Etapa de vivero

La etapa de vivero se realizó en los invernaderos experimentales del Postgrado en Ciencias Forestales del Colegio de Postgraduados en Montecillo, Texcoco, Estado de México (9° 29’ N - 98° 54’ O y altitud de 2 240 m). La siembra de P. rudis se hizo durante la primera quincena del mes de octubre de 2012. La semilla provino del banco de germoplasma “El Vergel” ubicado en San Pedro Cholula, Puebla; un banco de la red de la Comisión Nacional Forestal. Como sustrato se utilizó una mezcla de corteza de pino, turba de musgo, perlita y vermiculita en proporción 70:10:10:10 en volumen. Además, se adicionó fertilizante Osmocote Plus^® (15-9-12) con tiempo de liberación de nueve meses, en dosis de 7 kg·m^-3 de sustrato, lo que equivale a 3 750, 967.5 y 2 490 ppm en masa de N, P y K, respectivamente, tomando en cuenta que la densidad del sustrato fue 0.28 g·cm^-3. Se utilizaron envases individuales (tubetes) de color negro con aberturas laterales, cuyas medidas son 11.9 cm de largo, 6 cm de diámetro superior, 4.9 cm de diámetro inferior y volumen de 220 mL. Las plantas crecieron en un invernadero con cubierta de plástico durante ocho meses antes de iniciar la prueba de endurecimiento. El manejo de la planta en vivero incluyó riegos diarios a capacidad de campo durante la primera etapa de establecimiento (seis semanas) y riegos hasta saturación cada dos días durante la etapa de crecimiento rápido. Solo en el último mes de esta fase preparatoria de ocho meses se hicieron aplicaciones complementarias con fertilizante soluble (Peters Professional^®) en el agua de riego, una vez por semana. Lo anterior es una práctica común en el proceso de producción de planta de coníferas. Se utilizó la formulación 20-20-20 en dosis de 0.5 g·L^-1 equivalente a 100, 43 y 83 ppm (m/v) de N, P y K, respectivamente.

Tratamientos de fertilización en la etapa de endurecimiento

El endurecimiento inició el 31 de mayo de 2013 y consistió en utilizar la fertilización tradicional (testigo) y combinaciones crecientes de P y K. El tratamiento testigo de endurecimiento correspondió a plantas fertilizadas con Peters Professional® (4-25-35 de N, P y K, respectivamente), de acuerdo con los niveles recomendados para la fase de endurecimiento de coníferas (^{Landis, 1989}). Las combinaciones de fertilización se prepararon de acuerdo con cada tratamiento mostrado en el Cuadro 1. Los tratamientos 2 y 3 consistieron en adicionar P en dos niveles: 50 % (P+) y 100 % (P++) con respecto al testigo. De manera similar, para los tratamientos 4 y 5, se manejaron dos niveles identificados como K+ y K++ que corresponden a 50 y 100 % de aumento de K con respecto al testigo. Finalmente, en los tratamientos 6 y 7, la dosis de Peters Professional® se incrementó en 50 % (PT+) y 100 % (PT++).

En los tratamientos, los niveles de P y K se modificaron con ácido fosfórico (H₃PO₄) al 85 % y sulfato de potasio (K₂SO₄), respectivamente. El riego combinado con fertilización se hizo cada 72 h por un periodo de ocho semanas. El experimento se estableció en un diseño completamente al azar. Cada uno de los siete tratamientos (Cuadro 1) se integró con 50 plantas y se repitió cuatro veces, lo que resultó en un total de 1 400 plantas.

Evaluación de las características morfométricas

Después del endurecimiento se evaluaron 48 plantas por tratamiento seleccionadas al azar; de cada repetición se extrajeron 12 plantas de la parte central de las parcelas para eliminar el posible efecto de orilla. En cada planta se midió el diámetro del cuello de la raíz y luego se removió el sustrato con agua abundante de manera cuidadosa para no perder material vegetal de interés. Posteriormente, la parte aérea se separó de la radical con un corte a la altura del cuello de la raíz; el exceso de humedad se retiró con papel absorbente y cada parte se depositó en bolsas de papel. Las muestras se secaron en estufa con circulación de aire a 70 °C durante 72 h y después se obtuvo el peso seco de cada componente. Con los datos se calculó la relación parte aérea/raíz (RPAR).

