Introducción

El árbol de algarrobo (Ceratonia siliqua L., Fabaceae) es una de las especies más importantes de la región mediterránea y destaca por su alta capacidad de adaptación a condiciones de estrés por sequía. La importancia económica de esta especie proviene del uso industrial de la goma extraída de sus semillas, que se usa ampliamente como aditivo natural (E-410) en la industria alimentaria como estabilizador, espesante y saborizante (^{El Bouzdoudi et al., 2017}; ^{Fadel et al., 2011}). La producción mundial de algarrobo es de aproximadamente 156 800 t·año^-1. Los principales productores son Portugal (25.46 %), Italia (18.24 %), España (16.51 %) Marruecos (13.89 %) y Turquía (8.45 %) (^{FAO, 2016}). También se introdujo con éxito en otras regiones mediterráneas como en el sur de Estados Unidos, México, Chile, Argentina y el sur de Australia (^{Benković et al., 2016}).

Los métodos tradicionales de propagación de algarrobo no han logrado satisfacer la demanda del mercado, por ello, el uso de técnicas in vitro para satisfacer la demanda alta de material vegetal parece adecuado (^{Shahzad, Akhtar, Bukhari, & Perveen, 2017}). Uno de los métodos para desarrollar un sistema reproducible para la regeneración de plántulas es mediante el callo, que también se considera el material más adecuado para embriogénesis somática, transformación genética y producción de metabolitos secundarios (^{Azeez et al., 2017}; ^{Mujib, Ali, Tonk, & Zafar, 2017}; ^{Reyes-Díaz, Arzate-Fernández, Piña-Escutia, & Vázquez-García, 2017}). La eficiencia de la inducción de callos está relacionada con material vegetal (explantes y genotipos) y la composición del medio de cultivo (composición de sal, reguladores de crecimiento de las plantas y carbohidratos). En C. siliqua como en otras especies, los explantes más utilizados para la inducción de callos son los embriones y cotiledones inmaduros (^{Canhoto, Rama, & Cruz, 2006}; ^{Custodio & Romano, 2006}); sin embargo, la obtención de este material es laboriosa y solo está disponible durante un periodo muy corto del ciclo de crecimiento de la planta. Por otra parte, la inducción de callos a partir de cotiledones de semillas maduras se ha logrado con éxito en experimentos anteriores (^{Lozzi, Abousalim, & Abdelwahd, 2015}). Este material tiene la ventaja de extraerse fácilmente y estar disponible durante todo el año. Además, los callos derivados de cotiledones provenientes de semillas maduras se consideran un material inicial adecuado de células no diferenciadas para la regeneración in vitro de plantas fértiles (^{Din et al., 2016}).

Al igual que otras plantas leñosas, el algarrobo es difícil de propagar en condiciones in vitro y hasta ahora solo se ha logrado cierto éxito. Aunque existen algunos reportes sobre la inducción de callos embrionarios en C. siliqua (^{Canhoto et al., 2006}; ^{Custodio & Romano, 2006}; ^{Ksia et al., 2008}; ^{Lozzi et al., 2015}), los estudios se han concentrado en la influencia de reguladores de crecimiento y se sabe poco sobre el efecto del genotipo, nutrientes minerales y carbohidratos en la inducción de callos en esta planta. La composición mineral del medio de cultivo es uno de los factores más importantes que rigen el crecimiento de las plantas y la morfogénesis (^{George & De Klerk, 2008}; ^{Kim, Gopal, & Sivanesan, 2017}). El medio Murashige y Skoog (MS) (^{Murashige & Skoog, 1962}), desarrollado para el crecimiento óptimo del callo del tabaco, es el más utilizado en el algarrobo y en otras plantas (^{Canhoto et al., 2006}; ^{George & de Klerk, 2008}); sin embargo, no es el óptimo para todos los tejidos vegetales (^{Varshney & Anis, 2014}). Los carbohidratos son otro componente importante para los medios de cultivo de tejidos (^{Khorsha, Alizadeh, & Mashayekhi, 2016}); la sacarosa es la fuente de carbono más utilizada, debido a su efecto altamente favorable en el crecimiento y su costo relativamente bajo (^{Sumaryono, Wirdhatul, & Ratnadewi, 2012}). Todos los estudios en algarrobo han usado sacarosa como fuente de carbono en una concentración de 81 mM; sin embargo, la concentración óptima difiere entre las especies de plantas (^{Thorpe et al., 2008}). El manitol es un alcohol de azúcar de seis carbonos de origen natural que se usa ampliamente en el cultivo de tejidos vegetales como agente osmótico, para modificar el potencial hídrico de un medio de cultivo (^{Tholakalabavi, Zwiazek & Thorpe, 1994}). Este carbohidrato se ha aplicado exitosamente en varias especies de plantas como Cucumis sativus L. (^{Lou & Kako, 1995}), Cucumis melo L. (^{Nakagawa et al., 2001}), Phoenix dactylifera L. (^{Shibli, Subaih, & Abdelrahman, 2005}) y Olea europaea L., para aumentar la eficacia de la inducción de callos y la embriogénesis somática (^{Brhadda, Walali, & Abousalim, 2008}).

