Localización del área de estudio

El experimento se realizó en el vivero forestal Praxedis Guerrero de la Secretaría de Recursos Naturales y Medio Ambiente del estado de Durango, México. El vivero se localiza en el kilómetro 12.5 de la carretera Durango-El Mezquital, al sureste de la ciudad de Durango, Dgo. en las coordenadas 23° 56' 58.3" LN y 104° 34' 07.4" LO a 1 890 m.

Condiciones de producción

De acuerdo con su fase de desarrollo, la planta creció en diferentes áreas del vivero. En la etapa de establecimiento, del 11 de octubre al 21 de noviembre de 2018, la planta estuvo en un invernadero de estructura metálica protegida con película de polietileno blanco calibre 720 µm, cubierta a su vez por malla sombra al 50 % y con cortinas laterales. A partir del 22 de noviembre de 2018 y hasta el 31 de enero de 2019, la planta continuó su crecimiento en un invernadero tipo túnel con polietileno verde calibre 720 µm y malla sombra de 50 %. Los promedios de temperatura y humedad relativa fueron 20 °C y 66 %, respectivamente.

A los tres meses y medio después de la siembra (del 1 de febrero al 11 de mayo del 2019), correspondiente a la etapa de crecimiento rápido, el material vegetativo se cambió a otra área de producción con malla sombra al 50 %, donde la temperatura promedio fue de 18.5 °C y la humedad relativa de 48 %. Por último, en la etapa de preacondicionamiento, a los siete meses después de la siembra (del 12 de mayo al 12 de junio de 2019), la planta se expuso a condiciones de intemperie con temperatura promedio de 23 °C y humedad relativa de 42 %.

Producción de la planta

Previo a la siembra, como tratamiento pregerminativo, la semilla se remojó en agua a temperatura ambiente durante 24 h y al término se aplicó fungicida. La siembra se realizó el 11 de octubre de 2018. Como sustrato se empleó una mezcla a base de turba (57 %), vermiculita (23 %) y agrolita (20 %). La porosidad total del sustrato fue de 68.1 % y la porosidad de aireación de 31.5 % con capacidad de retención de agua de 36.6 %, valores normales de acuerdo con la norma NMX-AA-170-SCFI-2016 (^{Secretaría de Economía, 2016}). Se utilizaron envases negros (165 mL de volumen) de polietileno rígido con guías de raíces internas. Durante la preparación del sustrato, la nutrición de la planta se hizo mediante la adición de fertilizante granulado de liberación controlada (ocho a nueve meses de duración) con la composición 11-28-11 de N-P-K, respectivamente.

Previo a la inoculación, las concentraciones de esporas en cada inoculante se verificaron con la cámara Neubauer o hematocitómetro para fijar las dosis empleadas en cada tratamiento propuesto. Los inoculantes con esporas de hongos nativos y exóticos tuvieron una concentración de 1.05 x 10⁷ esporas·mL^-1 y 6.5 x 10⁶ esporas·mL^-1, respectivamente. La inoculación se realizó cuatro meses después de la siembra cuando las plántulas presentaron raíces secundarias (Figura 1a). El procedimiento consistió en inyectar la solución de esporas directamente en el sustrato de cultivo, aproximadamente en un ángulo de 45° con respecto a la raíz principal de la planta a una profundidad de 5 cm, procurando que la solución tuviera el mayor contacto posible con el sistema radical (Figura 1b).

Figura 1 (a) Plántula de Pinus engelmannii con raíces secundarias al momento de la inoculación. (b)Técnica de inoculación empleada. 

Tratamientos evaluados y diseño experimental

Los tratamientos se distribuyeron en un diseño experimental de bloques completos al azar. Se evaluaron nueve tratamientos considerando la inoculación controlada derivada de dos productos comerciales más una condición sin inoculación, combinados con dos dosis de fertilizante de liberación controlada, así como un testigo sin fertilizante (Cuadro 1). Se utilizó un inoculante comercial compuesto por una mezcla de esporas de hongos nativos de México: A. rubescens, Amanita sp., L. indigo, Ramaria sp. y Boletus sp.; el otro inoculante comercial incluía una mezcla de esporas de hongos exóticos: P. tinctorius y S. citrinum. Cada tratamiento estuvo compuesto de cuatro repeticiones con 49 plantas cada una.

