Materiales y reactivos

Los reactivos utilizados para elaborar las películas fueron gelatina tipo B, carboximetilcelulosa (CMC) y glicerol (Merck, Alemania), además de agar papa dextrosa (PDA) y nitrato de potasio (Meyer, México). Todos los materiales fueron grado reactivo analítico.

Recolección y preparación de extracto de cáscara de coco

Se adquirieron frutos de coco (Cocos nucifera L.) en estado de madurez de consumo de un mercado local en Texcoco, Estado de México. La cosecha se realizó 24 h antes de la compra. Los frutos se trasladaron en contendedores de plástico al Laboratorio de Biomateriales del Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada - Unidad Legaria, del Instituto Politécnico Nacional, donde se descartaron aquellos que presentaron daños mecánicos o infección por fitopatógenos.

Para obtener el extracto de la cáscara de coco, se seleccionaron aproximadamente 15 frutos, los cuales se desfibraron y se les retiró el endocarpio. Las muestras desfibradas se trituraron en un molino de discos (148-2, The Bauer Co., EUA) y se secaron en una estufa digital (Fe-294AD, Feligneo, México) a 60 ± 2 °C durante 24 h. La extracción se realizó considerando el método descrito por ^{Nagarajan et al. (2015)}, con algunas modificaciones. Se mezclaron 15 g del material seco en 500 mL de etanol al 30 % (m/v). La mezcla se sonicó en un baño ultrasónico (TI-H-5, Elma, Alemania), se centrifugó (modelo K, International Equipment Co., EUA) a 1 750 rpm durante 30 min y se filtró con papel Whatman No. 1 (Whatman® International, Ltd., Inglaterra). Finalmente, la mezcla filtrada se concentró a 40 ± 2 °C en un rotavapor (RE-500, Yamato, Japón) y se liofilizó (FreeZone 4.5, Labconco™, EUA), obteniéndose así el extracto acuoso-etanólico de cáscara de coco (ECC). El ECC se almacenó en frascos ámbar herméticamente cerrados a 53 % de humedad relativa (HR).

Preparación de las películas activas

La gelatina (G), la CMC y el glicerol se disolvieron en agua destilada empleando una relación de 1:1:0.6, respectivamente. La solución se calentó a 90 °C en una parrilla eléctrica (SP1311325Q, Thermolyne™, EUA) con agitación constante (600 rpm) durante 1 h. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente (25 °C), y posteriormente se agregaron diferentes concentraciones de ECC: G-CMC (testigo, sin adición de extracto), 200/ECC (200 mg·L^-1 de extracto), 300/ECC (300 mg·L^-1 de extracto) y 400/ECC (400 mg·L^-1 de extracto). Finalmente, se vertieron 25 mL de la solución en cajas Petri (1.5 x 12 cm) y se colocaron en una estufa digital a 60 °C durante 24 h. Las películas secas se retiraron de las placas y se almacenaron en bolsas herméticamente cerradas y sin exposición a la luz hasta su análisis. Antes de cada caracterización, las películas se acondicionaron en un desecador a 25 °C y 53 % HR.

Caracterización de las películas

Análisis estadístico

Se realizaron análisis de varianza de una sola vía para evaluar las propiedades fisicoquímicas y antifúngicas de las películas, y pruebas de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05). Para los análisis se utilizó el programa estadístico MINITAB®. Todos los análisis se realizaron por triplicado y los datos se presentan como la media ± la desviación estándar.

Espesor y propiedades mecánicas

El espesor de las películas varió significativamente (P ≤ 0.05) entre los tratamientos (Cuadro 1). Las películas con 200/ECC, 300/ECC y 400/ECC incrementaron 3.4, 11.9 y 14.3 µm con respecto al testigo, respectivamente. Estos resultados sugieren compatibilidad entre los péptidos de la gelatina y los componentes del extracto, lo cual dio lugar al desarrollo y formación de una matriz compacta de mayor espesor. Un efecto similar fue reportado por ^{Ahmad et al. (2012)} en películas de gelatina con extractos de bergamota y limoncillo. Inicialmente, dichos autores observaron una interrupción en las cadenas polipeptídicas de la gelatina por la presencia del extracto, después estos polipéptidos fueron capaces de interactuar y formar enlaces con los compuestos fenólicos de naturaleza hidrofílica del extracto, dando lugar a una estructura con mayor magnitud. Cabe señalar que el espesor de las películas tiende a incrementar al incorporar agentes externos afines a la solución biopolimérica, ya que de lo contrario el agente podría saturar la solución y, por consiguiente, desarrollar estructuras delgadas, frágiles, quebradizas y con restos no solubles (^{Xue et al., 2021}). Asimismo, es determinante la obtención de un producto con mayor espesor como material de envase y posterior manipulación.