En tal contexto, el objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de cinco genotipos de C. siliqua en la inducción de callos y optimizar la composición del medio de cultivo para un mejor crecimiento del callo embrionario. Esto con el fin de proporcionar información de referencia para el desarrollo de un protocolo apropiado de propagación masiva de algarrobos por embriogénesis somática. En este estudio también se consideró el análisis histológico de callos inducidos y las estructuras diferenciadas.

Materiales y métodos

Resultados

Los cotiledones maduros comenzaron a hincharse después de una semana en el medio de inducción de callos. Durante la segunda semana de cultivo, los callos comenzaron a surgir principalmente de los extremos cortados de los explantes que no estuvieron en contacto con el medio (Figura 1). Acorde con el Cuadro 2, los cinco genotipos produjeron una tasa alta de callos (75 a 100 %) y se observaron diferencias genotípicas en peso seco; los valores más altos se registraron en los callos ‘GH’, ‘GM’ y ‘GB’. Con respecto al color del callo, 'GB' produjo una mayor biomasa de color blanco cremoso (27.3 mg), mientras que los otros genotipos produjeron principalmente callos de color café cremoso. En consecuencia, el genotipo ‘GB’ fue utilizado en los experimentos posteriores. Algunos explantes de los genotipos 'GH', 'GM' y 'GB' mostraron iniciación de raíz (2 a 6.7 %), a partir de callos inducidos.

Figura 1 Inducción de callos a partir de cotiledones maduros de cinco genotipos (A = El Hoceima, B = Ouazzane, C = Merrakech, D = Azilal, E = Elksiba) de Ceratonia siliqua después de cinco semanas en medio Murashige y Skoog suplementado con 10 µM de auxina 2,4-D.  

De acuerdo con el Cuadro 3, el experimento diseñado para la comparación de medios basales mostró que los explantes fueron capaces de inducir callos en todas las composiciones de sal analizadas. Cabe destacar que solo los medios B5 y WPM permitieron el desarrollo de callos friables, pero WPM obtuvo los pesos secos más bajos para todas las concentraciones de auxina analizadas. El aumento máximo en peso seco (39.1 mg) se registró cuando se utilizó el medio B5 suplementado con 10 µM de 2,4-D, mientras que no hubo diferencias significativas con las concentraciones más bajas. Con el mismo medio, se obtuvieron callos de color blanco cremoso con 2.5 µM de 2,4-D y se observó que las concentraciones más altas de 2,4-D cambiaron el color a café. Con respecto a la inducción de la raíz, hubo interacción significativa (P ≤ 0.001) entre los medios salinos y la concentración 2,4-D. El medio MS con 2.5 µM de 2,4-D mostró la tasa más alta de inducción de la raíz (40 %), la cual disminuyó significativamente con el aumento de la concentración de 2,4-D. No se desarrollaron raíces con el medio B5.

En el experimento de combinación de carbohidratos, todos los explantes produjeron callos cuando el medio B5 se complementó con varias concentraciones de sacarosa, independientemente de la presencia de manitol (Figura 2). En contraste, no hubo inducción de callo cuando únicamente se utilizó manitol, incluso después de cinco semanas. En general, los callos formados fueron friables y de color blanco cremoso. La concentración de sacarosa afectó significativamente (P ≤ 0.05) el peso seco del callo, con el resultado más alto (38.4 mg) en presencia de 90 mM de sacarosa y en ausencia de manitol; en consecuencia, los pesos más bajos se registraron en todos los medios suplementados con manitol.