Evaluación del potencial de crecimiento de raíz

La prueba de potencial de crecimiento de raíz consistió en colocar una muestra aleatoria de plantas en un ambiente favorable para promover el crecimiento rápido de las raíces. Estas plantas crecieron en un sustrato con proporción 70:30 de corteza y perlita durante 40 días en macetas con capacidad de 10 L, protegidas bajo invernadero y con riego diario. Al momento del trasplante se cortaron todas las raíces blancas para dar lugar a la formación de raíces finas (<2 mm). Las raíces blancas representan tejido formado recientemente, cuyo potencial de crecimiento es influenciado por la capacidad de la planta para adaptarse a las condiciones del sitio (^{Ostonen, Lõhmus, Helmisaari, Truu, & Meel, 2007}). La unidad experimental fue de tres plantas por tratamiento con cuatro repeticiones, dando un total de 12 plantas por tratamiento. El arreglo de las macetas fue al azar. A los 40 días, las plantas se sacaron de las macetas y se lavaron las raíces con cuidado para hacer la medición. Las variables obtenidas fueron el número total de raíces iniciales (NRI), número de raíces formadas (NRF) y peso seco de las raíces nuevas (PSRN). Las raíces nuevas se identificaron por su color blanco característico, tal como se ha realizado en estudios similares (^{Sánchez-Aguilar, Aldrete, Vargas-Hernández, & Ordaz-Chaparro, 2016}).

Análisis nutrimental

Después del endurecimiento, la concentración de nutrientes NPK se analizó en el follaje y en la parte aérea (cuatro repeticiones por tratamiento). Los análisis foliares se interpretaron mediante la técnica de análisis de vectores propuesta por ^{Park, Park, y Bae (2015)}. Esta técnica analiza, conjuntamente, los cambios relativos de las variables masa del componente vegetal y concentración y contenido de nutrimentos (^{Isaac & Kimaro, 2011}; ^{López-López & Alvarado-López, 2010}; ^{Mead, Scott, & Chang, 2010}; ^{Park et al., 2015}; ^{Salifu & Timmer, 2003}). Los vectores se graficaron con un programa basado en macros programadas en Excel (http://bit.ly/2Eok8GF). La Figura 1 muestra un resumen de la base gráfica del método de vectores empleado en este estudio y la explicación de los cambios con respecto al tratamiento testigo. Los efectos principales se determinaron de acuerdo con la interpretación gráfica, tal como se ha realizado en otros estudios (^{Isaac & Kimaro, 2011}; ^{López-López & Alvarado-López, 2010}; ^{Mead et al., 2010}; ^{Park et al., 2015}; ^{Salifu & Timmer, 2003}).

Figura 1 Método de vectores en el análisis nutrimental. Resumen gráfico de cambios principales de las variables (masa del componente vegetal y concentración y contenido de nutrimentos) y su efecto más probable. 

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza (P ≤ 0.05) para comparar las medias de las variables morfométricas, potencial de crecimiento de raíz y concentraciones de nutrientes entre tratamientos, bajo un modelo completamente al azar con el uso del programa SAS versión 9.0 (^{Statistical Analysis System Institute [SAS], 2002}). La separación de medias se hizo con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

Características morfométricas de Pinus rudis

De acuerdo con el Cuadro 2, las características morfométricas de P. rudis no mostraron diferencias significativas entre tratamientos (P > 0.05). En 10 meses, las plántulas de P. rudis alcanzaron un diámetro al cuello de la raíz de 4.8 a 5.5 mm, peso seco aéreo de 4.2 a 4.4 g, peso seco de raíces de 1.1 a 1.2 g y la relación parte aérea /raíz (RPAR) en todos los tratamientos resultó de 4.

Los parámetros morfométricos indican que, a pesar de someterse a diferentes niveles de fertilización, las proporciones de biomasa no cambiaron. Los resultados sugieren que para P. rudis, biológicamente es más importante mantener su balance morfométrico que aprovechar mayor disponibilidad de nutrientes, como ocurre en otras especies forestales como Quercus ilex ssp. ballota (Desf.) Samp. (^{Andivia, Fernández, & Vázquez-Piqué, 2011}). La RPAR ideal varía entre 2 y 3 (^{Jackson et al., 2012}; ^{Villar, 2003}), pero en este estudio P. rudis mostró un valor de 4. Es posible que por ser una especie que crece en sitios con estación de primavera seca e invierno frío, la prioridad de inversión de energía en biomasa de raíces sea menor comparada con otras especies (^{Magaña, Torres, Rodríguez, Aguirre, & Fierros, 2008}).