Variables evaluadas

A los ocho meses de la siembra y a los cuatro meses de la inoculación, se determinó la supervivencia del lote bajo estudio y se evaluaron la altura del tallo, diámetro al cuello de la raíz, biomasa húmeda y seca de la parte aérea, radical y total de 10 plantas por unidad experimental, extraídas en forma aleatoria. Para estimar la biomasa seca, las plantas se deshidrataron a 65 °C en horno de ventilación forzada durante 72 h. También se determinaron tres índices de calidad de planta que, a través de una evaluación de variables morfológicas, permiten predecir la oportunidad de adaptación de una planta cuando se traslada a campo (^{Prieto et al., 2009}). Estos índices fueron: relación biomasa seca de la parte aérea/biomasa seca de la parte radical, índice de lignificación (IL) e índice de calidad de Dickson (ICD) (^{Dickson, Leaf, & Hosner, 1960}). Los dos últimos se obtuvieron mediante las expresiones siguientes:

IL = Peso total seco (g)Peso total húmedo (g) ×100

ICD = Peso total seco (g)Altura (cm)Diámetro (mm)+Peso seco parte aérea (g)Peso seco raíz (g)

El porcentaje de colonización micorrícica (PCM) se evaluó en el sistema de raíces de tres plantas de cada unidad experimental tomadas al azar. El sustrato adherido al sistema radical de las plantas se eliminó con agua corriente; posteriormente, se seleccionaron al azar 100 cm de raíces secundarias por planta, las cuales se conservaron en una solución de formaldehído, alcohol (96°), ácido acético glacial y agua destilada en proporción 10:50:5:35. El número de ápices micorrizados y no micorrizados se determinó con un microscopio estereoscópico (Leica^® EZ4 HD, Suiza). El PCM se calculó con la ecuación utilizada por ^{García (2018)}:

PCM= Ápices micorrizadosÁpices micorrizados+Ápices no micorrizados×100

Los valores porcentuales de colonización micorrícica y los de supervivencia se transformaron con la función arcoseno y raíz cuadrada. Los datos se sometieron a un análisis de varianza; en los casos donde existieron diferencias significativas se hizo una prueba de separación de medias de Tukey, utilizando el programa estadístico SAS^® versión 9.2 (^{Statistical Analysis System, 2009}).

Variables morfológicas

El valor promedio del diámetro del cuello de la raíz presentó diferencias estadísticas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos. La diferencia entre los valores extremos (2.60 a 5.11 mm) fue del 100 %; de acuerdo con la Figura 2, el inoculante comercial con esporas de hongos exóticos (1.5 mL·planta^-1) más fertilización baja (3 g·planta^-1) (tratamiento 8 = ICHE + FB) generó los valores más altos. La NMX-AA-170-SCFI-2016 estipula que la planta de P. engelmannii requiere un diámetro mínimo de 5 mm para considerar que es de calidad y que pueda ser plantada en campo (^{Secretaría de Economía, 2016}).

Figura 2 Diámetros de Pinus engelmannii obtenidos en los tratamientos con inoculantes micorrícicos comerciales y fertilizante de liberación controlada en vivero. FB = fertilización baja (3 g·L^-1), FA = fertilización alta (6 g·L^-1), ICHN = inoculante comercial con esporas de hongos nativos (1 mL·planta^-1 [1.05 x 10⁷ esporas·mL^-1]), ICHE = inoculante comercial con esporas de hongos exóticos (1.5 mL·planta^-1 [6.5 x 10⁶ esporas·mL^-1]).  

Aunque los tratamientos 2 (FB), 3 (FA) y 9 (ICHE + FA) fueron estadísticamente iguales (P ≤ 0.05) al tratamiento 6 (ICHN + FB), solo este último logró cumplir con el diámetro mínimo que establece la NMX-AA-170-SCFI-2016; mientras que las plantas del tratamiento testigo y de los tratamientos sin fertilizar, independientemente del tipo de inoculante, tuvieron la respuesta más baja (Figura 2).