La fuerza de punción de la película de G-CMC fue de 24.5 N, con diferencia significativa (P < 0.05) comparada con los demás tratamientos (Cuadro 1). La mayor fuerza obtenida fue de 34.5 N con 200/ECC. La estabilidad de la matriz se pudo deber a las interacciones electroestáticas, y a los puentes de hidrógeno establecidos entre los grupos hidroxilo de los polifenoles del extracto y las moléculas hidrofílicas aceptoras de la gelatina en la matriz biopolimérica (^{Hoque et al., 2011}). En consecuencia, el incremento en la fuerza de las películas con ECC podría estar relacionado con la formación de una red biopolimérica estable en función de la concentración del extracto. Por otro lado, la fuerza de punción disminuyó significativamente (P < 0.05) en los tratamientos 300/ECC y 400/ECC, en comparación con 200/ECC. Como se mencionó anteriormente, en concentraciones elevadas de agentes externos, la solución satura los enlaces disponibles y genera una estructura densa. ^{Kan et al. (2019)} obtuvieron resultados similares en películas de gelatina/quitosano con extracto de Crataegus pinnatifida.

De manera similar al análisis anterior, la resistencia a la tensión disminuyó significativamente al incorporar 400 mg·L^-1 de ECC, con respecto al tratamiento con 300 mg·L^-1. Dicha disminución se pudo deber a la elevada concentración de compuestos fenólicos, lo cual generó una estructura heterogénea con áreas discontinuas en la película. Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{Kchaou et al. (2020)}. Asismismo, ellos señalan que las propiedades mecánicas disminuyen con la incorporación de extractos naturales en cantidades mayores a la saturación de la solución o al generar incompatibilidad con los biopolímeros de la matriz, ya que crea una disminución en la densidad de las interacciones intermoleculares y un aumento en el volumen libre entre las cadenas de gelatina, lo cual provoca fragilidad en las películas.

La mayor resistencia a la punción y a la tensión se alcanzaron cuando el extracto se aplicó en concentraciones bajas y medias (200 y 300 mg·L^-1). Este fenómeno ocurre por la estabilidad de la red biopolimérica generada a través de interacciones electroestáticas y puentes de hidrógeno entre el extracto y la matriz biopolimérica. Por otro lado, la máxima concentración de extracto (400 mg·L^-1) disminuyó las propiedades mecánicas, ya que los compuestos presentes en el extracto reducen la densidad de las interacciones intermoleculares, lo cual genera una red polimérica discontinua. Por lo tanto, la incorporación de ECC en la matriz biopolimérica modificó tanto las propiedades mecánicas como el espesor de las películas activas, sin comprometer su formación, manejo y desmolde. Valores mayores de resistencia y fuerza de punción son deseables en el desarrollo de películas biopoliméricas dirigidas al envasado de alimentos, debido a que reflejan la carga neta que pueden soportar durante su manejo.

PVA

El valor más bajo de PVA se obtuvo en las películas testigo (3.3 × 10^-11 g·m^-1·s^-1·Pa^-1), mientras que las películas con ECC incrementaron su valor en 0.4, 2 y 2.8 × 10^-11 g·m^-1·s^-1·Pa^-1, con 200/ECC, 300/ECC y 400/ECC, respectivamente (Cuadro 1). En general, la incorporación de ECC afectó significativamente (P < 0.05) los valores de PVA, ya que se registraron valores crecientes proporcionales a la concentración de extracto añadida a la solución filmógena. La alta permeabilidad se puede explicar mediante los procesos de sorción, difusión y desorción por los que transitan los polímeros de naturaleza hidrofílica y que están involucrados en el incremento de este parámetro (^{Xu et al., 2020}). En primer lugar, el fenómeno consiste en la sorción y solubilización de los biopolímeros, seguido de la difusión de las moléculas de agua en la matriz y la desorción o evaporación (fase de secado) de las moléculas de agua en la superficie de la película.

