Ideas destacadas

Introducción

El injerto es uno de los métodos de propagación asexual más utilizados en especies de pino (^{Aparicio-Rentería, Viveros-Viveros, & Rebolledo-Camacho 2013}; ^{Muñoz-Flores, Prieto-Ruiz, Flores-García, Pineda-Ojeda, & Morales-González, 2013}; ^{Pérez-Luna et al., 2019}). Este método acelera el ciclo reproductivo con el fin de obtener mayor producción de planta con mejor calidad genética en menor tiempo; la planta es utilizada para las actividades de reforestación y conservación, establecimiento de huertos semilleros clonales o desarrollo de plantaciones comerciales (Aparicio-Rentería et al., 2013; ^{Guadaño & Mutke, 2016}; Muñoz-Flores et al., 2013; Pérez-Luna et al., 2019, 2020a). No obstante, la mayoría de los ensayos se han realizado con tutores de la misma especie y los estudios reportados entre especies diferentes son escasos (^{Climent, Prada, Gil, & Pardos, 1997}; ^{Darikova, Vaganov, Kuznetsova, & Grachev, 2013}; ^{Villaseñor & Carrera, 1980}; Pérez-Luna et al., 2020b).

Algunas de las ventajas más destacadas del injerto interespecífico son: la capacidad de adaptación en ambientes diferentes al de la especie original y la producción de mayor cantidad de estructuras reproductivas con incremento en la disponibilidad de semillas (^{Climent et al., 1997}). Estas ventajas se han observado en especies de distribución amplia y de importancia económica; en contraste, los ensayos en pinos de distribución restringida y en peligro de extinción son nulos. La aplicación de injertos en este tipo de especies puede ser una herramienta de gran valor para su conservación, ya que mitiga la degradación de sus áreas naturales a través de la propagación para ayudar a su repoblación y reduce la pérdida de variantes genéticas que son de gran importancia adaptativa y evolutiva para el género.

Pinus rzedowskii Madrigal & Caball. Del. es endémica de México y está en peligro de extinción (^{Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales [SEMARNAT], 2010}). La especie se distribuye en la Sierra de Coalcomán, Michoacán, con poblaciones fragmentadas (15) y representadas por pocos individuos (9 a 3 500 por población; ^{Castilleja, Delgado, Sáenz-Romero, & Herrerías, 2016}; ^{Delgado, Piñero, Chaos, Pérez‐Nasser, & Alvarez‐Buylla, 1999}). Su hábitat es característico de suelos calizos (Cambisol) pobres en nutrientes, con poblaciones conformadas en su mayoría por individuos adultos senescentes, lo cual reduce su capacidad de regeneración (^{Delgado et al., 1999}). No obstante, la variación genética es relativamente alta (>0.275), aunque con niveles importantes de endogamia (F = 0.270; ^{Delgado et al., 1999}). Esta condición afecta el éxito reproductivo con una producción escasa de semillas viables (17 % con embrión) y germinación baja (3 %; Castilleja et al., 2016).

Una de las alternativas para el incremento de la reproducción de P. rzedowskii es la implementación de injertos, que desafortunadamente son difíciles de realizar entre individuos de la misma especie, debido a la disponibilidad escasa de semillas viables (^{Castilleja et al., 2016}). Por lo anterior, es necesario explorar la posibilidad del uso de otras especies-patrón de pino, bajo el supuesto de que la selección de especies filogenéticamente cercanas, donde las características anatómicas probablemente han evolucionado de manera similar, permitirá mejor acoplamiento de los tejidos y, en consecuencia, mayor éxito de los injertos. Este supuesto filogenético no se ha documentado en pinos, pero se han explorado otros factores, aunque también de manera escasa, como son: el estado fenológico y viabilidad de la vareta y el patrón, la época del injertado, la habilidad del injertador, el control de las condiciones ambientales y la compatibilidad taxonómica y anatómica de las especies (^{Climent et al., 1997}; ^{Hartmann, Kester, Davies, & Geneve, 2002}; ^{Pérez-Luna et al., 2019}, 2020a, 2020 b).

Las reconstrucciones filogenéticas con datos moleculares de regiones de ADN de cloroplasto y núcleo (^{Gernandt, Geada, Ortiz, & Liston, 2005}; ^{Montes et al., 2019}) ubican a P. rzedowskii dentro de la sección Parrya, subsección Cembroides, cuyas relaciones filogenéticas con P. pinceana Gordon & Glend. y P. maximartinezii Rzed. forman un clado monofilético. Por ello, el uso de plantas-patrón con estas especies de pino sustentan la posibilidad de obtener injertos compatibles con P. rzedowskii.

