Selección del germoplasma

Se utilizó germoplasma de P. radiata de dos poblaciones nativas en isla Cedros e isla Guadalupe, ambas del estado de Baja California, México. De cada población se incluyeron dos subpoblaciones separadas espacialmente por latitud y altitud (Cuadro 1).

La semilla se sembró en contenedores de 200 mL, en un sustrato de corteza, perlita y tepezil (50:30:10) y 5 g·L^-1 de fertilizante de liberación controlada (Multicote^®) con riego a capacidad de campo. A los seis meses se seleccionaron plantas de tamaño homogéneo de cada una de las subpoblaciones para el experimento: 29.8 ± 2.3 cm de altura en plantas de la población Guadalupe, y 22.4 ± 2.1 cm de altura en Cedros.

Establecimiento del experimento

El experimento se estableció en el vivero del Postgrado en Ciencias Forestales del Colegio de Postgraduados, campus Montecillo, en dos ambientes de crecimiento: contenedores individuales (invernadero) y camas de crecimiento (intemperie). Durante el periodo diciembre 2018 a marzo del 2019, la temperatura promedio fue 4.7 °C mayor y con menor fluctuación diurna en el invernadero (14.8 °C con mínima promedio de 6.3 °C y máxima promedio de 24.4 °C) con respecto a la intemperie (10.1 °C con mínima promedio de 0.4 °C y máxima promedio de 22.8 °C). La humedad relativa promedio en el invernadero fue de 63.3 % con variación diurna promedio de 28.8 a 98.3 %, y a la intemperie fue de 57.3 % con variación promedio de 24.6 a 93.1 %. En el invernadero, el 26 octubre de 2018, 96 plantas de cada subpoblación se trasplantaron a tubos de PVC de 10 cm de diámetro y 100 cm de longitud que contenían un sustrato de suelo agrícola local, arena y tepezil en proporción 50:30:20. En intemperie, el 22 noviembre de 2018, 80 plantas de cada subpoblación se trasplantaron a 20 cm x 15 cm entre hileras y plantas en camas de crecimiento con suelo agrícola local. En cada ambiente se definieron dos tratamientos de humedad (S₀ y S₁) con base en la curva de retención de los sustratos. En el nivel S₀, el contenido de humedad se mantuvo entre 76 y 100 % de su humedad aprovechable (40 a 47 % de humedad en contenedores y 26 a 30 % de humedad en camas de crecimiento), mientras que en el nivel S₁, el contenido de humedad en los contenedores se mantuvo entre 10 y 25 % de la humedad aprovechable, y sin riego en las camas de crecimiento, evitando el ingreso de agua durante la temporada de lluvias. En cada ambiente se utilizó un diseño en parcelas divididas con arreglo factorial 2 x 4. En las parcelas grandes se establecieron los tratamientos de humedad (S₀ y S₁), y en las pequeñas, las subpoblaciones con cuatro repeticiones. Cada unidad experimental estuvo representada por 12 plantas en invernadero y 10 plantas en las camas de crecimiento.

Evaluación del daño por temperatura

Con base en pruebas preliminares (enero 2019) para determinar el tipo de hoja y su posición en el tallo, se decidió utilizar tres hojas primarias cercanas al ápice por planta, en una muestra de seis plantas elegidas al azar por unidad experimental. En todas las pruebas se utilizaron las mismas plantas. Las acículas se lavaron con agua destilada y se cortaron en secciones de 10 mm, descartando la punta y la base. Cada muestra se separó en dos partes con un peso fresco similar, medido en una balanza analítica (Chyo Balance Corp, precisión 0.1 mg), y se colocaron en tubos de ensayo; una parte se sometió a congelamiento (F_t) y otra parte se utilizó como referencia o control (F_c).