Figura 2 Efecto de las combinaciones de sacarosa y manitol en la inducción del callo de Ceratonia siliqua después de cinco semanas en medio Gamborg (B5) suplementado con 2.5 µM de auxina 2,4-D. 

Las observaciones histológicas de los callos friables de color blanco cremoso mostraron la formación de centros meristemáticos con células isodiamétricas más pequeñas que las células circundantes, con núcleo y citoplasma densamente teñido, y con división anticlinal y periclinal (Figura 3a). Después de cuatro semanas de cultivo, se observaron pequeñas masas embriogénicas y proembriones globulares en la superficie de los callos (Figura 3b). Los exámenes histológicos también mostraron el desarrollo de raíces con haces vasculares en algunos callos inducidos.

Figura 3 Observaciones microscópicas de los callos inducidos a partir de cotiledones maduros de Ceratonia siliqua. Iniciación del centro meristemático (MC) con células en división activa que tienen núcleo (N) y citoplasma densamente teñido rodeados por células altamente vacuoladas (VC). Detalle de las células en estructuras globulares (GPe) de la superficie de los callos desarrollados en los extremos cortados de los explantes. 

Discusión

Este estudio evaluó el efecto de cinco genotipos de explantes y composición del medio de cultivo (nutrientes minerales, concentraciones de 2,4-D y carbohidratos) sobre la inducción y proliferación de callos, a partir de cotiledones maduros de C. siliqua. Este material vegetal tiene la ventaja de ser fácilmente extirpado y estar disponible durante todo el año.

Los estudios informan que la proliferación de callos es genotipo dependiente. Esta dependencia se observó en Castanea sativa Mill. (^{Hoque, Biswas, & Alam, 2007}), Vigna subterranea (L.) Verdc. (^{Konaté, Koné, Kouakou, Kouadio, & Zouzou, 2013}) y Theobroma cacao L. (^{Ramírez, Vasquez, Osorio, Garcés, & Trujillo, 2018}). El efecto del genotipo también puede provocar cambios en el color, textura y potencial morfogenético de los callos, y esto podría ocurrir incluso entre variedades relacionadas de la misma especie (^{Saeed & Shahzad, 2015}; ^{Schween & Schwenkel, 2003}; ^{Shahnewaz, Bari, Siddique, & Rahman, 2004}). En los últimos años, los estudios fenotípicos y genéticos han revelado un grado alto de diversidad de vainas de algarroba y semillas recolectadas en varias áreas de Marruecos (^{El Kahkahi, Zouhair, Ait Chitt, & Errakhi, 2014}; ^{Konaté, Filali-Maltouf, & Berraho, 2007}; ^{Sidina et al., 2009}). En este estudio, se utilizaron cinco regiones de Marruecos como fuentes de explantes cotiledonares. Todos los genotipos comparados mostraron niveles altos de inducción de callo (75 a 100 %); sin embargo, la morfología varió ampliamente. La divergencia podría atribuirse a la diferencia en la concentración de hormonas endógenas en los genotipos (^{Han, Jin, Wu, & Zhang, 2011}; ^{Salehi & Khosh-Khui, 2005}).