En el presente estudio se hicieron injertos interespecíficos de P. rzedowskii con plantas-patrón de P. pinceana, P. maximartinezii, P. ayacahuite var. veitchii (Roezl) Shaw y P. pseudostrobus Lindl. con el objetivo de evaluar la supervivencia. La hipótesis plantea que las especies filogenéticamente más cercanas a P. rzedowskii presentan mayor supervivencia que las especies con relación filogenética más distante.

Materiales y métodos

Material biológico e injertación

Las plantas-patrón se obtuvieron por germinación de semillas de cinco especies: P. rzedowskii; P. maximartinezii, P. pinceana y P. ayacahuite var. veitchii, tres especies filogenéticamente cercanas del subgénero Strobus; así como P. pseudostrobus del subgénero Pinus (Cuadro 1).

Cuadro 1 Procedencias de las semillas utilizadas para la obtención de las plantas-patrón de las especies de Pinus en estudio. 

Especie	Procedencia	Latitud (N)	Longitud (O)	Altitud (m)
P. pinceana	Guadalcázar, San Luis Potosí	22° 40’ 10’’	100° 29’ 30’’	1 600
P. maximartinezii	Pueblo Viejo, Jalisco	21° 21’ 15’’	103° 21’ 22’’	2 380
P. ayacahuite var. veitchii	La Palma, Michoacán	19° 36’ 39’’	102° 20’ 24’’	2 150
P. pseudostrobus	San Juan Nuevo Parangaricutiro, Michoacán	19° 27’ 06’’	102° 12’ 57’’	2 685
P. rzedowskii	El Varaloso, Michoacán	18° 40’ 59’’	102° 59’ 34’’	2 800

Las semillas se trataron con hipoclorito de sodio al 0.2 % por 5 min; posteriormente, se enjuagaron con agua corriente y se embebieron en una solución de agua destilada con peróxido de hidrógeno al 2 % por 24 h, seleccionando las semillas con embrión por la técnica de flotación (^{Castilleja et al., 2016}). Finalmente, las semillas se trataron con 3 g∙L^-1 de fungicida Captán® por 5 min y se plantaron en charola de plástico transparente (30 x 30 x 5 cm) con sustrato vermiculita al 100 %. Posterior a los 40 días, las plántulas se cambiaron a un sustrato compuesto de 50 % de turba de musgo, 25 % de agrolita, 25 % de vermiculita y 5.0 g∙planta^-1 de fertilizante de liberación controlada (Multicote®), en envases de plástico negro de 5 L de capacidad (30 x 20 cm); los riegos se aplicaron cada tercer día. Las plantas-patrón se seleccionaron de tres años acorde con las características recomendadas; edad entre 2 a 4 años, lo más rectas posibles y con diámetro entre 1.5 a 2.5 cm (^{Muñoz-Flores et al., 2013}). Debido a los problemas reproductivos que P. rzedowskii presenta (Castilleja et al., 2016), solo se obtuvieron siete plantas, por ello, el número de plantas para el resto de las especies se aproximó a 10 con la intención de evitar sesgo en los resultados, a causa de las diferencias en el tamaño de muestra.

Las varetas de P. rzedowskii se obtuvieron en la localidad de Chiqueritos, Dos Aguas, municipio de Aguililla, Michoacán (18° 04’ 17’’ N y 102° 59’ 36’’ O). Se recolectaron 70 varetas con yemas terminales de tamaños similares (5 a 8 cm de longitud), provenientes de un árbol adulto reproductivo (140 años; diámetro de 30 cm y altura de 25 m). La recolecta se hizo de la parte media baja del árbol que contenía la mayor cantidad de yemas. El trabajo de recolecta e injerto se realizó en un periodo de 24 h (18 y 19 de febrero de 2017), con la finalidad de que los tejidos continuaran vivos y se lograra un injerto exitoso (^{Aparicio-Rentería et al., 2013}; ^{Muñoz-Flores et al., 2013}).

