estuvo representada por cada una de las semillas o plántulas. Se verificó la independencia, normalidad y homogeneidad de varianza de los datos. Cuando no se cumplieron estos supuestos fueron transformados a logaritmo y/o raíz cuadrada. Posteriormente se sometieron a ANDEVAS y pruebas de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). Asimismo, se hicieron ANDEVAS y comparación de medias de domesticados versus silvestres. Todos los análisis se hicieron con el paquete estadístico SAS (^{SAS 2012}).

Resultados

Biomasa del embrión. El embrión de semillas de ayocotes domesticados tuvo 11 veces más biomasa en promedio que el embrión de los ayocotes silvestres (0.803 vs. 0.073 g). Los ayocotes domesticados, Nombre de Dios y Zitlaltepetl, presentaron pesos mayores de embrión con respecto a Blanco Tlaxcala y Tlayacapan. En los ayocotes silvestres, el peso seco del embrión de Tetzcutzingo fue significativamente mayor que el de Ocotitlán (Figura 2).

Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en el embrión. Las concentraciones de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en los ayocotes silvestres fueron estadísticamente mayores que en los domesticados (Tabla 2). Se expresaron en µmoles g^-1 de peso seco que refleja el número de moléculas. Por lo tanto, los silvestres con semillas más pequeñas tuvieron más moléculas de azúcar por gramo que los domesticados. La diferencia en promedio entre las dos formas fue significativa (p < 0.0001) (Tabla 2).

Entre los ayocotes silvestres no se observó diferencia significativa en la concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa. En los ayocotes domesticados, la concentración de almidón fue similar. En los azúcares solubles no se observó una tendencia. La concentración de glucosa fue menor en Zitlaltepec, la concentración de fructosa fue mayor en Tlayacapan, y la concentración de sacarosa fue menor en Blanco Tlaxcala con respecto a las otras variedades (Tabla 2).

Número relativo de amiloplastos en el cotiledón. Se observaron diferencias sustanciales y significativas en el número relativo de amiloplastos por unidad de superficie en los cotiledones de los ayocotes. En tendencia, los domesticados tuvieron 426 menos amiloplastos mm^-2 que los silvestres. Entre los ayocotes domesticados, la variedad mejorada Blanco Tlaxcala y la nativa Nombre de Dios, mostraron 90 % más amiloplastos que las variedades Tlayacapan y Zitlaltepetl (Tabla 3).

Enzimas degradadoras de almidón en cotiledones. Se observaron diferencias en las diferentes enzimas relacionadas con la degradación de almidón (Figura 3). Todos los materiales tenían endoamilasas (bandas apenas perceptibles en la parte superior del gel, con migración mínima). Igualmente, compartieron β-amilasas (bandas de color marrón más claro); hubo un patrón similar en los materiales domesticados blancos y en los dos silvestres, mientras los ayocotes oscuros mostraron mayor diversidad de estas enzimas. Todos los ayocotes, excepto la variedad mejorada Blanco Tlaxcala, tenían presencia observable de enzimas desramificadoras (color azul pálido, con poca migración).

Fin de movilización de reservas del embrión a la plántula. Todos los materiales terminaron la movilización de reservas tres o cuatro semanas después de la siembra: Blanco Tlaxcala 29 días después de la siembra (dds); Nombre de Dios, 23.4 dds; Tlayacapan, 27 dds; Zitlaltepetl, 23 dds; Teztcutzingo, 23 dds; Ocotitlán, 21 dds. No se observaron diferencias significativas.

Biomasa en raíz, vástago y cotiledón remanente en la plántula. Los ayocotes domesticados tuvieron 14 veces más biomasa en raíz, ocho veces más en vástago y siete veces más en el remanente de los cotiledones en comparación con los silvestres (Tabla 4). Entre los domesticados, la biomasa de la raíz de Tlayacapan y Zitlatelpec fue 35 % mayor con respecto a la de las otras variedades. En la biomasa del vástago y el remanente de cotiledón no se observó diferencia.

Entre las formas silvestres el peso del vástago y la raíz de Tezcutzingo fueron mayores que el de Ocotitlán; en el remanente del cotiledón no se observó diferencia (Tabla 4). El porcentaje de biomasa asignado a la raíz fue igual entre los ayocotes domesticados, pero diferente al asignado en los ayocotes silvestres. No se observó diferencia en el porcentaje de asignación de biomasa al vástago ni en el porcentaje del remanente en el cotiledón entre domesticados y silvestres.

Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en raíz y vástago. La concentración por gramo de biomasa de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa (medida en µmoles por g de peso seco) fue 6, 4, 14 y 8 veces mayor, respectivamente, en la raíz de las plántulas silvestres que en las domesticadas; en los vástagos no se observó esta diferencia (Tabla 5). En los ayocotes domesticados, destacan Blanco Tlaxcala y Nombre de Dios con la baja concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en raíz y vástago. Los ayocotes silvestres mostraron diferencias en el contenido de almidón tanto en raíz como en vástago (Tablas 5 y 6).