La Figura 3 muestra el efecto de los tratamientos sobre la biomasa seca de las plantas. Los tratamientos con mayor biomasa seca total fueron el 6 (ICHN + FB) y el 8 (ICHE + FB) con diferencias significativas (P ≤ 0.05) respecto al resto de los tratamientos. La biomasa seca de la parte aérea varió de 0.36 a 1.67 g, sobresaliendo nuevamente el tratamiento 8 (ICHE + FB). Los tratamientos con fertilizante y los que combinaron inoculante y fertilizante produjeron mayor biomasa aérea que los únicamente inoculados y que el testigo. Respecto a la biomasa seca de la parte radical, el rango fue de 0.44 a 1.12 g, donde sobresalió el tratamiento del inoculante comercial con esporas de hongos nativos (1 mL·planta^-1) más fertilización baja (3 g·planta^-1) (tratamiento 6 = ICHN + FB); los valores más bajos ocurrieron en los tratamientos sin fertilizar.

Figura 3 Biomasa seca de Pinus engelmannii en vivero, bajo los tratamientos con inoculantes micorrícicos comerciales y fertilizante de liberación controlada. FB = fertilización baja (3 g·L^-1), FA = fertilización alta (6 g·L^-1), ICHN = inoculante comercial con esporas de hongos nativos (1 mL·planta^-1 [1.05 x 10⁷ esporas·mL^-1]), ICHE = inoculante comercial con esporas de hongos exóticos (1.5 mL·planta^-1 [6.5 x 10⁶ esporas·mL^-1]).  

^{Rentería-Chávez, Pérez-Moreno, Cetina-Alcalá, Ferrera-Cerrato, y Xoconostle-Cázares (2017)} determinaron que las plantas de Pinus greggii Engelm. inoculadas con hongos ectomicorrícicos comestibles desarrollaron mayor cantidad de biomasa total con respecto a aquellas sin inocular. No obstante, en el presente estudio, los tratamientos con los resultados más bajos no fueron los no inoculados, sino los que carecieron de fertilizante. Esto concuerda con lo reportado por ^{Vázquez-Cisneros et al. (2018)}, quienes encontraron que la incorporación de fertilizante de liberación lenta influyó positivamente en el crecimiento de especies del género Pinus en comparación con la planta sin fertilizar.

Índices de calidad de planta

Los valores medios de la relación biomasa seca de la parte aérea/biomasa seca de la parte radical variaron de 0.86 a 1.94. Los tratamientos 3 (FA), 7 (ICHN + FA), 8 (ICHE + FB) y 9 (ICHE + FA) estuvieron dentro del rango de 1.5 a 2.5, el cual representa un balance apropiado entre las áreas de transpiración y de absorción de agua (^{Sáenz, Muñoz, Pérez, Rueda, & Hernández, 2014}). Los tratamientos 1 (Testigo), 4 (ICHN) y 5 (ICHE), caracterizados por no tener fertilizante, obtuvieron valores menores (Cuadro 2), lo que significa que la biomasa radical es mayor que la aérea; por tanto, hay desproporcionalidad en la planta (^{Rodríguez, 2008}).

^{Prieto et al. (2009)} refieren que el índice de lignificación expresa el nivel de preacondicionamiento de las plantas; cuando son de calidad presentan valores de 25 a 30 %. Esto se relaciona con la fase de intemperización donde los individuos sufren estrés debido al cambio drástico en las condiciones de luz, de malla sombra a intemperie y de mayor a menor disponibilidad de humedad. En el presente estudio, los tratamientos que carecían de fertilizante alcanzaron valores óptimos (P ≤ 0.05).

El índice de calidad de Dickson es una medida integrada de rasgos morfológicos, donde los valores altos expresan mejor calidad de planta (^{García, 2018}; ^{Prieto et al., 2009}). Este índice se ha utilizado para la selección de plantas mejor proporcionadas, así como para predecir su respuesta una vez plantadas en campo (^{Sáenz et al., 2014}). Los resultados variaron de 0.30 a 0.98, posicionando al tratamiento del inoculante comercial con esporas de hongos nativos (1 mL·planta^-1) más fertilización baja (3 g·planta^-1) (tratamiento 6 = ICHN + FB) como el mejor, con diferencias significativas (P ≤ 0.05) respecto al resto de los tratamientos. Esto concuerda con lo que reportan ^{Martínez et al. (2016)}, quienes obtuvieron un índice de 1.08 como efecto de la inoculación inducida con Russula delica Fr. en P. engelmannii, manteniendo un régimen de fertilización acorde con las etapas de desarrollo de la planta. De acuerdo con este parámetro, en el presente estudio, las plantas de los tratamientos sin fertilización fueron las de menor calidad (Cuadro 2).