Los injertos se hicieron en un vivero rústico o jardín común con dimensiones de 4 x 8 x 3 m y malla al 50 % de sombra en la Facultad de Agrobiología “Presidente Juárez” de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Las etapas del injertado se muestran en la Figura 1. El método de injerto fue el enchapado lateral, recomendado para especies de pinos (^{Muñoz-Flores et al., 2013}; ^{Pérez-Luna et al., 2019}; ^{Villaseñor & Carrera 1980}). Durante el experimento, las condiciones de temperatura fueron constantes entre 23 a 24 °C y la humedad relativa varió de 60 a 80 %. Los injertos se mantuvieron cubiertos con bolsa de papel estraza para disminuir la incidencia de luz y bolsa plástica con agua para mantenerlos hidratados (Muñoz-Flores et al., 2013); la bolsa de papel se retiró a los 30 días, momento en que se apreció el prendimiento de los injertos por el crecimiento de las yemas y la bolsa plástica se retiró a los 60 días. Para evitar problemas por hongos se aplicó fungicida Ridomil Gold® (3 g∙L^-1) en el follaje y en el área del injerto una vez por semana.

El 20 de mayo del 2017 se realizó la primera poda en el total del follaje y ramas debajo de la zona del injerto. El 3 de junio del 2017 se realizó la segunda poda del follaje y ramas en la zona continua a la parte superior del injerto, sin podar el extremo terminal del patrón. Esta poda se hizo con la finalidad de que la savia no alimentara su yema principal, dándole prioridad al injerto (^{Goldschmidt, 2014}; ^{Muñoz-Flores et al., 2013}). El 17 de junio del 2017 se observó crecimiento avanzado de las yemas de los injertos y se optó por la poda total de las plantas-patrón y de su liberación.

Figura 1 Secuencia de las etapas de injertado. a) vareta de Pinus rzedowskii, b) corte en el tallo de la planta-patrón, c) acoplamiento de tamaños, d) injertado de enchapado lateral, e) amarrado con cinta plástica para injerto (marca MD), f) bolsa plástica con agua para evitar deshidratación, g) cubierta de papel estraza para disminuir la incidencia de luz, h) injerto con plantas-patrón de P. ayacahuite var. veitchii, con estróbilos masculinos en desarrollo, i) segunda poda de P. pinceana en la parte central-superior del injerto con el extremo terminal sin podar y estróbilos masculinos, j) injerto de P. rzedowskii con estróbilos masculinos de mayor tamaño en la etapa de liberación del polen, k) tercera poda y liberación del injerto, e l) injerto con acículas y ramillas nuevas de P. rzedowskii. 

Resultados y discusión

El valor más alto de supervivencia final se obtuvo con injertos de plantas-patrón de la misma especie: P. rzedowskii con seis de siete injertos (85.7 ± 0.21 %), seguido de P. pinceana con ocho de 10 (80 ± 0.316 %), ambas con los mayores valores medios de la función esperada de supervivencia (m = 0.97 y m = 0.95) y de los valores medios de supervivencia estimados en número de días (md = 163.4 y md = 162.2) ((Cuadro 2; Figura 2).

Un estudio genómico reciente de la subsección Cembroides indica que P. pinceana es una de las dos especies más cercanas filogenéticamente a P. rzedowskii (^{Montes et al., 2019}); sus características anatómicas y modificaciones a través del tiempo han sido similares probablemente, permitiendo mejor acoplamiento y funcionalidad de los tejidos del cámbium (^{Castro-Garibay, Villegas-Monter, & López-Upton, 2017}; ^{Pérez-Luna et al., 2020a}). Se ha documentado que las características del xilema y la forma de los haces vasculares también deben ser similares para que el contacto sea lo más homogéneo posible (Castro-Garibay et al., 2017; Daricova et al., 2013; Pérez-Luna et al., 2019). En este sentido, y de acuerdo con los resultados obtenidos, se recomienda a P. pinceana como planta-patrón para el injerto exitoso con P. rzedowskii.

No obstante que P. pinceana está catalogada en el estatus de protección especial (^{NOM-59-SEMARNAT-2010}), a diferencia de P. rzedowskii, aún no presenta problemas reproductivos extremos con 54 a 55 % de eficiencia de semillas (^{Quiroz-Vázquez, López-Upton, Cetina-Alcalá, & Ángeles-Pérez, 2017}) y algunas de las poblaciones muestran regeneración adecuada, representada por 22 a 59 % de plantas jóvenes (1 a 25 años) con una tasa de reclutamiento superior a un individuo por árbol (^{Martínez-Ávalos et al., 2015}; ^{Molina-Freaner, Delgado, Pérez, Piñero, & Alvarez-Buylla, 2001}). Con base en lo anterior, P. pinceana puede ser una fuente de semillas segura para la producción de plantas-patrón para el injerto con P. rzedowskii, sin afectar el equilibrio demográfico y genético de la especie.

