Preparación de semillas

Las semillas de P. arizonica fueron proporcionadas por la Unidad de Manejo Forestal (UMAFOR) del poblado de San Juanito en el municipio de Bocoyna, Chihuahua. Las semillas se colocaron en un recipiente con agua del grifo durante 24 h para desechar las semillas flotantes que se consideraron inviables (^{Monroy-Vazquez et al., 2017}). Las semillas restantes en el fondo del recipiente se colocaron en papel secante húmedo en una bolsa de plástico resellable hasta la germinación. En el invernadero se utilizaron semilleros (con 77 cavidades) que se llenaron con un sustrato estéril de musgo de turba. Las semillas se colocaron a 0.5 cm de profundidad en el sustrato y se humedecieron con agua desionizada cada tercer día. Las plantas se mantuvieron en el invernadero de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ) a una temperatura promedio de 26.3 ± 1.06 °C y se fertilizaron con Trifol 60 Plus® 20-20-20 una vez al mes durante nueve meses, para garantizar el crecimiento.

Muestreo de campo de esporomas

Los esporomas de P. tinctorius y A. hygrometricus (Figura 1) se cosecharon en agosto del 2018 durante la temporada de lluvias en bosques templados ubicados en El Huérfano y en San Juanito, Bocoyna, Chihuahua. Las muestras se llevaron al Laboratorio de Biodiversidad de la UACJ para la extracción de esporas.

Figura 1 A) Esporomas de Astraeus hygrometricus, B) esporas de A. hygrometricus (100x), C) esporoma de Pisolithus tinctorius, D) esporas de P. tinctorius (100x). Regleta con escala a 10 µm. 

Preparación de inóculo fúngico

Los esporomas de A. hygrometricus y P. tinctorius se remojaron con agua destilada (para evitar posible contaminación por bacterias u hongos) en una proporción de 1:50 durante 2 h (^{Aguilar-Ulloa et al., 2016}). Después, los esporomas se colocaron por separado en una licuadora convencional y se licuaron hasta obtener una mezcla homogénea, que posteriormente se tamizó (abertura de malla de 1 mm) y se colocó en frascos de vidrio. El inóculo se mantuvo a 4 °C en la oscuridad hasta su uso en el invernadero. El número de esporas por especie se determinó mediante una cámara Neubauer y la concentración se ajustó a 10⁶ esporas∙mL^-1 (^{Konopická et al., 2021}).

Inoculación de plantas

Cuando las plantas de pino alcanzaron una altura promedio de 5 cm, el inóculo fúngico se aplicó al sistema radicular utilizando volúmenes de 10, 25 y 50 mL con jeringas de 10 mL; el inóculo de esporas (10⁶ esporas∙mL^-1) se aplicó dos veces en un mes (modificado de ^{Yin et al., 2018}). Asimismo, se utilizó el producto comercial Ectorrize® como control positivo, el cual tiene esporas de P. tinctorius y bacterias del suelo; del mismo modo, el número de esporas se ajustó a 10⁶ esporas∙mL^-1. El control negativo consistió solo en plantas sin inoculación. El número de plantas inoculadas en cada tratamiento se muestra en el Cuadro 1. La variabilidad entre la cantidad de plantas se debe a que del número inicial (n = 40), existieron elementos que no alcanzaron los 5 cm de altura para iniciar el experimento.

Evaluación de la eficiencia micorrícica

El crecimiento aéreo de las plantas (altura, diámetro del tallo y del follaje) se midió mensualmente a partir del inicio de la inoculación, durante nueve meses, con un vernier digital Neiko 01407A. La biomasa se obtuvo en peso fresco (g) para la parte aérea (hojas y tallo) y sistema radicular; la biomasa en peso seco se obtuvo a través de secado en mufla.

