Materiales y métodos

Sitio de estudio. El estudio se realizó en condiciones de invernadero en el Postgrado en Ciencias Forestales, Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados, Texcoco, Estado de México; ubicado en las coordenadas 19° 29´ N y 98° 54´ O, a 2,250 m snm. Durante el tiempo que duró el experimento, dentro del invernadero, se encontró un promedio de temperatura mínima de 12.0 y máxima de 36.7 °C y el promedio de la humedad mínima fue de 21.2 y la máxima de 84.4 %.

Germoplasma. Las semillas fueron donadas por el ejido Carrizal de Bravo, municipio de Leonardo Bravo, Guerrero, ubicado entre 17º 33´ 17” N y 99º 50´ 17” O. El clima, de acuerdo con el sistema de clasificación climática de Köppen, modificado por ^{García (2004)} es templado subhúmedo C(w) con 15 ºC de temperatura media anual y 1,253 mm de precipitación. Durante la recolecta se observó que la población de la especie estaba constituida principalmente por árboles adultos en etapa reproductiva; las características de los árboles y las zonas de recolecta se presentan en la Tabla 1.

Contenido de humedad. El contenido de humedad se determinó en cuatro repeticiones de 25 semillas cada una (100 semillas por árbol). A las semillas se les determinó su peso fresco y su peso seco en una balanza digital marca Sartorius con aproximación a 0.0001 de g. Para obtener el peso seco las semillas se colocaron en cajas de aluminio, y fueron secadas en una estufa a 103 °C durante 72 h (^{ISTA 2019}). El contenido de humedad con base en el peso de cada muestra se determinó con la fórmula: Por ciento de humedad = [(Peso fresco-Peso seco)/(Peso fresco)] × 100.

Peso de mil semillas. En una balanza analítica (Sartorius) se determinó el peso de mil semillas, para lo cual, se usaron 10 muestras de 100 semillas por árbol. Se determinó la media o promedio (Tabla 2).

La viabilidad de la semilla. Se emplearon cuatro repeticiones de veinticinco semillas por árbol. A las semillas se les aplicó una escarificación mecánica con lija, luego se remojaron en agua destilada a temperatura ambiente durante 12 h, se cortaron longitudinalmente y se colocaron en una solución de 2, 3, 5-trifenil-tetrazolio al 1 % (^{Bonner et al. 1994}) en condiciones de luz normal durante 2 h a temperatura ambiente.

Tratamientos. A la semilla (Figura 1A) se le realizó la escarificación mecánica alrededor, excepto en el ápice y la base, con la finalidad de desgastar parcialmente su testa (Figura 1B) después se realizó estratificación, imbibición o muesca para completar cada tratamiento. En la Figura 1C y D se muestra la semilla totalmente expuesta sin testa solo para conocimiento. Los tratamientos quedaron de la siguiente manera: T1, escarificación mecánica + estratificación a 5 °C durante 120 h; T2, escarificación mecánica + imbibición durante 12 h; T3, escarificación mecánica + un corte en la base de la semilla (se consideró como base de la semilla al extremo del eje embrional de donde emerge la radícula (Figura 1E) y T4, testigo sin tratamiento (Figura 1A).

Figura 1 A. Semilla con carúncula amarillo-anaranjada. B. Escarificación mecánica con lija en la testa. C. Escarificación mecánica con lija y fracturación de la testa después de la imbibición. D. Exposición de la semilla sin testa. E. Embrión y hojas cotiledonares de C. pentadactylon. 

Diseño experimental: Se utilizó un diseño de bloques al azar, cuyo modelo estadístico es Y_ij = µ + t_i + β_j + Ɛ_ij: µ media general, t_i efecto del i-ésimo tratamiento, β_j efecto del j-ésimo bloque, Ɛ_ij error experimental en la unidad experimental del i-ésimo tratamiento del j-ésimo bloque. Los bloques consistieron en cuatro árboles: bloque 1 (árbol 1), bloque 2 (árbol 2), bloque 3 (árbol 3), bloque 4 (árbol 4) con cuatro tratamientos (T1, T2, T3, T4) aleatorizados dentro de cada bloque. Se utilizaron charolas germinadoras hasta completar 800 cavidades, divididas en 4 bloques de 200 semillas, cada bloque se dividió en 4 lotes de 50 semillas para separar los tratamientos. La unidad experimental consistió en 50 semillas por tratamiento.

Siembra. La siembra se realizó en junio de 2016 a 1 cm de profundidad en charolas de germinación, se sembró una semilla por cavidad, en una mezcla de sustrato comercial: turba (60 %), agrolita (20 %) y vermiculita (20 %), se aplicó un riego con Captán (1 g L^-1) para prevenir el ataque de hongos. Se aplicó riego con una piseta cada tercer día. Se cuantificó el número de semillas germinadas cada 24 h durante 44 días. La velocidad de germinación se calculó de la siguiente manera:

Valor de germinación (VG).- Una expresión de la velocidad y totalidad de la germinación. VG = VP × GMD. VP (valor pico) es el valor máximo, es decir, el punto donde la germinación acumulada dividida por el número de días de la prueba es mayor. La GMD es el “número promedio de semillas que germinan por día del periodo de prueba real” (^{Czabator 1962}, ^{González-Zertuche & Orozco-Segovia, 1996}).