P. maximartinezii, la segunda especie cercanamente emparentada con P. rzedowskii, tuvo una supervivencia final baja con tres de 10 injertos (30 ± 0.91 %) y menor que la esperada de acuerdo con la función de supervivencia (m = 0.758; md = 130.9). Este resultado posiblemente se debió a que las plantas-patrón tenían mayor tamaño (diámetro y altura del tallo) en comparación con las otras especies utilizadas, aunque eran de la misma edad, de acuerdo con lo recomendado (^{Aparicio-Rentería et al., 2013}). Probablemente, debido a las diferencias de crecimiento natural con estructuras anatómicas de tamaño distinto (v. g., haces vasculares de mayor diámetro), no se logró un acoplamiento adecuado de los tejidos. Para corroborar esta aseveración es necesario probar injertos con plantas-patrón menores de tres años y ver si es posible el ajuste de los tejidos que incrementen la tasa de supervivencia. Cabe mencionar que P. maximartinezii está considerada como microendémica y en estatus de protección especial (^{NOM-59-SEMARNAT-2010}). Aunque no presenta problemas de estabilidad demográfica (^{López-Mata, 2013}), su semilla se usa para la producción y comercialización de planta ornamental sin regulación. Debido a lo anterior, la regeneración natural de P. maximartinezii podría verse afectada si las plantas producidas en los viveros no se reintroducen en sus poblaciones, por tanto, el desarrollo de un programa de repoblación para su protección podría ser requerido.

Figura 2 Distribución de la función de supervivencia de Kaplan-Meier para injertos de Pinus rzedowskii con el uso de cinco especies-patrón. Los colores en tonos claros indican los intervalos de confianza (95 %) para cada especie. 

Una de las especies promisorias para el éxito de los injertos es P. ayacahuite var. veitchii, que también forma parte del subgénero Strobus con un haz vascular como P. rzedowskii; aunque está agrupada en otra sección (Quinquefoliae) y subsección (Strobus) (^{Gernandt et al., 2005}) se ha observado que los árboles de ambas especies tienen características fisionómicas muy similares cuando son jóvenes (2 a 15 años), por lo que es muy probable obtener buen acoplamiento de los tejidos. Al ser la segunda especie con el mayor porcentaje de supervivencia final (50 ± 0.628) y con un tiempo medio de supervivencia esperada aceptable (m = 0.85, md = 154.7), se propone como una especie-patrón apta para su injerto con P. rzedowskii. Además, la obtención de semillas de P. ayacahuite, para la producción de planta, no afecta el equilibrio demográfico de sus poblaciones naturales, ya que no presenta problemas reproductivos con 54.9 % de eficiencia de semillas y 71.5 % de germinación (^{Castilleja et al., 2016}).

La especie menos indicada fue P. pseudostrobus con supervivencia final (20 ± 0.89 %) y tiempo medio de supervivencia esperada (m = 0.66; md = 121.5) más bajos. Uno de los principales factores que probablemente influyó en este resultado fue su relación filogenética distante con P. rzedowskii, debido a que forma parte de otro subgénero (Pinus) con características morfológicas y anatómicas diferentes que posiblemente impidieron la unión completa de los tejidos (^{Darikova et al., 2013}; ^{Goldschmidt, 2014}).

La heterogeneidad observada entre las especies fue altamente significativa con la prueba de Log-Rank (X² = 25.24, P < 0.0001), la cual se debe a diferencias entre P. rzedowskii con P. pseudostrobus (X² = 13.480, P < 0.0001) y P. maximartienzii (X² = 8.390, P < 0.004), y estas dos últimas especies con relación a P. pinceana (P. pseudostrobus, X² = 15.357, P < 0.0001; P. maximartinezii, X² = 9.105, P < 0.003) ambas con la menor supervivencia (Figura 2). También se presentaron diferencias entre P. ayacahuite var. veitchii y P. pseudostrobus (X² = 5.344) con un soporte estadístico menor pero significativo (P < 0.021). Los resultados sugieren nuevamente que las relaciones filogenéticas son un factor importante para el éxito de los injertos, mostrando que la especie más distante (P. pseudostrobus) fue la menos exitosa y que generó la mayor diferenciación.