Las medidas de altura, el diámetro del sistema radicular y la biomasa de la parte aérea y el sistema radicular (peso fresco y seco) se determinaron a partir de un método de muestreo no reemplazable utilizando cinco plantas por tratamiento; el sistema radicular se lavó con agua abundante del grifo para eliminar el sustrato restante. La colonización micorrícica se determinó con la ecuación utilizada por ^{Garza-Ocañas et al. (2018}): colonización (%) = (número de raíces micorrizadas/ número raíces observadas) * 100.

Caracterización de la ectomicorriza

Los sistemas radiculares de tres plantas seleccionadas al azar, por especie de hongo, se caracterizaron morfológicamente a los nueve meses de la inoculación. Las características externas de las micorrizas frescas se observaron con ayuda de un microscopio estereoscópico y se describieron en términos de tipo de ramificación, morfología de las puntas de las raíces, presencia de rizomorfos, color y grosor del manto, y diámetro de las micorrizas (^{Agerer, 1991}).

La caracterización histológica de las micorrizas comenzó con una técnica de fijación de las muestras con 1:1:1 de formol, alcohol y ácido acético; posteriormente, se filtraron con ayuda de una bomba de vacío seguido de una inclusión en parafina. Después se realizaron cortes longitudinales y transversales de la micorriza de 2 µm en un microtomo de rotación. Por último, los cortes se desparafinaron y se tiñeron con azul de metileno de Loeffler (1 %) y verde brillante para observar y caracterizar la morfología del manto fúngico y red Hartig (^{Prophet et al., 1995}) con ayuda de un microscopio óptico en un aumento de 100x.

Contenido mineral de la planta

Se enviaron muestras del sistema aéreo y radicular de las plantas con cada tratamiento al Laboratorio de Análisis de Suelos, Plantas y Aguas de la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua, donde se realizó un análisis de composición mineral para conocer los porcentajes del nitrógeno total (N_t), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y sodio (Na), así como la cantidad en partes por millón (ppm) de cobre (Cu), hierro (Fe), manganeso (Mn) y zinc (Zn).

La técnica micro-Kjeldahl se utilizó para determinar la cantidad de N, y la mezcla digestora triazida y la técnica de vanadato colorimétrico para el porcentaje de P. La mezcla digestora se basa en la extracción del P con la metodología de ^{Tiessen y Moir (1993}), y la prueba colorimétrica de vanadato es la sugerida por ^{Murphy y Riley (1962}). La cuantificación de K, Ca, Mg, Na, Cu, Fe, Mn y Zn también se hizo con una mezcla de digestores triazidos y espectrofotometría de absorción atómica (GBC Avanta-Sigma) (^{Association of Official Analytical Chemists [AOAC], 1990}).

Análisis estadístico

Se realizaron pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk (n ≤ 30) y Kolmogórov-Smirnov (n > 30) para determinar si los datos se ajustaron a una distribución normal, también se utilizó una prueba de homogeneidad de varianzas de Levene (P ≥ 0.05).

Los efectos de las especies de hongos (factor A) y el volumen de inóculo de esporas utilizado (factor B) sobre las variables morfométricas (variables de respuesta: altura de la planta, diámetro del follaje y altura del tallo) se determinaron mediante un ANOVA completamente aleatorizado. Se utilizó una disposición factorial de 4 x 3, correspondiente al inóculo de esporas de las dos especies de hongos, el inóculo comercial de Ectorrize®, el control negativo y los tres volúmenes de inóculo. Asimismo, se realizó un ANOVA con un diseño aleatorio para evaluar el efecto de las especies de hongos sobre las variables morfométricas de altura y diámetro del sistema radicular y la biomasa de la parte aérea y el sistema radicular (peso fresco y seco). Los datos que mostraron heterogeneidad de las varianzas se analizaron con una comparación múltiple de medias T3 por Dunnett. El análisis estadístico se realizó en el programa estadístico SPSS versión 20 (^{IBM Corporation, 2011}) y se utilizó el programa GraphPad Prism versión 8.0 (^{GraphPad Software, Inc., 2018}).

