Sustratos y semilla

El experimento se llevó a cabo en los invernaderos (19˚ 29´ 34” N y 98˚ 53´ 38” O, altitud de 2 240 m) de la División de Ciencias Forestales (DiCiFo) de la Universidad Autónoma Chapingo en Texcoco, México.

Los sustratos evaluados fueron los siguientes: S1 = turba de musgo (PROMIX^®), agrolita y vermiculita; S2 = aserrín de pino, corteza de pino y turba de musgo; y S3 = corteza de pino, aserrín de pino y turba de musgo; todos en proporción 60:20:20 (^{Hernández-Zarate, Aldrete, Ordaz-Chaparro, López-Upton, & López-López, 2014}). El aserrín se obtuvo de un aserradero local con material fresco (no mayor de 15 días de aserrado) de Pinus patula Schltdl. & Cham. La corteza en compost de Pinus douglasiana Martínez se obtuvo de la empresa MASVI en la región sur de Jalisco. A las mezclas de cada sustrato se agregó fertilizante de liberación controlada Osmocote Plus® 15-9-12 en dosis de 7 g·L^-1, con tiempo de liberación de ocho a nueve meses.

Se utilizaron mesas portatubetes con 42 cavidades y tubetes de 170 mL. La semilla de P. greggii se obtuvo de un banco de germoplasma localizado en la comunidad de Pueblo Nuevo, municipio de Chignahuapan, Puebla (19° 52´ 60" N y 98° 06´ 36" O y altitud de 2 450 m). Después de llenar los tubetes con cada tipo de sustrato, la siembra se hizo en forma directa colocando dos semillas por cavidad. Un mes después se hizo un raleo para dejar una sola plántula por cavidad y, a finales de mayo, cuando las plantas tenían 45 días de edad (25 de mayo de 2015), se realizó la inoculación con F. circinatum y la primera aplicación de T. harzianum al sustrato. El riego se aplicó diariamente en forma superficial durante la germinación y emergencia de las plantas; posteriormente, cada tercer día. El experimento tuvo una duración de 13 semanas (junio a septiembre).

Plantas de Pinus greggii inoculadas con Fusarium circinatum

Las plantas de P. greggii se inocularon con la cepa SF5 aislada del Vivero Forestal Militar de Atlangatepec, Tlaxcala, y obtenida del cepario del laboratorio de Parasitología Forestal de la DiCiFo. La cepa está identificada, morfológicamente y con tres marcadores moleculares, como F. circinatum; sus números de accesión depositados en el banco de genes (GenBank) son ITS (KX276596), TEF (KZ337005) e IGS (KX306890). Para la inoculación de F. circinatum (Fc) se tomaron cepas puras con ocho días de crecimiento en medio de cultivo PDA con desarrollo de micelio y esporulación del hongo. El fitopatógeno se aplicó mediante inyección de 20 mL de una suspensión de 7.9 x 10⁴ esporas·mL^-1 (^{García-Díaz et al., 2017}) al sustrato (S) de cada tubete. Los tratamientos inoculados con F. circinatum fueron T2 (S1+Fc), T6 (S2+Fc) y T10 (S3+Fc) (Cuadro 1).

Plantas de Pinus greggii inoculadas con Trichoderma harzianum

Se utilizó la cepa comercial T-22 KRL-AG2 de T. harzianum (Th) de PHC® en dosis de 3.4 g·L^-1 de agua, con una dilución de 10⁷ esporas·g^-1 de peso seco. La inoculación se realizó aplicando 20 mL por tubete, mediante inyección al sustrato, en tres aplicaciones. La primera aplicación de Th se realizó el 25 de mayo al momento de establecer el experimento. Las otras dos aplicaciones se realizaron con intervalo mensual (25 de junio y 25 de julio de 2015). Los tratamientos inoculados con T. harzianum fueron T3 (S1+Th), T7 (S2+Th) y T11 (S3+Th) (Cuadro 1).