Supervivencia

Acorde con la Figura 4, la supervivencia varió de 80 a 96 %, sin que existieran diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre tratamientos. La literatura reporta efectos negativos en las plantas al utilizar dosis altas de fertilización (^{Marschner, 2012}), favoreciendo la susceptibilidad de la planta a plagas y enfermedades que conducen a la muerte. Esto puede explicar la mortalidad causada por un brote de damping off más severo en los tratamientos 3 (FA), 7 (ICHN + FA) y 9 (ICHE + FA), caracterizados por tener dosis alta de fertilización. Esta enfermedad se presenta en viveros forestales y es causada por un complejo de hongos de los géneros Phytopthora, Pythium, Fusarium y Rhizoctonia; su característica principal es el necrosamiento del tejido de conducción a nivel del cuello de la raíz de la plántula que ocasiona su muerte (^{Cibrián, Alvarado, & García, 2007}).

Figura 4 Supervivencia de las plantas de Pinus engelmannii en los tratamientos con inoculantes micorrícicos comerciales y fertilizante de liberación controlada, después de ocho meses de la siembra. FB = fertilización baja (3 g·L^-1), FA = fertilización alta (6 g·L^-1), ICHN = inoculante comercial con esporas de hongos nativos (1 mL·planta^-1 [1.05 x 10⁷ esporas·mL^-1]), ICHE = inoculante comercial con esporas de hongos exóticos (1.5 mL·planta^-1 [6.5 x 10⁶ esporas·mL^-1]).  

Porcentaje de colonización micorrícica

La Figura 5 muestra que el PCM varió de 15 a 71 % y mostró tendencia inversa a la dosis de fertilización empleada. Los tratamientos 3 (FA), 7(ICHN + FA) y 9 (ICHE + FA), caracterizados por tener dosis de 6 g·L^-1 de fertilizante de liberación controlada, tuvieron baja micorrización independientemente del tipo de inoculante, lo cual concuerda con lo reportado por ^{Baltasar et al. (2007)} y ^{Salgado et al. (2009)}. Los tratamientos con mayor PCM fueron el 1 (testigo), 4 (ICHN), 5 (ICHE) y 6 (ICHN + FB), destacando el tratamiento 4, aunque sin diferencias estadísticas entre sí, lo que indica que la simbiosis se estableció con más abundancia en un ambiente limitado en nutrientes, funcionando como mecanismo de nutrición auxiliar. Esto concuerda con lo observado por ^{Bücking, Liepold, y Ambilwade (2012)}, quienes reconocen la existencia de dos vías para la absorción de nutrimentos en las plantas; la directa que involucra la epidermis y los pelos absorbentes de la raíz, y la segunda a través de las ectomicorrizas. En esta última, el micelio externo favorece una mayor exploración en el suelo. Con respecto a los tratamientos sin inocular, debido a que el ensayo se realizó bajo condiciones normales de producción en vivero, las plantas desarrollaron colonización ectomicorrícica indeseable.

Si bien existió la tendencia negativa respecto al porcentaje de micorrización y la fertilización empleada, los resultados mostraron que el tratamiento 6 (ICHN + FB) tuvo un balance entre las dos variables; esto repercutió favorablemente en la calidad de planta producida en ese tratamiento, confirmando la hipótesis planteada. De manera general, la asociación hongo-raíz tuvo una respuesta diferenciada en función de la cantidad de fertilizante empleado, lo cual coincide con lo planteado por ^{Trappe (1977)}. Al respecto, ^{Brundett et al. (1996)} realizaron un estudio sobre fertilización y hongos micorrícicos asociados a Eucalyptus diversicolor F. Muell. y encontraron que el aumento en la dosis de fertilización mineral repercutió en la disminución en la colonización micorrícica; sin embargo, dicho efecto fue diferencial encontrando que el género Scleroderma es menos susceptible a la fertilización que P. tinctorius.