La primera prueba de exposición al frío se hizo durante el invierno (6 de febrero del 2019) y la segunda se realizó en primavera (24 de abril del 2019). En cada ocasión, los tubos con la fracción F_t se colocaron en gradillas dentro de una cámara de congelamiento (modelo M1212, Manufacturas Ind. Universo, México), con control automático de temperatura, y los tubos con la fracción F_c se mantuvieron a temperatura ambiente (22 a 23 °C). Las fracciones F_t se sometieron a una rutina de descenso gradual de temperatura en la cámara, iniciando con una estabilización a 4 °C durante una hora y después un descenso de 2 °C por hora, durante 8 h, hasta alcanzar -12 °C. Las muestras se mantuvieron a esta temperatura por 4 h y, posteriormente, se dejaron reposar hasta alcanzar nuevamente 4 °C, para iniciar la evaluación.

El daño ocasionado en las hojas se determinó con la conductividad eléctrica que mide la concentración de electrolitos liberados por los tejidos vegetales después de exponerse a temperaturas de congelamiento (^{Climent, Costa e Silva, Chambel, Pardos, & Almeida, 2009}). Después de someter la fracción F_t al congelamiento, se agregaron 10 mL de agua desionizada a las dos fracciones (F_t y F_c) y se dejaron reposar durante 24 h a temperatura ambiente. La conductividad eléctrica (C₁) se midió con un conductímetro LAQUAtwin modelo EC-33. Después, las muestras se esterilizaron en autoclave a 120 °C durante 15 min, para matar el tejido y medir la conductividad eléctrica total (C₂) 12 h después. A cada muestra se realizaron tres lecturas de conductividad cada 20 min y se utilizó el promedio de estas en los cálculos del daño ocasionado. Con los datos de conductividad eléctrica estandarizados a una masa de 100 mg de tejido, se calculó la conductividad relativa (R = 100*C₁/C₂) de cada fracción (R_t y R_c). El índice de daño celular (ID) para cada muestra se calculó como ID = 100 * (R_t - R_c)/(100 - R_c).

Evaluación del crecimiento del brote terminal

La tasa absoluta de crecimiento (TAC, mm·d^-1) del brote terminal se obtuvo a través de la medición de altura total de las plantas cada dos semanas, a partir del 26 de octubre en el invernadero y del 22 de noviembre en las camas de crecimiento (intemperie), hasta el 8 de mayo en ambas condiciones. La TAC para cada planta (^{Arias et al., 2019}) se calculó con la fórmula TAC = (A₂ - A₁)/(T₂ - T₁), donde A₁ y A₂ son la altura inicial y final de la planta (mm), respectivamente, al tiempo inicial (T₁) y final (T₂) de cada periodo de medición.

Análisis estadístico

Los datos se sometieron a un análisis de varianza con el procedimiento MIXED en SAS 9.0 (^{SAS Institute, 2003}), para evaluar los efectos del tratamiento de humedad y de las poblaciones y subpoblaciones en cada ambiente por separado, con el modelo estadístico:

Yijkl= µ + Bi + Sj + Bi*Sj + Pk + Sj*Pk + Subl(Pk) + Sj*Subl(Pk) + Eiikl

La correlación de Pearson entre ID y TAC se estimó con los valores promedio de ID por subpoblación en cada tratamiento de humedad (n = 8) y periodo por cada ambiente, y los datos promedio de TAC durante los periodos de medición. Asimismo, para cada tratamiento de humedad (n = 16), se hizo un análisis de correlación entre ID y TAC con los valores promedio por subpoblación, incluyendo los dos ambientes de crecimiento y los dos periodos de evaluación.

Daño por bajas temperaturas

En invierno se obtuvo un ID promedio de 50 %, mientras que en primavera fue 64 %. El ID ocasionado por las bajas temperaturas en los tejidos fue similar tanto en el tratamiento de humedad favorable como en la sequía; sin embargo, entre poblaciones sí se encontraron diferencias significativas (P < 0.05), excepto en primavera para las plantas con crecimiento en intemperie. A nivel de subpoblaciones, solo las plantas en intemperie, durante el invierno, mostraron diferencias significativas (P < 0.01). De la misma manera, la interacción tratamiento de humedad*población fue significativa solo en primavera dentro del invernadero (P = 0.02).