Eficiencia y colonización

El Cuadro 2 indica que, al final del experimento, las plantas inoculadas tuvieron mayor supervivencia (93.5 a 100 %) que las no inoculadas (74.3 %).

Las Figuras 2, 3 y 4 muestran que la inoculación con P. tinctorius y A. hygrometricus tuvo efecto positivo (P ≤ 0.05) en todas las variables morfométricas de P. arizonica. La altura promedio de las plantas (Figura 2), así como el diámetro y longitud del follaje (Figura 4), fue mayor en los tratamientos inoculados en comparación con el control no inoculado, independientemente del volumen de inóculo que no tuvo efecto estadísticamente significativo (P > 0.05). Lo anterior indica que los HEM puede establecer simbiosis con las plantas de P. arizonica a bajos volúmenes de inoculación, generando efectividad.

Figura 2 Altura de las plantas de Pinus arizonica bajo efecto de los tratamientos de inoculación con Pisolithus tinctorius (PT), Ectorrize® (ECT), Astraeus hygrometricus (AH) y un tratamiento control sin inoculación (C). Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la comparación múltiple de medias de Dunnett (P ≤ 0.05). Las barras de variación representan la desviación estándar de la media (n = 5). 

El análisis estadístico determinó que el volumen de inoculante no tuvo efecto significativo (P > 0.05) sobre el crecimiento de la altura de las plantas (Figura 2), el diámetro del tallo (Figura 3) y la longitud y diámetro del follaje (Figura 4); sin embargo, la interacción o combinación de los HEM y el volumen inoculado sí mostró efecto sobre las variables (Cuadro 3). En el caso de la altura, longitud del follaje y diámetro del follaje de la planta se observa que P. tinctorius genera el mayor crecimiento a dosis de 10 y 50 mL, siendo similar con Ectorrize® a 10 mL; para el diámetro del tallo, la mejor respuesta se generó con P. tinctorius a dosis de 10 mL.

En cuanto al diámetro del tallo (Figura 3), las plantas inoculadas con esporas de P. tinctorius y Ectorrize® mostraron mayor crecimiento, seguidas de A. hygrometricus, en comparación con el control (3.36 cm).

Figura 3 Diámetro del tallo de Pinus arizonica bajo tratamientos de inoculación con Pisolithus tinctorius (PT), Ectorrize® (ECT), Astraeus hygrometricus (AH) y un tratamiento control sin inoculación (C). Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la comparación múltiple de medias de Dunnett (P ≤ 0.05). Las barras de variación representan la desviación estándar de la media (n = 5). 

La longitud y diámetro del sistema aéreo en los tratamientos inoculados fueron mayores que en el control no inoculado (Figura 4A). Con respecto al sistema de las raíces, los tratamientos inoculantes tuvieron efecto estadísticamente similar sobre la longitud (P > 0.05) en comparación con el control (Figura 4B); esta varió entre 14.04 y 15.26 cm. Por el contrario, los resultados para el diámetro del sistema radicular (Figura 4B) indicaron diferencias entre los tratamientos (P < 0.05), siendo menor el control (3.72 cm); los valores más altos se obtuvieron con los tratamientos Ectorrize® y A. hygrometricus, con 4.60 y 4.62 cm, respectivamente.

Figura 4 A) Longitud y diámetro promedio del sistema aéreo (A) y radicular (B) de Pinus arizonica bajo tratamientos de inoculación con Pisolithus tinctorius (PT), Ectorrize® (ECT), Astraeus hygrometricus (AH) y un tratamiento control sin inoculación (C). Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la comparación múltiple de medias de Dunnett (P ≤ 0.05). Las barras de variación representan la desviación estándar de la media (n = 5). 

Se ha informado que, en las primeras etapas del desarrollo de las plantas, la presencia de inóculos reduce la incidencia de patógenos de raíz (^{Sharma et al., 2014}) porque se produce competencia natural por el espacio entre estos y los HEM (^{Jung et al., 2012}). En este estudio no se detectaron enfermedades causadas por especies fúngicas patógenas en las plantas inoculadas de P. arizonica ni en el control.