Análisis estadísticos. Se realizó el análisis de normalidad para el porcentaje de germinación mediante la prueba de Shapiro-Wilk, se verificó la homogeneidad de varianza con la gráfica de residuales vs. predichos. Se hizo el análisis de varianza (ANAVA) con el procedimiento GLM (SAS, 2004). Se utilizó la prueba de medias de Tukey (p ≤ 0.05) en un diseño de bloques completamente al azar.

Resultados

Contenido de humedad y peso de mil semillas. En general, el contenido de humedad fue menor a 10 %, las semillas del bloque 1 presentaron el mayor porcentaje de contenido de humedad (9.91 %), seguido del bloque 2 (8.81 %), bloque 4 (7.91 %) y finalmente el bloque 3 (7.66 %), para los cuatro bloques (árboles) el promedio del contenido de humedad fue de 8.57 %. El promedio de número de semillas por kilogramo es de 33,097. Las semillas del bloque 1 presentaron el mayor peso de semilla (Tabla 3).

Viabilidad. En los cuatro árboles la viabilidad fue del 100 %. En las semillas se observó que el embrión presentó un color rojo.

Germinación, velocidad de germinación y germinación media diaria. Se graficó el porcentaje final de germinación en cada tratamiento, en la Figura 2 se muestra el efecto de los tratamientos pregerminativos (T1, T2, T3 y T4). Se puede observar que el bloque 1 y el bloque 3 tuvieron altos porcentajes de germinación con los tratamientos 1, 2 y 3. En los bloques 1 y 2 los tratamientos tuvieron un comportamiento similar: el T1 tuvo mayor porcentaje de germinación, seguido del T2, luego el T3 y al final el testigo (T4). En el bloque 3 el T2 superó al T1 y al T3. El bloque 3 y el bloque 4 se comportaron de manera más uniforme, sin embargo, el bloque 4 tuvo menor porcentaje de germinación con los tratamientos, respecto a los otros bloques. Las gráficas de germinación acumulada por intervalos de tiempo se muestran en la Figura 3, donde se observa la máxima capacidad de germinación y el tiempo en que se alcanza (días) y además el momento en que germinó la primera semilla. En la Tabla 4 se detalla la germinación media diaria GMD, velocidad de germinación VG, valor máximo en que ocurre la germinación VM y el día en que ocurre el valor máximo de germinación DVM. Se puede observar que la germinación inició 8 días después de la siembra y a los 44 días después de la siembra se mantuvo constante.

Figura 2 Capacidad germinativa o porcentaje de germinación de C. pentadactylon. Escarificación mecánica + estratificación en frío a 5 °C durante 5 días (T1), escarificación mecánica + imbibición durante 12 h (T2), escarificación + corte en la base de la semilla (T3), testigo (T4). 

Figura 3 Curvas de la germinación acumulada, T1 escarificación mecánica seguida de estratificación en frío a 5 °C durante 5 días, T2 escarificación mecánica + imbibición durante 12 h. T3 escarificación mecánica + corte en la base de la semilla, T4 testigo. 

Análisis estadísticos. De acuerdo con el análisis de varianza (p < 0.0001), se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos utilizados, el T1 tuvo el mayor valor de germinación (87 %), en segundo lugar, el T2 (83 %), en tercer lugar el T3 (77 %). El testigo (T4) obtuvo el valor más bajo con 7.5 % de germinación (Tabla 5), el promedio de germinación para los 4 bloques es de 63.62 %. Posteriormente se realizó una prueba de medias de Tukey (α = 0.05) para conocer al mejor tratamiento, sin embargo, con los resultados obtenidos de la prueba de medias se puede utilizar cualquiera de los tratamientos pregerminativos T1, T2 o T3 para conseguir un porcentaje de germinación superior a 77 %, que fue el porcentaje de germinación del tratamiento 3 (Figura 4).

Figura 4 Germinación de semillas de C. pentadactylon. Escarificación mecánica seguida de estratificación en frío a 5 °C durante 5 días (T1), escarificación mecánica + imbibición durante 12 h (T2), escarificación mecánica + corte en la base de la semilla (T3), testigo (T4). 

Discusión

Contenido de humedad y peso de mil semillas. En los cuatro bloques el contenido de humedad fue menor a 10 % lo que sugiere que la latencia estaba totalmente establecida, es decir, la cubierta seminal o testa endurecida se vuelve impermeable al agua o intercambio de gases, esta cubierta además de proteger al embrión puede preservar las semillas con bajo contenido de humedad durante largo tiempo (^{Varela & Arana 2011}). ^{Baskin &Baskin (2014)} reportan que cuando el contenido de humedad se encuentra arriba de 14 % la cubierta puede llegar a ser permeable en semillas con latencia física. Aunque lo anterior no es una regla general, existe una relación estrecha entre la impermeabilidad de la testa y el bajo contenido de humedad de la semilla.