En condiciones naturales, las poblaciones de P. radiata están expuestas a temperaturas mínimas extremas de -5 °C con 300 días sin heladas al año (^{McDonald & Laacke, 1990}); sin embargo, en estudios realizados fuera de su ambiente natural, el follaje de plántulas menores de dos años sufre deterioro al exponerse a temperaturas entre -3 y -6 °C en verano y entre -12 y -14 °C en invierno (^{Burdon, 2001}). En este estudio, el ID en hojas primarias de plantas de 10 y 12 meses de edad fue de 50 y 64 %, durante el invierno y primavera, respectivamente, con una temperatura letal (TL₅₀) cercana a -12 °C. ^{Climent et al. (2009)} señalan una TL₅₀ entre -9 y -12 °C en plantas de 18 meses de la misma especie.

Diferencias entre poblaciones y subpoblaciones

La Figura 1 muestra el ID en las poblaciones y subpoblaciones evaluadas de P. radiata. En el invernadero, la población de isla Guadalupe presentó mayor ID en invierno (59.9 %) y primavera (75.0 %) que la isla Cedros (41.4 y 37.5 % en invierno y primavera, respectivamente); sin embargo, a la intemperie se encontró mayor ID en Cedros (64.1 %) que en Guadalupe (36.5 %) en invierno, mientras que en primavera presentaron ID similar. En las dos condiciones (dentro y fuera del invernadero), el ID cambió más de invierno a primavera en isla Guadalupe, lo cual implica que esta población tiene mayor sensibilidad estacional o fenológica a las bajas temperaturas que la de Cedros.

Figura 1 Índice de daño (ID; media ± error estándar) ocasionado por bajas temperaturas (-12 °C, 4 h) en hojas primarias de plantas de Pinus radiata de las islas Cedros (C) y Guadalupe (G) creciendo en invernadero (a) y a la intemperie (b). Pares de barras con letras distintas indican ID estadísticamente diferente entre poblaciones (P = 0.05). 

^{Larcher (2005)} señala que las diferencias de ID entre ecotipos y entre periodos de evaluación se deben a diferencias en la capacidad fisiológica de aclimatación al frío; es decir, a diferencias en el metabolismo de los carbohidratos, las características de las membranas y las proteínas asociadas al proceso de congelamiento (^{Pearce, 2001}; ^{Roden, Canny, Huang, & Ball, 2009}). Entre estas se incluyen proteínas específicas que inhiben la formación de hielo (proteínas anticongelantes), reducen la velocidad de congelamiento o protegen al protoplasma celular de los efectos del descenso de temperatura y la deshidratación, como las deshidrinas (^{Ambroise et al., 2020}; ^{Larcher, 2005}; ^{Sharma & Deswal, 2014}). Se ha demostrado que el origen geográfico influye en la fenología, afectando la condición fisiológica de las plantas (^{Aldrete, Mexal, & Burr, 2008}) y la síntesis de dichas moléculas (^{Kreyling et al., 2012}; ^{Larcher, 2005}). Varios estudios muestran que las dos islas difieren en condiciones ecológicas, por lo que se consideran dos ecorregiones (^{González-Abraham et al., 2010}). En general, el ambiente en isla Guadalupe es más favorable en humedad relativa por la abundancia de niebla (^{Oberbauer, 2006}; ^{Perry, 2009}), nivel de aridez y frecuencia de temperaturas extremas (^{Hoeksema et al., 2012}). Estas condiciones, además del aislamiento geográfico, han diferenciado las poblaciones, al grado de considerarse variedades distintas (^{Ledig et al., 1998}; ^{Rogers et al., 2006}). En ensayos de campo, la población de Guadalupe presenta mayor crecimiento y productividad que la de Cedros (^{Burdon, Bannister, & Low, 1992}).