El aumento de P, K y FS durante las ocho semanas de endurecimiento no tuvo efecto significativo en la morfometría (P > 0.05). Al respecto, en Pinus engelmannii Carr., el endurecimiento de fertilización combinado con la exposición a la intemperie estimuló el crecimiento de la raíz y promovió mayor concentración de nutrientes en el follaje (^{García-Pérez et al., 2015}); sin embargo, las ventajas netas en campo no se han podido demostrar, debido a la falta de investigación y conocimiento sobre las especies de pino en México. Aunque Pinus montezumae Lamb. mostró respuesta favorable al endurecimiento con fertilización en campo, este beneficio solo se observó en exposiciones norte con mayor disponibilidad de agua y temperaturas más bajas (^{Robles, Rodríguez, & Villanueva, 2017}). En estudios con Pinus resinosa Ait. se observó que, aunque las concentraciones de nutrientes durante la fase de endurecimiento no difirieron entre plantas fertilizadas y no fertilizadas, las primeras respondieron más rápido en crecimiento después de un periodo de sequía (^{Miller & Timmer, 1994}). Estos trabajos resaltan la importancia de continuar con estudios de endurecimiento y su evaluación en campo.

Potencial de crecimiento de raíz

La mayoría de los tratamientos mostraron NRI y NRF similares a los del testigo (Cuadro 3). Solo los tratamientos K+ y PT++ mostraron diferencia significativa (P ≤ 0.05) de NRI entre sí, al igual que P+ y PT++ en el NRF (P ≤ 0.05). Con relación al PSRN no se observaron diferencias significativas entre tratamientos; sin embargo, cuando la dosis de P aumentó 50 %, las plántulas aumentaron 25 % el número de raíces blancas con respecto al testigo.

Un resultado destacable fue el mayor NRI obtenido ante el incremento de 50 % en la dosis de K (K+). El tratamiento con 50 % más de fósforo (P+) generó mayor NRF con una media de 201; en contraste, un aumento de 100 % del fertilizante soluble (PT++) resultó en el menor NRF. Esto se explica debido a que las raíces adquieren P principalmente por difusión y las plantas tienden a formar más raíces finas para asegurar su abastecimiento (^{Schlesinger & Bernhardt, 2013}); por lo tanto, si el sustrato provee suficiente P, se generan menos raíces finas. Los resultados muestran una tendencia de campana con un óptimo de 259 mg de P por planta que se satisface con el tratamiento P+.

El potencial de crecimiento de raíz es un índice confiable del establecimiento exitoso de las plantas en campo (^{Grossnickle, 2005}), porque proporciona datos de la producción y crecimiento de raíces nuevas durante el arraigo de las plántulas en un ambiente óptimo (Hasse, 2007).

Análisis nutrimental

Las concentraciones de N, P y K en el follaje, después del proceso de endurecimiento, mostraron cambios positivos y negativos con respecto al testigo, pero se mantuvieron dentro de los valores esperados para coníferas (^{Landis, 1989}). Con el tratamiento de PT++ se obtuvo la mayor concentración de N con una proporción de 17.78 mg·g^-1, mientras que la menor concentración de N se registró en el tratamiento P++ con un valor de 13.69 mg·g^-1. La mayor concentración de P se obtuvo con los tratamientos P++ y PT++ con valores de 2.96 y 2.74 mg·g^-1, respectivamente. En el caso del K, la mayor concentración se obtuvo con el tratamiento PT++ con un valor de 5.57 mg·g^-1. La variación en concentraciones de K (4.71 a 5.57 mg·g^-1) se encuentra dentro de los valores registrados para otra especies de pino como Pinus devoniana Lindl. (^{Rueda et al., 2010}). Las concentraciones de N y P son las esperadas para coníferas bajo experimentos de fertilización y superiores a las esperadas sin fertilización; es decir, valores superiores a 10 mg·g^-1 de N y 1.2 mg·g^-1 de P (^{Nambiar & Fife, 1991}). La concentración de nutrientes en el follaje y en la parte aérea mostraron la misma tendencia (datos no mostrados).

Análisis de vectores

Dado que los resultados mostraron una dispersión gráfica similar de concentración de nutrientes para las variables biomasa aérea y de follaje, se decidió emplear una sola variable para el análisis. Los resultados que se muestran corresponden a la biomasa aérea, una variable que representa un almacén importante de reservas en las plántulas (^{Grossnickle & MacDonald, 2018}). El análisis gráfico de los tratamientos mostró dos direcciones predominantes en los vectores con relación a la biomasa aérea. La primera dirección señala incremento en la concentración y contenido de nutrientes, pero sin cambio en la categoría de biomasa (líneas diagonales) (^{Park et al., 2015}). Dicha orientación se define por el vector D de la Figura 1. La segunda dirección se relaciona con la disminución de la concentración y contenido de nutrientes sin cambio de categoría de biomasa. En este caso, la orientación se define por el vector H de la Figura 1, que indica un efecto antagónico (^{Isaac & Kimaro, 2011}).