A la fecha, los estudios sobre injertos heteroespecíficos son escasos y no se ha logrado determinar algún patrón claro de su comportamiento. No obstante, algunos de ellos muestran tendencias similares a los resultados obtenidos en este estudio; el ensayo de P. patula Schiede ex Schltdl. et Cham. en P. radiata D. Don. con 96.7 % de supervivencia (^{Dyson, 1975}), ambas pertenecientes a la subsección Australes (^{Gernandt et al., 2005}); P. patula (subsección Australes) en P. pseudostrobus y P. douglasiana Mtz. (ambas en la subsección Ponderosa) con 80 % y 69 % de supervivencia, respectivamente (^{Villaseñor & Carrera 1980}), las cuales pertenecen a la sección Trifoliae (Gernandt et al., 2005), lo que probablemente posibilitó su supervivencia. Otro estudio es el de P. brutia Ten. en P. nigra Arnold. con 56 % de supervivencia (^{Climent et al., 1997}), ambas de la subsección Pinus (^{Eckert & Hall, 2006}).

Un estudio reciente sobre injertos de P. engelmannii Carr. con la misma especie y con un híbrido de P. engelmanni x P. arizonica Engelm. var. arizonica indicó mayor supervivencia con el híbrido (83 %) que con la especie pura (25 %) (^{Pérez-Luna et al., 2020b}). Los autores concluyen que el bajo prendimiento se debió a la alta densidad de canales resiníferos en las varetas de P. engelmannii (Pérez-Luna et al., 2019); mientras que, para el caso del éxito de los injertos con el híbrido, los autores indican que la presencia de pocos estomas en las acículas de P. arizonica hace que los injertos sean más resistentes al estrés ambiental con un incremento en la supervivencia. Estas diferencias existen a pesar de que ambos taxones están relacionados cercanamente (subsección Ponderosae; ^{Eckert & Hall, 2006}), lo que también puede considerarse como otro factor importante para los resultados obtenidos con los injertos de las plantas híbridas.

En un estudio sobre la anatomía de plantas-patrón y varetas para injertos de cuatro especies de pino (P. patula, P. greggii Engelm. ex Parl., P. teocote Schiede ex Schltdl. et Cham. y P. leiophylla Schiede ex Schltdl. et Cham.), ^{Castro-Garibay et al. (2017}) demostraron que un cámbium circular y continuo es el más adecuado para una conexión completa de los tejidos del injerto; dichos autores observaron estas características en P. teocote y P. leiophylla, consideradas como especies-patrón candidatas para el injerto del resto de las especies que evaluaron. En el mismo trabajo, los resultados anatómicos sugirieron la influencia de la cercanía filogenética, donde las especies más promisorias (P. teocote y P. leiophylla) fueron incluidas en un estudio filogenético de Pinus (^{Gernandt et al., 2005}), dentro de la subsección Australes y todas (las cuatro especies) dentro de la sección Trifoliate.

En general, en los estudios mencionados se observa que la proximidad filogenética es un factor común para el éxito de los injertos. Por tanto, la heterogeneidad de los resultados obtenidos en este trabajo está asociada claramente a las diferencias filogenéticas y evolutivas de las especies. Actualmente, no existe información sobre la anatomía de los tallos de las especies estudiadas; sin embargo, algunos trabajos taxonómicos reportan diferencias anatómicas en acículas (^{Farjon & Styles, 1997}; ^{Madrigal & Caballero, 1969}; Martínez, 1948). Por lo anterior, se requiere de trabajos futuros sobre los tejidos vasculares de las plantas-patrón y varetas que de manera sistemática y rigurosa corroboren la compatibilidad de los tejidos vasculares de las especies.

Conclusiones

La estrategia de propagación por injerto enchapado lateral es viable para P. rzedowskii, ya que se logra supervivencia mayor de 80 %. De igual manera se demuestra que el injerto interespecífico es posible y que el factor especie afecta la supervivencia a través del tiempo, la cual está asociada a la cercanía filogenética de las especies. La mayor supervivencia se obtuvo con plantas-patrón de P. pinceana, que forma un grupo monofilético con P. rzedowskii. Esta información es una iniciativa con una sólida base científica y biotecnológica para la propagación de la especie a mayor escala, de gran utilidad para su conservación ex situ y para ensayos futuros de mejoramiento genético.