En el presente estudio, la concentración de los biopolímeros, el plastificante y el agua fueron los mismos; por tanto, el incremento en la permeabilidad fue ocasionado por la concentración del extracto añadido. ^{Dou et al. (2018)} encontraron que la PVA en películas de gelatina se vio afectada por la incorporación de extractos vegetales, ya que entre los polímeros y el extracto se formó una estructura de red densa, y con ello disminuyó la permeabilidad. En otro estudio, ^{Malherbi et al. (2019)} encontraron que la PVA en películas de gelatina con extracto de pulpa de guabiroba tuvo resultados variables con respecto a la concentración del extracto añadido.

Los resultados del presente estudio confirman que la PVA en películas de gelatina está relacionada con la proporción del extracto añadido a la solución. Así, a medida que se incrementa la cantidad de extracto, aumentan las áreas heterogéneas generadas por las interacciones G-CMC-ECC, las cuales desencadenan la discontinuidad en la red polimérica y generan el incremento en la PVA. La medición de dicho parámetro es determinante en películas dirigidas a la conservación de alimentos, debido a la necesidad de protección y a una barrera frente a la concentración de vapor de agua del ambiente y del alimento.

MEB

En las micrografías de la película testigo, se observa una estructura lisa, uniforme y sin grietas visibles (Figura 1a), lo cual refleja una buena compatibilidad y homogeneidad entre los polímeros de la matriz. Esta homogeneidad se atribuye a la afinidad entre la gelatina, la CMC y el glicerol en el medio acuoso. El agua favorece la formación de interacciones moleculares como puentes de hidrógeno entre estos biopolímeros (^{Nazmi et al., 2017}).

Figura 1 Imágenes de microscopia electrónica de barrido de la sección transversal de las películas de gelatina-carboximetilcelulosa (G-CMC) y las adicionadas con diferentes concentraciones de extracto de cáscara de coco (ECC) en magnificación de 1000x y 1500x. 

La estructura homogénea de la película se afectó cuando se adicionaron 200 mg·L^-1 de ECC (Figura 1b). Las rugosidades son evidencia de una dispersión del extracto en la matriz, donde intervienen interacciones hidrofóbicas del ECC y la formación de interacciones hidrofílicas con los compuestos fenólicos del extracto (^{Nor Adilah et al., 2020}).

En la sección transversal de las películas 300/ECC y 400/ECC (Figuras 1c y 1d), se aprecia una intensificación de rugosidades y cráteres, con secciones irregulares y discontinuas. La superficie heterogénea es consistente con el incremento de la concentración de extracto. Resultados similares fueron reportados por ^{Rasid et al. (2018)} en películas de gelatina con extracto de Centella asiatica L. Por tanto, conforme aumentó la cantidad del extracto, se intensificaron las rugosidades y grietas observadas en las películas. Además, estos cambios se correlacionan con la formación de enlaces intermoleculares entre polímeros (sección de FTIR). Finalmente, a pesar de que la adición de extracto incrementó la complejidad en la matriz, las discontinuidades en la red biopolimérica causadas por la adición de ECC no comprometieron la formación de las películas.

Color

Los mayores valores de luminosidad (L*) y del parámetro a* (rojo/verde) se obtuvieron con el tratamiento testigo (Figura 2). En contraste, las películas con ECC mostraron una disminución significativa (P < 0.05) en los valores de L* y, por consiguiente, un incremento en los valores de a* y b* (amarillo/azul). Esto indica que las películas perdieron luminosidad y adquirieron un tono amarillento, lo cual concuerda con los resultados del IA, ya que a medida que aumentó la cantidad de ECC en la matriz de G-CMC, incrementó el nivel de pardez en la película.

Figura 2 Luminosidad (L*), parámetros de color a* y b*, índice de blancura (IB) e índice de amarillez (IA) de las películas de gelatina-carboximetilcelulosa (G-CMC) y las adicionadas con diferentes concentraciones de extracto de cáscara de coco (ECC). 