Plantas de Pinus greggii inoculadas con Fusarium circinatum y Trichoderma harzianum

En la primera aplicación, se utilizó una mezcla de 10 mL de F. circinatum y 10 mL de T. harzianum (Fc+Th) con las mismas concentraciones y dosis empleadas en los tratamientos individuales. Posteriormente, se realizaron otras dos aplicaciones (una cada mes) con solo T. harzianum. La mezcla se inyectó en los tubetes correspondientes de cada sustrato. Los tratamientos inoculados con la mezcla fueron T1 (S1+Fc+Th), T5 (S2+Fc+Th) y T9 (S3+Fc+Th) (Cuadro 1). En cada sustrato, el tratamiento sin aplicación de hongos se usó como testigo: T4 (S1-Te), T8 (S2-Te) y T12 (S3-Te) (Cuadro 1).

Variables evaluadas

Diseño experimental y análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar, el cual fue representado por el modelo siguiente:

Yij = µ + Ti + eij

Se utilizaron tres sustratos (S1, S2 y S3) con y sin F. circinatum (Fc), con y sin T. harzianum (Th), para un total de 12 tratamientos con cuatro repeticiones (Cuadro 1). Cada repetición fue una mesa portatubetes de 42 cavidades; la unidad experimental estuvo constituida por las 20 plantas del centro (80 plántulas de P. gregii por tratamiento, dando un total de 960 plántulas evaluadas). Los estándares morfológicos se midieron en las plantas con y sin Th en los tres sustratos; la unidad experimental se conformó de 15 plantas al azar de la parte central de cada mesa portatubetes (60 plántulas de P. gregii por seis tratamientos = 360 plantas). Los datos se sometieron a un análisis de varianza mediante el procedimiento GLM de SAS, versión 9.0 (^{Statistical Analysis System [SAS Institute], 2002}) y comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05).

Patogenicidad de Fusarium circinatum en plántulas de Pinus greggii

La patogenicidad se determinó con base en la capacidad del hongo F. circinatum cepa SF5 para causar enfermedad, la cual se manifestó a los 20 días después de la inoculación (ddi). ^{Robles, Gómez, Macas, Sánchez, y Torres-Gutiérrez (2014)} inocularon plantas de babaco (Vasconcellea × heilbornii [V. M. Badillo] V. M. Badillo) con F. oxysporum Schltdl. mediante heridas en las raíces y observaron síntomas a los 15 días, mientras que cuando inyectaron el inóculo al sustrato, los síntomas tardaron hasta un mes en manifestarse.

La primera manifestación de síntomas de la enfermedad en las plántulas de P. greggii se registró en el sustrato hecho a base de corteza de pino (S3) (Figura 1A); sin embargo, se apreció de manera similar en los tres sustratos durante la primera semana. Las plántulas mostraron estrangulamiento del tallo y marchitamiento del brote principal (Figura 1B); posteriormente, las acículas se tornaron amarillentas y de color rojizo. Esto mismo lo manifiestan ^{Soria, Alonso, y Bettucci (2012)}, al mencionar que, los síntomas aéreos en las plántulas de Pinus taeda L. no se manifiestan hasta que el patógeno alcanza la zona del cuello, lo que se traduce en marchitamiento, pérdida de color (enrojecimiento) y secado de las acículas hasta la muerte. Al extraer plántulas enfermas se observó pudrición de la raíz principal y secundarias; las raíces manifestaron color café claro. En las raíces de P. greggii inoculadas con F. circinatum no se realizaron heridas y aun así se presentó la enfermedad; esto coincide con ^{Peterson (2008)}, quien señala que Fusarium spp. es capaz de infectar directamente en el tejido, pero difiere con ^{Soria et al. (2012)}, quienes mencionan que la infección está asociada a lesiones o heridas en la corteza u otros tejidos en los árboles, debido a que este hongo es incapaz de penetrar directamente en el tejido.