La composición de sal del medio de cultivo es otro factor importante que influye en la inducción y proliferación de callos (^{George & de Klerk, 2008}). En este estudio, todos los medios basales pudieron producir callos a partir de explantes de cotiledones maduros de algarroba. El peso seco de los callos presentó diferencias significativas, obteniendo los resultados más altos con el medio B5. El medio WPM, que produjo la menor cantidad de callos, tiene una composición escasa de sal con un contenido más bajo de nitrógeno, potasio y cloruro; también tiene una cantidad iónica total más baja en comparación con los otros medios. En particular, los callos friables se obtuvieron solo con B5 y WPM. El desarrollo de esta morfología del callo podría deberse a la baja concentración de nitrógeno en dichos medios. Al igual que en el presente trabajo, los callos de Barringtonia racemosa (L.) Spreng. fueron friables en WPM y B5, y compactos en el medio MS (^{Behbahani, Shanehsazzadeh, & Hessami, 2011}). En el medio B5, el aumento de la concentración de auxina 2,4-D (2.5 a 10 µM) mejoró el peso seco del callo. Cabe destacar que los callos de color blanco cremoso se obtuvieron en la concentración más baja, mientras que los ligeramente cafés se observaron en la concentración más alta. La interacción entre los medios salinos y la concentración 2,4-D fue significativa en el caso de la inducción de raíz. El medio basal MS complementado con 2.5 µM de 2,4-D mostró la tasa más alta. El porcentaje de raíces inducidas disminuyó a medida que la concentración de la auxina aumentaba. Una concentración alta de 2,4-D (10 µM) inhibió el crecimiento de las raíces en todos los medios evaluados. Esto podría explicarse por el hecho de que la auxina sintética a alta concentración puede producir efectos herbicidas que podrían bloquear el inicio adventicio de la raíz (^{Evans, Coleman, & Kearns, 2003}).

En el presente estudio, el crecimiento de los callos también se vio afectado por las concentraciones de sacarosa y manitol. El medio B5 suplementado con 90 mM de sacarosa produjo la mayor cantidad de callos. Las concentraciones más altas de sacarosa parecen reducir la proliferación de callos, lo que puede explicarse por una disminución en el potencial osmótico del medio (^{Lipavská & Vreugdenhil, 1996}). En un estudio similar realizado en O. europaea, la inducción del callo incrementó cuando la concentración de sacarosa aumentó de 54 a 243 mM (^{Brhadda et al., 2008}). En contraste, la sacarosa a 43.8 mM produjo la mayor cantidad de callos en Aquilaria malaccensis Lam., mientras que un nivel más alto de sacarosa generó resultados más bajos (^{Jayaraman, Daud, Halis, & Mohamed, 2014}). La adición de manitol al medio que contenía sacarosa redujo el peso seco del callo, mientras que no hubo inducción de callo en la sola presencia de manitol. Esta disminución podría ser causada por una contribución osmótica excesiva (^{Thorpe et al., 2008}). En los experimentos desarrollados en este estudio, el uso de manitol con sacarosa arrojó resultados bajos en comparación con el uso de sacarosa sola en el medio de cultivo. Se obtuvieron resultados similares con el callo de Vitis vinifera L. (^{Yancheva & Roichev, 2005}); sin embargo, cuando el manitol se usó como única fuente de hidratos de carbono no hubo inducción, lo que indica que la sacarosa es esencial para la inducción del callo en C. siliqua. La incapacidad de los cultivos de algarroba para usar este alcohol de azúcar podría atribuirse a la inhibición de la absorción de estos carbohidratos o a la ausencia de genes que codifican enzimas involucradas en el catabolismo del poliol en C. siliqua (^{Steinitz, 1999}).

Los callos inducidos en B5, evaluados mediante el análisis histológico, mostraron centros activos con características embriogénicas. A diferencia de las células no embriogénicas que son grandes, alargadas y vacuoladas, las células embriogénicas son generalmente pequeñas, isodiamétricas y densamente llenas de citoplasma (^{Brhadda, Walali & Abousalim, 2007}; ^{Kumar, Suri, Sonie, & Ramawat, 2003}). Después de cuatro semanas, estas células meristemáticas se transformaron en masas embriogénicas y proembriones globulares.

Conclusiones

Este estudio confirma el alto potencial de los cotiledones maduros de Ceratonia siliqua para la inducción y proliferación de callos embrionarios. La expresión del potencial está influenciada por el genotipo, la concentración 2,4-D, la composición de sal del medio basal y los carbohidratos. El callo obtenido mostró color y textura variada. La investigación histológica de los callos inducidos mostró centros activos con características embriogénicas. Este estudio es el primer paso hacia el establecimiento de un protocolo eficiente para la propagación de algarrobo en masa, mediante embriogénesis somática y formación de brotes, a partir de cotiledones maduros. Se están considerando estudios adicionales que incluyan factores críticos para mejorar la transición de proembriones a embriones somáticos y la posterior regeneración de la planta.