Los resultados obtenidos fueron consistentes con el IB, donde también se observó un efecto significativo en función de la concentración del ECC. El valor más bajo de dicho parámetro se observó en el tratamiento con la mayor concentración de ECC (Figura 2). Esto indicó que el color de las películas testigo, al ser incoloras y translúcidas, pueden cambiar su tonalidad con un mínimo de concentración de aditivo. En este caso, los cambios observados en los parámetros de color se atribuyeron, principalmente, a la presencia de compuestos fenólicos del ECC, el cual presentó una coloración marrón al momento de su incorporación (^{Li et al., 2021}). Por tanto, la incorporación del ECC en la matriz de G-CMC modificó significativamente los parámetros de color de las películas. El desarrollo de nuevos materiales con aporte de color puede reducir la exposición a la luz, y así evitar daños oxidativos a los productos alimenticios, lo cual sugiere una tecnología de envasado mejorada.

Transmitancia de luz y opacidad

La incorporación del ECC en la matriz de gelatina y carboximetilcelulosa provocó cambios significativos (P < 0.05) en los valores de transmitancia en función de la concentración de extracto agregada (Figura 3). La transmitancia en películas con ECC incrementó a partir de 350 nm, mientras que en la película testigo fue desde 200 nm; es decir, se obtuvo una película traslúcida en todo el espectro de luz estudiado. Aunque la película de G-CMC fue translúcida y brillosa, la incorporación del extracto cambió la transparencia de la película a un color amarillo pardo.

Figura 3 Transmitancia de luz UV-Vis de las películas de gelatina-carboximetilcelulosa (G-CMC) y las adicionadas con diferentes concentraciones de extracto de cáscara de coco (ECC). 

El color aportado por el ECC se podría deber al alto contenido de lignina, la cual se caracteriza por absorber la luz UV, como se ha demostrado en diversas investigaciones (^{Shikinaka et al., 2020}). En el envasado de alimentos, son deseables los materiales que crean una barrera a la luz UV-Vis para reducir la peroxidación de lípidos, la pérdida de nutrientes y, con ello, evitar la generación de olores y sabores desagradables (^{Ge et al., 2018}). Por tanto, las películas con ECC obtenidas en el presente estudio poseen una ventaja como bloqueadoras de luz UV.

Los resultados obtenidos mediante UV-Vis indican una mayor opacidad a medida que aumenta la concentración del ECC (Cuadro 1). Tanto la transparencia como la opacidad de las películas son propiedades ópticas importantes en materiales dirigidos al envasado de alimentos. Una alta absorbancia indica mayor transparencia y, por tanto, menor opacidad (^{Khedri et al., 2021}). Dado que se trata de un color ligero aportado por el ECC, las películas mantuvieron una opacidad relativamente baja (Figura 4). Un resultado similar fue reportado por ^{Nor Adilah et al. (2020)} en películas de gelatina con extracto de cáscara de mango, donde el tinte amarillento observado fue atribuido a los carotenoides contenidos en el fruto debido a su estado de madurez.

Figura 4 Opacidad de las películas de gelatina-carboximetilcelulosa (G-CMC) y las adicionadas con diferentes concentraciones de cáscara de coco (ECC). 

Obtener una película con mayor opacidad para la industria de material de envasado podría parecer una desventaja, ya que es deseable un material translúcido; sin embargo, en alimentos con alto contenido de ácidos grasos, como el aguacate, el queso, la carne, entre otros, es indispensable la manipulación del alimento con un material que evite la oxidación frente a los rayos UV (^{Michelin et al., 2020}). En este sentido, el ECC podría ser una alternativa de aditivo natural para disminuir la transmitancia de luz UV e incrementar la opacidad en películas de G-CMC y, con ello, crear un material de envasado con propiedades de barrera en longitudes de onda de 200 a 350 nm.

FTIR

En los espectros FTIR de la película de G-CMC y sus interacciones con el ECC en diferentes concentraciones, se detectaron bandas características de la gelatina como la amida A en 3 270 cm^-1, amida B en 2 930 cm^-1, amida I en 1 634 cm^-1, amida II en 1 534 cm^-1 y amida III en 1 240 cm^-1 (Figura 5), las cuales representan los modos vibratorios del enlace peptídico de la gelatina. Estos hallazgos son consistentes con lo reportado por ^{Rasid et al. (2018)}. Adicionalmente, todas las películas mostraron bandas similares en el rango de 3 200 a 3 500 cm^-1, atribuidas a las interacciones de la amida A (vibraciones de estiramiento N−H) y a las interacciones intermoleculares e intramoleculares de los grupos −OH de los componentes poliméricos (gelatina, carboximetilcelulosa y glicerol). En las películas con ECC se muestra un incremento en el estiramiento de la banda −OH, lo cual se pudo deber a la cantidad de compuestos de naturaleza fenólica del extracto (^{Tanwar et al., 2021}).