Discusión

Biomasa de embrión. La biomasa del embrión en los ayocotes domesticados y silvestres se encuentran en los intervalos señalados para el peso de las semillas por ^{Debouck (1994)} y ^{Vargas-Vázquez et al. (2014)}, tomando en cuenta que se pesaron sin testa. Se confirmó la observación de ^{Chacón-Sánchez (2018)} que el ayocote domesticado aumentó el tamaño de su semilla, comparado con las poblaciones silvestres, y comparado con otras especies de Phaseolus (P. coccineus: 5 a 6 veces más que los silvestres, P. vulgaris L. 4 a 6 veces, P. acutifolius de 3 a 6 veces, P. dumosos de 2 a 3 veces, y P. lunatus de 5 veces). Incluso, se encontró una relación 11 veces mayor en este estudio.

El gigantismo de la semilla, resultado del proceso de domesticación, se debe a una selección metódica e intencional (^{Darwin 1868}), y es una adaptación también a presiones de selección asociadas a la siembra y a la intensa competencia entre plántulas cultivadas (^{Harlan 1992}). Pero requiere una modificación de las vías metabólicas de las sustancias de reserva, especialmente del almidón y otros azúcares. Este fenómeno se ha observado, por ejemplo en tomates domesticados vs silvestres (^{Koenig et al. 2013}). Efectivamente, se observaron varias modificaciones en el ayocote que se describen a continuación.

Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en embrión. Los materiales silvestres destacaron por una concentración sustancialmente mayor de glúcidos (entre dos y 11 veces más en silvestres que en domesticados) en todas sus formas (almidón y azúcares solubles). El hecho que la misma cantidad de carbohidratos tenga un número mayor de moléculas, significa que sobre todo los almidones presentan formas con cadenas más cortas. Esto, a su vez, hace más eficiente el trabajo de las amilasas por razones de un acceso más fácil, y es congruente que así se presenten concentraciones mayores de azúcares cortos. Significa también que los materiales domesticados modifican su metabolismo para producir y almacenar almidones más largos, lo cual está asociado a la presencia de enzimas desramificadoras (^{Bernal & Martínez-Barajas 2006}) que fueron observadas en los materiales domesticados, excepto en Blanco Tlaxcala. También se observaron diferencias significativas en las concentraciones de los carbohidratos entre variedades domesticadas.

Esta es una observación novedosa en Phaseolus como un efecto de la domesticación. Por ejemplo, se ha encontrado que en plantas de frijol, las vainas en desarrollo muestran diferentes patrones de acumulación de azúcares entre cultivares (^{VandenLangenberg et al. 2012}). Sin embargo, no se ha estudiado la concentración (o sea, la cantidad total vs. el número de moléculas que en este estudio se determinaron). Se confirman datos previos que la sacarosa es el azúcar corto con mayor presencia y principal compuesto móvil (^{Bewley et al. 2013}). Sin embargo, puede haber diferencias entre especies. Durante la germinación del arroz, la glucosa y la fructosa son los azúcares más abundantes (^{Cheng et al. 2015}). Igualmente, se ha encontrado que la movilización de azúcares durante la germinación puede diferir sustancialmente entre germoplasma silvestre y domesticado, en el caso de pastos (^{Zhao et al. 2018}).

Detección de enzimas que degradan el almidón en el cotiledón. Se observó diversidad en el número y las características de las enzimas que degradan el almidón. Si bien los dos silvestres tuvieron un patrón similar, había más diversidad en los domesticados. Sobre todo, los dos materiales de testa oscura parecen tener enzimas con estructuras distintas a las demás. Estos resultados muestran que el estudio de las enzimas degradadoras de azúcares es un campo prometedor para entender los efectos de la domesticación, y la diversificación de los cultivos nativos posterior a su domesticación.

Aunque en la literatura actual no se comparan enzimas en embriones de semillas germinadas domesticadas y silvestres de una misma especie, sí se sabe que diversas enzimas hidrolizan el almidón. En embriones de chícharo (Pisum sativum L.) en germinación se han identificado diferentes tipos de enzimas desramificadoras (^{Zhu et al. 1998}), en la síntesis de amilopectina en tubérculos de papa existen diferentes isoformas de sintasas de almidón que actúan en forma sinérgica (^{Edwards et al. 1999}).

Biomasa en raíz, vástago, plántula y cotiledón remanente de plántulas. La mayor biomasa del embrión de los domesticados se reflejó en una mayor biomasa en la plántula, y mayor biomasa remanente en los cotiledones. Esto era de esperarse y se ha encontrado en otras especies también. Por ejemplo, la biomasa de plántulas de chirivía (Pastinaca sativa L.) 10, 20 y 30 días después de la siembra se relacionó positivamente con la biomasa de la semilla (^{Hendrix et al. 1991}).