De acuerdo con el Cuadro 2, las subpoblaciones mostraron un comportamiento similar en cada población, con excepción de G₂ fuera del invernadero, la cual presentó menor ID que G₁ en invierno. En general, no hay evidencias de una diferenciación adaptativa entre las subpoblaciones muestreadas en cada isla, a pesar de las diferencias en elevación, debido probablemente a que todavía existe suficiente flujo genético entre ellas (^{Rogers, 2004}). Estos resultados contrastan con los descritos por ^{Viveros-Viveros et al. (2009)} en P. hartwegii Lindl. y ^{Sáenz-Romero y Tapia-Olivares (2008)} en P. devoniana Lindl., quienes encontraron diferencias en ID asociadas a la elevación del sitio de origen.

Cuadro 2 Índice de daño ocasionado por baja temperatura (-12 °C, 4 h) en hojas primarias de plantas de dos subpoblaciones de Pinus radiata de las islas Cedros y Guadalupe. 

Población	Subpoblación	Invernadero		Intemperie
		Invierno	Primavera	Invierno	Primavera
Isla Cedros	C1	37.3 ± 8.5a	30.6 ± 5.2 a	64.8 ± 4.7a	70.0 ± 9.7a
	C2	45.6 ± 8.7a	44.7 ± 4.2a	63.5 ± 4.8a	73.3 ± 8.8a
Isla Guadalupe	G1	57.5 ± 8.6a	80.6 ± 6.8a	49.8 ± 5.0a	78.3 ± 9.6a
	G2	62.3 ± 9.0a	68.9 ± 7.6a	24.3 ± 4.3b	71.9 ± 10.3a

Media ± error estándar. Letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre subpoblaciones (P = 0.05).

Efecto de la humedad del suelo

La Figura 2 muestra que el tratamiento de humedad del suelo afectó de manera diferente a las poblaciones en la tolerancia al daño por bajas temperaturas. En invernadero, durante la primavera, las diferencias de daño entre poblaciones fueron más evidentes en sequía que en condiciones favorables de humedad; la restricción de humedad aumentó ligeramente el ID en Guadalupe, pero lo redujo en Cedros. En el invierno, las diferencias del ID entre las poblaciones fueron similares en los dos tratamientos de humedad. En las plantas expuestas a la intemperie durante el invierno y primavera, las diferencias del ID entre poblaciones no fueron significativas, independientemente del tratamiento de humedad.

Figura 2 Humedad del suelo (S₀ = riego; S₁ = sequía) e índice de daño (ID) promedio de las poblaciones de Pinus radiata en invierno (──) y primavera (- - -) en plantas de las islas Cedros (() y Guadalupe (○), creciendo en invernadero (a) y a la intemperie (b). 

La tolerancia a las heladas y a la sequía tienen mucho en común; en ambas, la base de la tolerancia radica en la capacidad del protoplasma para resistir el efecto deshidratante de la privación directa o indirecta de agua (^{Larcher, 2000}). Uno de los procesos metabólicos involucrados incluye la síntesis o acumulación de moléculas en el ajuste osmótico, como azúcares solubles, prolina y betaínas (^{Ambroise et al., 2020}; ^{Arias, Bucci, Scholz, & Goldstein, 2015}; Larcher, 2005). Es concebible que dichos mecanismos se activen por la exposición a sequías severas de corta duración; por lo tanto, una sequía previa a la temporada de heladas podría desencadenar los mecanismos de adaptación a bajas temperaturas, con un menor daño (^{Kreyling et al., 2012}; ^{Walter, Jentsch, Beierkuhnlein, & Kreyling, 2013}). En el invernadero, dicho efecto se registró en las dos poblaciones durante el invierno y en la población de Cedros en la primavera; mientras que a la intemperie solo sucedió en Guadalupe, independientemente del periodo evaluado. Estudios en Quercus robur L. (^{Čehulić et al., 2019}; ^{Thomas & Ahlers, 1999}) y en Q. petraea (Matt.) Liebl. (^{Thomas & Ahlers, 1999}) señalan que la sequía puede aumentar la susceptibilidad a heladas al modificar la dinámica de crecimiento.