Figura 1 Patogenicidad y efecto de Fusarium circinatum en plántulas de Pinus greggii sembradas en tres sustratos. A) Plántulas de tres y cinco meses de edad con el sustrato de corteza de pino, aserrín de pino y turba de musgo (S3) en proporción 60:20:20. B) Síntomas con doblamiento del brote principal y decaimiento. C) Plántulas con acículas amarillentas y de color rojizo. D) Tallo de la planta con micelio y esporodoquios de F. circinatum. E y F) Cepas de los reaislamientos de F. circinatum. 

Los síntomas fueron más evidentes cuando la planta tenía de cuatro a seis meses de edad, ya que manifestó doblamiento del brote principal, decaimiento, marchitamiento con cambios paulatinos de color marrón hasta quedar completamente rojizos, lo cual se considera un síntoma de muerte (Figura 1C). Esto coincide con los síntomas descritos por ^{Herron et al. (2015)}, quienes señalan que las plántulas de un año presentan caída del brote terminal y decoloración de acículas.

Por otra parte, la pudrición de raíces fue evidente, ya que fueron muy quebradizas; esto se apreció en las plantas inoculadas del S1 y S3 cuando se extrajeron del tubete. Cuando la infección fue severa, se observó micelio abundante en el cuello de la raíz y tallo, y formación de esporodoquios color blanco a naranja (Figura 1D). De un total de 480 plantas inoculadas con F. circinatum, se realizaron 424 aislamientos de los hongos asociados, dando 88 % de reaislamientos positivos del patógeno (Figuras 1E y 1F); con esta identificación se comprobaron los postulados de Koch.

El efecto de F. circinatum en P. greggii mostró un porcentaje alto de mortalidad, coincidiendo con lo argumentado por ^{García-Díaz et al. (2017)} y ^{Coutinho, Steenkamp, Mongwaketsi, Wilmont, y Wingfield (2007)} al mencionar que F. circinatum es el patógeno más importante en plántulas de pino en diferentes partes del mundo. También ^{Gordon, Swett, y Wingfield (2015)} reportan especies de Fusarium causando daños significativos en plántulas de coníferas y señalan a F. oxysporum como la más importante causando pudrición del hipocótilo en plántulas de vivero.

Incidencia de Fusarium circinatum en plántulas de Pinus greggii

Los resultados de este bioensayo indican que la mezcla y la proporción en la que se prepararon los sustratos tuvieron efecto en la incidencia de la enfermedad ocasionada por F. circinatum. La importancia de este patógeno se muestra en la Figura 2, donde se observa que hubo un efecto directo en las plántulas de P. greggii en las primeras cuatro semanas después de la inoculación del sustrato en vivero.

Figura 2 Incidencia acumulada de Fusarium circinatum inoculado en plantas de Pinus greggii creciendo en tres sustratos: S1 = turba de musgo, perlita y vermiculita; S2 = aserrín, corteza de pino y turba de musgo; S3 = corteza de pino, aserrín y turba de musgo. Todos los sustratos se formularon en proporción 60:20:20. 

Las plántulas desarrolladas en el S2 a base de aserrín presentaron menor incidencia de F. circinatum que las desarrolladas en los S1 (a base de turba de musgo) y S3 (a base de corteza de pino), sobre todo en las primeras cuatro semanas de crecimiento. En las siguientes nueve semanas, el porcentaje incrementó en forma paulatina hasta alcanzar una incidencia de 94 % en el S3 y 99 % en el S1, mientras que en el S2 fue de 78 %. Los resultados en el S1 son similares a los reportados por ^{Swett y Gordon (2015)}, quienes registraron una incidencia del 97 %, al inocular F. circinatum, aislado de pino, en plantas de maíz con sustrato a base de turba de musgo.

El S2 alcanzó una incidencia de 78 %; esto indica que el sustrato a base de aserrín puede ser una alternativa para atenuar la incidencia de la enfermedad por F. circinatum en la producción de planta en los viveros. Adicionalmente, se podrían reducir costos tal como lo señalan Aguilera et al. (2016), quienes afirman que los sustratos mezclados con aserrín y corteza de pino se usan con éxito desde 2003 en algunos viveros del centro de México.