Se esperaba que las reservas de las plantas silvestres, con sus semillas mucho más pequeñas, se hubieran terminado más rápidamente que en las domesticadas, con una marchitez del ápice más temprana. Sí se encontró que los promedios reflejaron el grado de la domesticación (con los extremos de 29 días en el Blanco Tlaxcala vs. 21 días en el Ocotitlán), pero estas diferencias no fueron significativas. Este tema debe ser estudiado con un mayor número de muestras para tener un dato más próximo a la media real de la población (^{Oehlert 2000}). Además, en las plantas, el estrés por energía ocasiona la detención del crecimiento y redirige la actividad celular hacía el metabolismo básico y la respiración (^{Rolland et al. 2006}, ^{Lastdrager et al 2014}). Dicho estrés fue ocasionado por la oscuridad prolongada, en la cual las plantas se desarrollaron y que se tradujo en el marchitamiento de la parte sub-apical del vástago por la inanición.

Las plántulas domesticadas y las silvestres tuvieron más biomasa en el vástago que en la raíz, confirmando resultados previos (p. ej. ^{Díaz-Ruiz 2012}, para plántulas de Phaseolus vulgaris L. domesticado). Sin embargo, se esperaba una mayor asignación de biomasa a la raíz, proporcionalmente, en los silvestres. Generalmente, la literatura indica que las formas silvestres tienen una asignación mayor a la raíz que las domesticadas en plantas adultas (p. ej. en teocintle, el maíz silvestre, ^{Szoboszlay et al. 2015}). Esto no se observó, al contrario; es posible que las plántulas de esta especie tengan otro comportamiento.

Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en raíz y vástago. El resultado más interesante fue la alta concentración de azúcares, tanto de almidón como de azúcares cortos, en la raíz de los materiales silvestres. Pero, también había diferencias entre los domesticados, con valores menores en los materiales de testa blanca. Las silvestres también tuvieron concentraciones más altas de almidón en el vástago, pero en los demás azúcares las diferencias eran menores. Nuevamente, se observaron diferencias significativas entre los domesticados, con una tendencia de más azúcares en los materiales oscuros.

Estudios recientes indicaron que la diversidad de transcriptomas entre órganos de plántulas de frijol común es mayor en la raíz debido a que es el primer órgano que se desarrolla después de la germinación (^{Singh et al. 2018}). Los transcriptomas son moléculas de ARN que se traducen en proteínas dentro de las células, y su mayor diversidad en la raíz quizá les permite codificar una mayor cantidad de enzimas que hidrolizan el almidón. Se tendría que ver si existen diferencias en la transcripción entre materiales o si se debe a una configuración distinta de almidones.

Este comportamiento, en conjunto con los resultados sobre la biomasa, sugieren que los materiales silvestres siguen una estrategia de no invertir en más biomasa de raíz al inicio, pero sí acumular las reservas para poder crecer rápidamente una vez que perciben otros factores del ambiente. Esta estrategia es la adecuada cuando el ambiente puede ser errático, y no es tan exitoso si la planta cuenta con condiciones ambientales adecuadas, como en los domesticados.

Esta interpretación es apoyada por el hecho que los materiales más domesticados, los de testa blanca, tenían las menores concentraciones de almidones en la raíz, pero las concentraciones en el vástago eran similares en todos los domesticados. Este resultado también confirma que las plántulas están constituidas por subunidades morfológicas y fisiológicas que funcionan como estructuras autónomas con respecto a la asimilación, distribución y asimilación del carbono (^{Watson & Casper 1984}).

Cabe mencionar que se confirmaron los resultados previos de que la sacarosa es el azúcar corto más abundante. Tanto en los ayocotes domesticados como en las silvestres, la concentración de sacarosa por gramo de biomasa es mayor que la concentración de glucosa y fructosa. La gluconeogénesis que ocurre en las semillas en germinación proporciona la glucosa para la síntesis de sacarosa (^{Nelson & Cox 2015}) y en plántulas de frijol común la sacarosa es el azúcar que más se transporta del mesófilo a las nervaduras (^{Köcher & Leonard 1971}). Sin embargo, no se había medido anteriormente en plántulas desarrolladas en oscuridad, sólo en juveniles y adultos.

Se muestra que el metabolismo de los azúcares varía considerablemente entre diferentes materiales de Phaseolus coccineus. También se identificaron varios patrones que diferencian los silvestres de los domesticados, pero casi siempre en un gradiente; esto es debido a que se tuvieron: material seleccionado por métodos de mejoramiento genético, donde la presión de selección es muy alta; material seleccionado por agricultores, donde la presión de selección no es muy alta y; material silvestre seleccionado naturalmente, donde la presión de selección es baja.

Es importante señalar que resultó fructífera la determinación de concentraciones (número de moléculas por gramo, que son los agentes activos en el metabolismo) en vez de contenidos, que es la medida estándar que se utiliza en la literatura. Se encontró que los materiales silvestres probablemente tienen moléculas más pequeñas de almidón. Se propone, que por su menor tamaño son más activas químicamente, se degradan más fácilmente con la ayuda de las enzimas, y por lo tanto liberan más azúcares solubles. Igualmente se encontró una asignación importante de azúcares a la raíz de las plántulas de materiales silvestres (y en forma gradual en las domesticadas), la cual probablemente faculta a la planta de reaccionar más rápidamente a señales del ambiente. La menor concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en el embrión, y la plántula de los materiales domesticados, podría considerarse un costo de la domesticación (^{Martínez-Ainsworth & Tenaillon 2016}).