Tasa absoluta de crecimiento

En la mayoría de los intervalos de medición, las diferencias en la TAC fueron significativas (P ≤ 0.05) entre tratamientos, entre poblaciones y en la interacción de estos factores en las dos condiciones ambientales (Cuadro 3). Entre subpoblaciones también se encontraron diferencias durante algunos periodos de crecimiento en invernadero, pero no en intemperie.

Las plantas en S₀ (riego) mantuvieron una TAC mayor que en S₁ (sequía) dentro y fuera del invernadero_, pero la dinámica de crecimiento fue distinta en ambas condiciones, tal como se observa en la Figura 3. En el invernadero se presentaron varios ciclos de crecimiento; a partir del día 82 después del trasplante (DDT) se notó el efecto de la humedad con un crecimiento acelerado en S_0, mientras que en S₁, el crecimiento se reactivó hasta después de 112 DDT, luego a los 142 DDT alcanzó una TAC similar a la de S₀ (2.5 mm·d^-1) y, nuevamente, descendió a valores de 0.5 mm·d^-1 a los 164 DDT. A la intemperie, las plantas en S₁ mantuvieron una fase de crecimiento lento (TAC < 1.0 mm·d^-1) durante todo el experimento, mientras que en S₀ presentaron una TAC baja solo la primera parte del invierno, ya que a los 89 DDT reactivaron el crecimiento hasta alcanzar una TAC máxima de 2.5 mm·d^-1 a los 133 DDT.

Figura 3 Tasa absoluta de crecimiento (TAC) de la longitud del tallo en invernadero (a) y a la intemperie (b) por tratamiento de humedad (S₀ = riego; S₁ = sequía). DDT: Días después del trasplante en invernadero; (↓) fechas en que se determinó el índice de daño. 

P. radiata es una especie policíclica que ha evolucionado en un clima mediterráneo con influencia de la humedad costera; en la etapa juvenil, la especie está adaptada para crecer todo el año cuando el clima es adecuado (^{Mead, 2013}), pero su dinámica de crecimiento es muy sensible a los cambios en humedad del suelo (Figura 3) y temperatura del aire. En invernadero, el crecimiento del brote nunca cesó y no se observó la formación de una yema terminal, como ocurre en la mayoría de las especies de pino de clima templado-frío (^{Jansons, Matisons, Libiete-Zālīte, Baders, & Rieksts-Riekstiņš, 2013}; ^{Mead, 2013}).

La diferente dinámica de crecimiento del brote en las plantas dentro y fuera del invernadero muestra sensibilidad al cambio de las condiciones ambientales. Las plantas a la intemperie estuvieron más expuestas a bajas temperaturas durante el invierno (mínima promedio de 0.4 °C). Esta variabilidad fenológica en el patrón de crecimiento del brote, ante los cambios en humedad y temperatura, muestran la complejidad de P. radiata en la tolerancia al frío, en comparación con otros pinos de crecimiento monocíclico como P. pseudostrobus Lindl., P. montezumae Lamb. y P. hartwegii (^{Viveros-Viveros, Sáenz-Romero, López-Upton, & Vargas-Hernández, 2007}). ^{Climent et al. (2009)} y ^{Bachofen et al. (2016)} mencionan que es más complejo interpretar el daño por heladas en pinos de clima mediterráneo costero, con múltiples ciclos de crecimiento y más sensibles a las fluctuaciones de humedad y temperatura, como P. radiata, que en especies de origen continental alpino.