Trichoderma harzianum como biocontrol de Fusarium circinatum

El Cuadro 2 muestra los resultados del efecto de T. harzianum sobre F. circinatum en plantas de P. greggii. En general, en cada sustrato, se encontró que los tratamientos que contenían T. harzianum (T1, T5 y T9) tuvieron niveles menores de incidencia de plantas enfermas en comparación con los tratamientos donde solo se aplicó F. circinatum (T2, T6 y T10); sin embargo, a nivel estadístico, la incidencia fue significativamente similar (P > 0.05). De acuerdo con el Cuadro 2, de todos los tratamientos, el T5 (S2+Fc+Th) a base de aserrín e inoculado con T. harzianum obtuvo la incidencia más baja (66 %), mientras que en el T2 (S1+Fc) sin T. harzianum se registró la mayor incidencia de la enfermedad (99 %). Al parecer el uso del S2 contribuyó a reducir la incidencia de la enfermedad.

Cabe señalar que solo se realizaron tres aplicaciones de T. harzianum, por lo que se sugiere aumentar el número tal como lo recomiendan ^{Mitchell, Zwolinski, Jones, y Coutinho (2004)}, quienes mencionan que las aplicaciones con T. harzianum deben continuar durante 180 días una vez que la plántula emerge. También sería importante determinar si T. harzianum es capaz de sobrevivir y mantenerse viable en los sustratos para ejercer su antagonismo; en este sentido, ^{Romero et al. (2008)} estudiaron el comportamiento de una cepa de T. harzianum en dos sustratos de uso comercial y encontraron que el sustrato a base de corteza en compost presentó mayor número de esporas por gramo de sustrato.

^{Cubillos et al. (2011)} evaluaron seis cepas del hongo F. solani (Mart.) Sacc. en el cultivo de maracuyá (Passiflora edulis fo. flavicarpa O. Deg.) y señalaron que cuando primero se aplica T. harzianum existe mejor respuesta de biocontrol (86 a 100 % de plantas sanas) que preinfectando las plántulas con el patógeno; sin embargo, también indicaron un efecto positivo cuando aplicaron primero F. solani (13 a 80 %).

^{Reglinski y Dick (2005)} señalan que la supresión de la enfermedad del damping-off fue más eficaz cuando se añadió Trichoderma al medio de crecimiento cuatro días antes de la inoculación del patógeno y que fue ineficaz cuando se añadió cuatro días después de la inoculación.

^{Mousseaux, Dumroese, James, Wenny, y Knudsen (1998)} probaron el uso de T. harzianum para control del patógeno F. oxysporum en plántulas de Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco y obtuvieron mortalidades acumuladas de 6 % en los tratamientos con T. harzianum, 70 % con F. oxysporum, 80 % en la mezcla de ambos hongos y 5 % en el testigo. Lo anterior difiere con la presente investigación, ya que los tratamientos inoculados con T. harzianum y el testigo no presentaron mortalidad. Por otra parte, ^{Martínez-Álvarez, Alves-Santos, y Diez (2012)} señalan que T. harzianum, en diluciones de 10⁷, 10⁶ y 10⁵, tuvo efecto significativo de control contra F. circinatum a nivel in vitro, pero en las plántulas de P. radiata en vivero no obtuvieron resultados satisfactorios.

Índices morfológicos de plántulas de Pinus greggii inoculadas con Trichoderma harzianum en tres sustratos

El Cuadro 3 presenta las características morfológicas e índices de calidad de planta de P. greggii a los seis meses de edad. De acuerdo con la información, las plántulas con mayor diámetro en el cuello de la raíz se obtuvieron en los tratamientos con S1 y S3 (T3, T4, T11 y T12) con valores de 3.03 mm a 3.17 mm, por lo cual se considerarían plántulas de calidad media; para obtener una calidad alta, el diámetro de la planta debió ser mayor de 4.00 mm (^{Prieto & Sáenz, 2011}). Los valores más bajos en calidad de diámetro (P ≤ 0.05) se presentaron en el T7 (S2+Th = 2.67 mm) y T8 (S2-Te = 2.61 mm) que contenían sustrato a base de aserrín de pino.