Figura 5 Colonización micorrícica (PCM) en plantas de Pinus engelmannii bajo tratamientos de micorrización y fertilizantes de liberación controlada, después de ocho meses de la siembra. FB = fertilización baja (3 g·L^-1), FA = fertilización alta (6 g·L^-1), ICHN = inoculante comercial con esporas de hongos nativos (1 mL·planta^-1 [1.05 x 10⁷ esporas·mL^-1]), ICHE = inoculante comercial con esporas de hongos exóticos (1.5 mL·planta^-1 [6.5 x 10⁶ esporas·mL^-1]).  

Caracterización de ectomicorrizas

En el presente estudio se encontraron tres morfotipos de ectomicorrizas: uno del inoculante comercial con esporas de hongos nativos y dos del inoculante comercial con esporas de hongos exóticos. Del primer inoculante que contenía esporas de A. rubescens, Amanita sp., L. indigo, Ramaria sp. y Boletus sp., solo se identificó un morfotipo afín al género Amanita spp. que presentó ramificación dicotómica sin rizomorfos, con terminaciones no ramificadas rectas de forma cilíndrica no inflamada y terminación ligeramente afilada, de colores ocre, ocre-amarillento o blanco con presencia de manto (Figura 6a) (^{Determination of ectomycorrhizae [DEEMY], 2019}). El resto de las especies contenidas en el inoculante (L. indigo, Ramaria sp. y Boletus sp.) no formaron ectomicorrizas. Al respecto, ^{Ishida, Nara, Tanaka, Kinoshita, y Hogetsu (2008)}) y ^{Nara (2009)} mencionan que algunas especies de hongos ectomicorrícicos son pioneros, por lo que sus esporas responden rápido a la germinación ante la presencia de raíces de las plantas hospederas; en contraste, otras especies (donde se incluyen especies del género Lactarius) requieren estímulos adicionales que se obtienen conforme el hábitat se desarrolla, por lo que la inoculación con esporas puede no ser exitosa.

Del inoculante con esporas de hongos exóticos, se identificaron dos morfotipos; el primero afín a S. citrinum, que en estructuras con desarrollo inicial se caracterizó por ectomicorrizas estipitadas con ramificación dicotómica, de color blanco y sin presencia de rizomorfos. Los sistemas de micorrizas en estadios maduros presentaron ramificación principalmente coraloide estipitadas de color blanco amarillento, con terminaciones rectas no ramificadas y presencia de rizomorfos (Figura 6b). El segundo morfotipo tuvo estructuras coraloides estipitadas con ramificaciones dicotómicas color marrón, ápices rectos no ramificados y rizomorfos de conexión restringida a la parte lateral de los ápices. Esta descripción corresponde a la realizada por ^{Valdés, Ambriz, Camacho, y Fierros (2010)}, quienes probaron el mismo producto utilizado en el presente trabajo y que de igual forma contenía esporas de P. tinctorius, solo que en raíces de Pinus devoniana Lindl. (Figura 6c).

En los tratamientos sin inoculante (testigo, FB y FA) se observó colonización micorrícica en estadios iniciales, condición que no permitió la identificación de especies. De manera general, se observó que los sistemas de micorrizas en los tratamientos con solo inoculante (ICHN y ICHE), así como aquellos con inoculante y fertilización baja (ICHN + FB y ICHE + FB) presentaron ectomicorrizas en estadio maduro; en contraste, los tratamientos con inoculante y fertilización alta (ICHN + FA y ICHE + FA) mostraron estructuras micorrícicas en estadios de desarrollo inicial (Figuras 6d y 6e). Esto podría indicar que el nivel de micorrización, hasta el momento de la evaluación, fue afectado en función de la dosis de fertilización, retrasando el desarrollo de las ectomicorrizas, tal como lo observó ^{Marx (1980)}.

Figura 6 Morfotipos de ectomicorrizas en Pinus engelmannii: (a) morfotipo afín a Amanita spp.; (b) morfotipo afín a Scleroderma citrinum; (c) morfotipo afín a cepa comercial de Pisolithus tinctorius descrita por ^{Valdés et al. (2010)}; (d) ectomicorriza en desarrollo inicial; (e) ectomicorriza afín a Scleroderma citrinum en estadio maduro.