En cuanto a la producción de biomasa, tanto de la parte aérea como del sistema radicular (Figura 5), se observaron efectos positivos en plantas de P. arizonica en comparación con el control. El tratamiento con esporas de P. tinctorius estimuló un mayor crecimiento aéreo de las plantas (8.08 g) que difirió significativamente (P < 0.05) con el tratamiento control no inoculado (2.40 g). La mayor biomasa en peso fresco para el sistema radicular fue inducida por tratamientos de esporas de P. tinctorius y Ectorrize® con valores de 7.92 y 7.80 g, respectivamente, y estos difirieron significativamente con los obtenidos en el control. Los tratamientos de esporas de P. tinctorius y el producto comercial Ectorrize® generaron también mayor biomasa en peso seco en el sistema radicular con 3.12 y 3.22 g, respectivamente.

Figura 5 Producción de biomasa del sistema aéreo (A) y sistema radicular (B) de Pinus arizonica bajo tratamientos de inoculación con Pisolithus tinctorius (PT), Ectorrize® (ECT), Astraeus hygrometricus (AH) y un tratamiento control sin inoculación (C). Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos de acuerdo con la comparación múltiple de medias de Dunnett (P ≤ 0.05). Las barras de variación representan la desviación estándar de la media (n = 5). 

Colonización ectomicorrícica de raíces de Pinus arizonica

El Cuadro 4 indica que las esporas de P. tinctorius produjeron el mayor porcentaje de colonización ectomicorrícica en las plantas de P. arizonica, seguidas por las de A. hygrometricus y Ectorrize®. El grado de formación de micorrizas se clasificó de acuerdo con ^{Tateishi et al. (2003}); en función del número de raíces micorrícicas, las plantas inoculadas tuvieron un nivel medio a alto (nivel IV).

Caracterización morfológica de ectomicorrizas

Las características micorrícicas, como el color del manto y el tipo de ramificación, ayudaron a distinguir las dos especies de hongos, y las secciones transversales de los cortes histológicos fueron útiles para identificar la red de Hartig y el grosor del manto. Las micorrizas dicotómicas fueron las más abundantes.

La Figura 6 muestra las ectomicorrizas de P. tinctorius de color marrón claro, con oscurecimiento en la base de tipo principalmente dicotómicas. Se observaron algunas formaciones coraloides, pero no fueron frecuentes, también se identificaron rizomorfos. La longitud del sistema micorrícico varió de 1.3 a 2.5 mm y el diámetro de 0.4 a 0.7 mm. Las puntas de las raíces midieron 0.7 mm de longitud y 0.3 mm de diámetro. La textura del manto fúngico varió de granular a liso, y la coloración fue marrón claro a hialino. Las secciones longitudinales de las micorrizas mostraron que el manto es de tipo plectenquimático H (^{Agerer, 1991}); estas se caracterizan por hifas de forma irregular de 15 a 20 μm de diámetro. No se observaron conexiones de abrazadera. La red Hartig estuvo compuesta por células ovoides de 2 a 3 μm de diámetro.

Figura 6 Ectomicorrizas de Pisolithus tinctorius en plantas de Pinus arizonica: A) formación inicial, B) morfotipo dicotómico, C) morfotipo coraloide, D) corte longitudinal de ectomicorriza indicando el manto (m) y la red de Hartig (rH), E) manto de 20 μm de espesor. 