Los inhibidores de la germinación en las testas imponen la latencia fisiológica de las semillas, ya que las deja en un estado de baja actividad metabólica disminuyendo su deterioro (^{Baskin et al. 2008}), lo cual resulta conveniente para las semillas de la manita, ya que éstas se encuentran en un ambiente expuesto a bajas temperaturas (bosque mesófilo de montaña) durante el invierno, lo que resultaría perjudicial para la germinación de las semillas en caso de que no tuvieran este tipo de latencia, de esta forma se asegura la viabilidad de la semilla aún después del invierno. El bloque 1 mostró el mayor contenido de humedad, esto pudo deberse a las condiciones ecológico-ambientales presentes en el lugar de recolecta o a las características del árbol, con aspectos fenotípicos diferentes, por ejemplo, las semillas del bloque 4 (árbol 4) provienen de un individuo sobremaduro (100 cm de diámetro y 35 m de altura). Las semillas de C. pentadactylon son ortodoxas y el promedio del contenido de humedad de los 4 bloques fue de 8.57 %, menor al reportado (9.38 ± 0.9) por ^{Osuna-Fernández et al. (1997)}.

Viabilidad de la semilla. En este estudio se observó que después de seis meses de almacenamiento a temperatura ambiente, las semillas del árbol de las manitas permanecieron viables. De acuerdo con ^{Osuna-Fernández et al. (1997)}, las semillas son ortodoxas y mantienen su viabilidad a través del tiempo. Este trabajo difiere de la investigación de García & Perales (1990) quienes reportaron que la pérdida de la viabilidad en las semillas almacenadas se comportó de la siguiente manera: al primer mes de almacenamiento germinaron 10 % de las semillas que estuvieron almacenadas en frío y 12 % de las que se almacenaron a temperatura ambiente; a los dos meses, sólo germinó 2 % de las que fueron almacenadas en frío y 4% de las semillas que se almacenaron a temperatura ambiente, y a partir del tercer mes, no germinaron las semillas, por lo que dichos autores sugieren que éstas pierden rápidamente su viabilidad. En el trabajo de García & Perales (1990) las semillas fueron recolectadas en San Cristóbal de las Casas, Chiapas, México, sin embargo, están subestimando la respuesta germinativa puesto que no realizaron tratamientos pregerminativos; en su primera siembra con semillas recién recolectadas obtuvieron un alto porcentaje de germinación en vermiculita (74 %) y en suelo de vivero (39 %). Otro factor importante para mantener la viabilidad de la semilla es tener una cantidad aceptable de árboles padres, por lo cual, cuando se comercializan las flores es difícil conseguir semilla, afortunadamente no es el caso del ejido Carrizal de Bravo, Guerrero, ya que existe una cantidad aceptable de árboles que favorecen la reproducción natural de la especie por semillas; así como la presencia de fauna silvestre que realiza la polinización cruzada (^{Toledo 1975}).

Germinación, velocidad de germinación y germinación media diaria. El incremento en el porcentaje de germinación después de la aplicación de los tratamientos confirma la presencia de latencia física en las semillas de C. pentadactylon. De acuerdo con la descripción de ^{Hartmann et al. (2011)} la semilla tiene latencia primaria exógena, causada por una modificación de la cubierta de la semilla, donde la capa exterior se vuelve impermeable al agua. El porcentaje de germinación obtenido, en los cuatro bloques fue menor a la viabilidad, es importante recordar que no siempre coincide la germinación con la viabilidad de la semilla ya que la germinación, además de la viabilidad, está influenciada por la latencia de la semilla y el tamaño del embrión (^{Bonner et al. 1994}), así como por factores bioclimáticos: temperatura, luz, gases y la humedad del suelo (^{Hartmann et al. 2011}). En esta especie es necesario realizar la escarificación mecánica antes de realizar la siembra ya que el tipo de latencia no permite la entrada de compuestos químicos. Por otro lado, para la variable velocidad de germinación se observó que en los cuatro árboles, el T3 (escarificación + corte en la base de la semilla) fue más eficiente.

^{Osuna-Fernández et al. (1997)} mencionan que el incremento en la capacidad germinativa (porcentaje de germinación) conforme transcurre el tiempo indica que las semillas de C. pentadactylon presentan también una latencia endógena para evitar la germinación hasta después del invierno. Generalmente, el rompimiento de la latencia en semillas con latencia física en condiciones naturales y artificiales (excepto mecanismos de escarificación) se ha asumido que implica la formación de una grieta en una estructura anatómica de la semilla o fruto a través de la cual el agua se desplaza hacia el embrión. La escarificación seguida de un corte en la base de la semilla (T3) aceleró la entrada de agua en la semilla para iniciar el proceso de germinación, permitiendo que dicho tratamiento tenga mayor velocidad de germinación (VG). De acuerdo con ^{Taylor et al. (1999)} la velocidad de germinación aumenta en forma directa con la temperatura, respondiendo a fluctuaciones estacionales y cotidianas, por lo que en este estudio la velocidad de germinación se favoreció con la temperatura del invernadero mayor a 30 °C durante el día y menor a l6 °C durante la noche.