La población de Guadalupe presentó una TAC mayor que la de Cedros en los dos ambientes, pero las diferencias y los picos máximos (2.6 mm·d^-1 en intemperie y 3.2 mm·d^-1 en invernadero) fueron mayores en invernadero (Figuras 4a y 4b). Solo en las subpoblaciones de Cedros se encontraron diferencias en TAC, especialmente en invernadero (Figuras 4c y 4d), ya que en las de Guadalupe, la TAC fue similar entre ellas, en los dos ambientes (Figuras 4e y 4f). Las diferencias en TAC entre poblaciones pueden atribuirse a diferencias genéticas asociadas a las condiciones ecológicas de las islas. ^{Burdon et al. (1992)} señalan que, a los 12 años, la población de Cedros presentó menor tasa de crecimiento en altura que la de Guadalupe.

Figura 4 Tasa absoluta de crecimiento (TAC; mm·d^-1) de la longitud del tallo de Pinus radiata de las poblaciones (a, b) y subpoblaciones (c, d, e, f) nativas de las islas Cedros (C) y Guadalupe (G) en condiciones de invernadero (a, c, e) e intemperie (b, d, f). DDT: Días después del trasplante en invernadero; (↓) fechas en que se determinó el índice de daño.  

Relación entre ID y TAC

Acorde con la Figura 5, la correlación de ID con TAC fue positiva, pero relativamente baja (r < 0.50). Las correlaciones más altas se obtuvieron en invierno (r ≥ 0.46), independientemente del ambiente de crecimiento; en cambio en primavera, la correlación fue más baja (0.25 ≤ r ≤ 0.28). A pesar de que la TAC no tuvo relación clara con el ID, el signo positivo de la correlación indica que las plantas con mayor actividad meristemática son más susceptibles a daños por bajas temperaturas, tal como se ha demostrado en otras coníferas (^{Fløistad & Granhus, 2010}; ^{Sogaard, Granhus, & Johnsen, 2009}). La relación positiva entre ID y TAC fue más evidente en condiciones favorables de humedad que en condiciones de sequía.

Figura 5 Correlación entre el índice de daño (ID) en hojas primarias y la tasa absoluta de crecimiento (TAC) en invierno (a y b) y primavera (c y d) en plantas de Pinus radiata de las islas Cedros (triángulos) y Guadalupe (círculos) con humedad del suelo favorable (negro) y sequía (blanco), en condiciones de invernadero (a y c) y a la intemperie (b y d). 

Cuando el análisis de correlación se hizo por cada tratamiento de humedad (n = 16), la correlación fue mayor en S₀ que en S₁ (Figura 6). La correlación aumenta (r = 0.77) si se consideran solo los datos de las subpoblaciones de Guadalupe (n = 8) o si se excluyen los datos de las dos subpoblaciones de Cedros en invierno (n = 14), debido a que sus plantas prácticamente no crecieron en este periodo. La sequía redujo drásticamente la TAC y alteró la relación entre ID y TAC. Esto explica, en parte, las diferencias observadas en ID entre las poblaciones con respecto a la tasa y dinámica estacional de crecimiento del brote dentro y fuera del invernadero. La población Cedros tiene una TAC intrínseca menor que Guadalupe y también muestra una mayor tolerancia a daños por heladas, resultados que coinciden con información previa (^{Mead, 2013}). La mayor sensibilidad de la población Guadalupe al efecto de la humedad del suelo en ID (Figura 2) y en la dinámica de crecimiento del brote (Figura 5) implica que hay diferencias importantes entre poblaciones en los mecanismos de respuesta y adaptación al estrés hídrico, como resultado de los procesos de adaptación local en las islas donde han evolucionado.

Figura 6 Correlación entre el índice de daño (ID) en hojas primarias y la tasa absoluta de crecimiento (TAC) en plantas de Pinus radiata de isla Cedros (triángulos) e isla Guadalupe (círculos) con humedad del suelo favorable (a) y sequía (b).