Los tratamientos con el S1 (T3 = 27.46 cm y T4 = 28.14 cm), a base de turba de musgo, permitieron mayor altura en las plántulas; de hecho, la altura fue mayor que el intervalo de 15 a 25 cm manejado por ^{Sáenz, Villaseñor, Muñoz, Rueda, y Prieto (2010)}, para considerar a una planta de alta calidad. El T8 que corresponde al sustrato a base de aserrín de pino sin inocular (S2-Te) produjo el valor más bajo en altura (17.70 cm). Los resultados coinciden con ^{Castro-Garibay, Aldrete, López-Upton, y Ordaz-Chaparro (2018)}, quienes encontraron que el sustrato a base de turba de musgo mostró los mejores crecimientos en altura y diámetro de P. greggii var. australis Donahue, Jeffrey K. & López, A. R.

Los valores de altura (a excepción de los obtenidos con el S1) y diámetro estuvieron por debajo de los mínimos establecidos (altura de 25 a 30 cm y diámetro ≥4 mm) en los criterios de la Norma Mexicana para la Certificación de la Operación de Viveros Forestales NMX-AA-170-SCFI-2016 (^{Secretaría de Economía [SE], 2016}) para P. greggii, probablemente debido al efecto sombra del invernadero y a que las plántulas requerían más tiempo en el vivero. ^{Villar (2003)} menciona que la altura de la parte aérea y el diámetro en el cuello de la raíz, junto con las características cualitativas, son atributos considerados en la calidad de planta. ^{Prieto y Sáenz (2011)} manejan el diámetro del tallo ≥4 mm y una altura de 15 a 25 cm para especies de pinos nativos de la Sierra Madre Occidental.

El peso seco aéreo también fue estadísticamente mayor (P ≤ 0.05) en los tratamientos del S1 (T3 = 1.35 g y T4 =1.42 g), mientras que el más bajo se registró en las plántulas sembradas en el S2 sin inocular (T8 = 0.78 g). En este mismo tratamiento (T8) también se registró el menor peso seco de la raíz (0.34 g). La relación parte aérea/raíz más alta se obtuvo en los tratamientos con el S1 (T3 = 3.75 g y T4 = 3.65 g). La biomasa aérea fue mayor que la biomasa subterránea, lo que ocurre comúnmente en varias especies forestales.

Los tratamientos del S1 presentaron índices de esbeltez más altos (T3 = 8.90 y T4 = 8.95) que el resto de los tratamientos, lo cual no es deseable, ya que representan un desbalance en las plantas. Lo anterior influyó en el índice de calidad de Dickson que fue menor de 0.2 en todos los tratamientos tal como se muestra en el Cuadro 3.

En general, los estándares morfológicos no tuvieron diferencias significativas (P > 0.05) en los tratamientos donde se aplicó T. harzianum con respecto a los tratamientos donde no se aplicó, lo cual coincide con ^{Donoso et al. (2008)}. En cambio, ^{Romero et al. (2008)} encontraron un efecto positivo en altura, diámetro, peso radicular y de la parte aérea cuando inocularon con T. harzianum. En cuanto a los sustratos, la mezcla a base de turba de musgo como componente principal (S1) presentó los mejores valores para todas las variables evaluadas, excepto para el índice de esbeltez (Cuadro 3). Lo anterior coincide con lo encontrado por ^{Castro-Garibay et al. (2018)} para la misma especie. Los resultados reflejan que es necesario realizar más investigación en nuestro país en el área forestal, ya que el efecto de este antagonista ha sido más estudiado en el área agrícola (^{Dumroese et al., 2012}).