Figura 5 Espectros de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier de las películas de gelatina-carboximetilcelulosa (G-CMC) y las adicionadas con diferentes concentraciones de extracto de cáscara de coco (ECC): a) G-CMC (testigo, sin adición de ECC), b) 200 mg·L^-1 de ECC (200/ECC), c) 300 mg·L^-1 de ECC (300/ECC) y d) 400 mg·L^-1 de ECC (400/ECC). 

Los picos de 2 930 cm^-1 y 2 880 cm^-1 son característicos de la amida B (vibraciones de estiramiento C−N y vibraciones de estiramiento asimétrico C=O). La interacción C−H en la banda 2 930 cm^-1 representa el anillo de metano de los átomos de hidrógeno del CMC, lo cual es consistente con lo reportado por ^{Kowalczyk et al. (2020)}. La banda 1 634 cm^-1 se atribuye a la amida I, que representa a los enlaces C=O de la gelatina, y al enlace de hidrógeno acoplado al COOH del CMC. La banda presente en 1 534 cm^-1 hace referencia a la amida II de la gelatina (interacciones de N−H y C=O). De igual forma, la amida II podría estar interactuando con el grupo −COOH del CMC (^{Esteghlal et al., 2018}). En 1 240 cm^-1 se encuentra identificada la amida III con enlaces N−H y C−N, y en la banda 915 cm^-1 se observan las interacciones de C−C y C−O del CMC (^{Kowalczyk et al., 2020}).

El estudio de los espectros FTIR se realizó con la finalidad de evaluar y determinar las interacciones entre los compuestos involucrados en la solución polimérica. La incorporación de ECC en las películas de G-CMC favoreció las interacciones intermoleculares e intramoleculares a través de enlaces no covalentes entre los grupos −OH de los compuestos.

Actividad antifúngica in vitro

La película de G-CMC no inhibió el crecimiento de las cepas R. stolonifer y A. niger (Cuadro 2), lo cual indica que esta película no posee propiedades antifúngicas ante las cepas estudiadas. Estos resultados son consistentes con lo reportado por ^{Sahraee et al. (2017)} en películas de gelatina. Lo anterior demuestra que los biopolímeros no poseen actividad inhibitoria.

Los tratamientos 200/ECC y 300/ECC mostraron actividad antifúngica al presentar un halo de inhibición de 64.17 y 64.10 mm para R. stolonifer, y de 64.10 y 64.87 mm para A. niger, respectivamente. Asimismo, al aumentar la concentración de ECC a 400 mg·L^-1 se obtuvo una mayor actividad inhibitoria contra ambas cepas fúngicas (Cuadro 2). La actividad antifúngica de la cáscara de coco está relacionada con la presencia de un alto contenido de catequinas. Además, varios estudios han reportado un alto contenido de lignina y taninos condensados en la cáscara de coco, a los cuales se les atribuyen acciones antibacterianas (Candida albicans, Escherichia coli y Staphylococcus aureus), antivirales y anticancerígenas (^{Prakash et al., 2018}).

El mecanismo plausible de la actividad biocida del ECC, reportado como fuente rica de lignina, se centra en la membrana celular, ya que provoca daños y ruptura en las células bacterianas y, en consecuencia, la muerte del microorganismo (^{Yang et al., 2016}). Adicionalmente, el efecto antimicrobiano es dependiente del tipo de extracción, condición climática, periodo de cosecha, entre otros factores (^{Kumar et al., 2021a}). Otros estudios han confirmado el efecto antimicrobiano de la lignina extraída de diversas fuentes biológicas (^{de Sousa-Nascimento et al., 2021}). Por ello, la incorporación del ECC en películas de G-CMC representa una alternativa de envase con acción fungicida para preservar la vida de anaquel de los alimentos, al controlar el deterioro causado por la proliferación de fitopatógenos.