La Figura 2 muestra la tendencia de vectores para biomasa aérea relativa (cambio en biomasa aérea con respecto al testigo) de este estudio. El tratamiento PT++ promovió mayor consumo de lujo para los tres nutrientes. Los vectores se identifican como N-PT++ y K-PT++, y el consumo de lujo se denota por el desplazamiento mayor de cada vector hacia la esquina superior derecha en cada gráfica de la Figura 2; es decir, un aumento de concentración y masa neta, pero sin cambio proporcional en biomasa relativa (comparar con vector D de Figura 1).

Figura 2 Diagrama de vectores para el análisis nutrimental en la biomasa aérea de Pinus rudis. Los gráficos a, b y c muestran los cambios en la concentración y contenido relativo de N, P y K. En el gráfico d, los vectores en línea negra, roja y verde corresponden a los tratamientos P++, PT++ y K++, respectivamente. En los nombres de los vectores, la primera literal indica el nutriente analizado y la segunda (después del guion) corresponde al tratamiento (testigo = Peters Professional® [4-25-35]; P+ y P++ = aumento de 50 y 100 % de P, respectivamente, con relación al testigo; K+ y K++ = aumento de 50 y 100 % de K, respectivamente, con relación al testigo; PT+ y PT++ = aumento de 50 y 100 % de Peters Professional®, respectivamente).  

El tratamiento P++ (dosis 100 % mayor que la tradicional) estimuló el consumo de lujo de P, ya que fue efectivo para incrementar el contenido en casi 30 % (Figura 2); sin embargo, redujo la concentración de N (Cuadro 4; Figura 2). La dirección de los vectores de las concentraciones de K con relación a los tratamientos es similar a los de N y P, pero de menor longitud, lo que se debe a una menor respuesta.

Cuadro 4 Concentración de N, P y K en el follaje de Pinus rudis después de los tratamientos de endurecimiento mediante fertilización. 

Tratamiento	Nitrógeno (mg·g-1)	Fósforo (mg·g-1)	Potasio (mg·g-1)
P+	14.60 ± 1.53 bc	2.42 ± 0.07 b	4.71 ± 0.44 b
P++	13.69 ± 0.84 c	2.96 ± 0.17 a	5.43 ± 1.34 b
K+	14.70 ± 0.60 bc	2.24 ± 0.08 b	5.30 ± 0.60 b
K++	16.81 ± 1.96 ab	2.19 ± 0.09 b	5.32 ± 0.25 b
PT+	16.90 ± 1.38 ab	2.39 ± 0.14 b	4.85 ± 0.52 b
PT++	17.78 ± 1.10 a	2.76 ± 0.25 a	5.57 ± 1.02 a
Testigo	15.95 ± 1.43 abc	2.34 ± 0.14 b	5.20 ± 1.40 b

Tratamientos: Testigo = Peters Professional® (4-25-35); P+ y P++ = aumento de 50 y 100 % de P, respectivamente, con relación al testigo; K+ y K++ = aumento de 50 y 100 % de K, respectivamente, con relación al testigo; PT+ y PT++ = aumento de 50 y 100 % de Peters Professional®, respectivamente. Valores promedios ± error estándar. Medias con letra distinta son estadísticamente diferentes de acuerdo con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

El objetivo del endurecimiento mediante fertilización es incrementar el contenido de nutrientes en la masa vegetal. Al respecto, las ganancias en concentración de nutrientes de este estudio se consideran bajas, ya que en coníferas se logran aumentos del 50 % en comparación con el testigo (^{Dumroese, 2003}); sin embargo, lo destacable es que los incrementos relativos fueron detectables por el método gráfico.

Los resultados de este trabajo muestran dos estrategias para el endurecimiento de P. rudis. La primera es la carga adicional de P en la aplicación doble del fertilizante soluble en el riego (PT++) que se asocia tambien con mayores concentraciones de N y K foliares. Esta estrategia de endurecimiento se puede considerar cuando la planta de P. rudis se va a establecer en suelos de baja fertilidad, como Cambisoles o Leptosoles. El segundo escenario es una carga adicional de P con la aplicación doble de fertilizante a base de fósforo (P++); sin embargo, esta práctica sería más recomendable cuando la planta esté destinada a sitios donde el P es crítico, como es el caso de los Andosoles.