La variabilidad morfológica de las ectomicorrizas producidas por el tratamiento con Ectorrize® se observa en la Figura 7. El sistema micorrícico es denso con ramificaciones principales de tipo dicotómica y puntas rectas en las etapas iniciales, aunque ligeramente sinuosas en estado maduro. No se observó la presencia de rizomorfos. El color de las micorrizas varió del marrón oscuro al dorado y las puntas tenían un color más claro que el resto. El sistema micorrícico registró, en promedio, 3.1 a 5.4 mm de longitud y 1.5 mm de diámetro, y las puntas tuvieron 0.9 a 2.3 mm de longitud y 0.2 a 0.5 mm de diámetro. La textura del manto varió de liso a granular con una coloración marrón claro a hialina. Las secciones transversales mostraron un manto plectenquimático tipo N (^{Agerer, 1991}), caracterizado por hifas irregulares. El manto midió de 10 a 15 μm de grosor y la red Hartig tuvo células de forma semicircular.

La morfología y el color de las micorrizas formadas por el tratamiento Ectorrize® fueron similares a P. tinctorius, pero solo en las etapas iniciales; mientras que la longitud del sistema micorrícico si fue mayor con el control positivo. Las variaciones en ambos tratamientos pueden deberse a la adición de diversas cepas bacterianas utilizadas en el producto Ectorrize®.

Figura 7 Ectomicorrizas en plantas de Pinus arizonica con el tratamiento de inoculación Ectorrize®. A) Etapa inicial, B) morfotipo dicotómico, C) ectomicorrizas maduras, D) sección transversal de ectomicorriza indicado en el manto (m), E) manto plectenquimático (m) de 15 μm de espesor tipo N (^{Agerer, 1991}) y red de Hartig (rH), aumento de 100x. 

La Figura 8 muestra la morfología de las micorrizas de A. hygrometricus. Es importante mencionar que el estudio presenta por vez primera la descripción morfológica de la asociación micorrícica de A. hygrometricus con Pinus arizonica. Las formas fueron de tipo dicotómicas y coraloides, siendo estas últimas las dominantes en las etapas maduras. Se observó la presencia de rizomorfos densos, pero restringidos a un punto. Las micorrizas presentaron coloraciones blancas y algunas tenían puntas de raíces ligeramente hialinas; las micorrizas más viejas tenían un color grisáceo. El sistema micorrícico de tipo dicotómico midió 2.1 mm de largo por 1.4 mm de diámetro y las puntas tuvieron una longitud promedio de 1.1 mm por 0.4 mm de diámetro. El morfotipo coraloide varió de 2 a 2.5 mm de largo por 2 mm de diámetro y las puntas midieron 1.3 µm de largo por 0.5 µm de diámetro. La textura del manto fue granulosa a lisa en las puntas. El corte histológico transversal mostró que la morfología del manto es plectenquimático de tipo B que se caracteriza por hifas irregulares sobre la superficie del manto, dispuestas principalmente de forma longitudinal (^{Agerer, 1991}). El grosor del manto fue de 70 µm. La red de Hartig presentó células con forma semicircular y alargadas de 3 a 5 µm de longitud.

Figura 8 Ectomicorrizas de Astraeus hygrometricus en plantas de Pinus arizonica: A) etapa inicial, B) micorrizas dicotómicas, C) ectomicorrizas maduras con ramificación coraloide, D) rizomorfos (R) y ectomicorrizas coraloides, E) sección transversal de ectomicorrizas mostrando el manto (m) y la red de Hartig (rH). 

Análisis mineral en plantas de Pinus arizonica

En general, se observó contenido alto de macronutrientes tanto en las partes aéreas como radiculares de las plantas de Pinus arizonica inoculadas con el producto comercial Ectorrize® y con los hongos A. hygrometricus y P. tinctorius (Cuadro 5). Para el control negativo, los análisis del sistema radicular no pudieron realizarse, ya que la cantidad de biomasa fue insuficiente.

Los resultados apoyan lo señalado por ^{Ortega (2015}), ^{Smits y Wallander (2017}) y ^{Chen et al. (2018}), quienes mencionan que las micorrizas absorben azúcares de las raíces de las plantas e introducen nutrientes como P, N, K, Ca, S y Zn, entre otros, en sus sistemas vasculares.