Colonización de los hongos micorrízicos arbusculares a los 105 días después de la siembra

El Cuadro 1 muestra los resultados de colonización y desarrollo de estructuras de los HMA en P. dulce. A los 105 dds, R. manihotis colonizó 80.36 % de las raíces y desarrolló 79.40 % de hifas y 47.60 % de arbúsculos; F. mosseae colonizó 61.38 % y generó 61.05 % de hifas y 31.57 % de arbúsculos; mientras que S. heterogama tuvo aproximadamente el mismo porcentaje de colonización, hifas y arbúsculos (59 %). El análisis de varianza detectó diferencias significativas (P < 0.05) entre al menos un par de medias de los tratamientos inoculados al estimar las variables mencionadas anteriormente, siendo R. manihotis (T₁) quien produjo mayor porcentaje de colonización e hifas. La producción de arbúsculos y vesículas fue estadísticamente similar (P > 0.05) en R. manihotis y S. heterogama. Rhizophagus manihotis y F. mosseae tuvieron 18.91 y 15.95 % de vesículas intrarradicales, respectivamente. Cabe destacar que S. heterogama no las produce (^{González & Cuenca, 2008}). Las vesículas son indicativos de la finalización del desarrollo del hongo micorrízico al colonizar las raíces (^{Bonfante & Genre, 2012}), de manera que se infiere que R. manihotis y F. mosseae se mantuvieron creciendo activamente.

El mayor porcentaje de colonización correspondió al tratamiento donde se inoculó R. manihotis (80.36 %). En el caso de F. mosseae y S. heterogama, aunque fueron inferiores a los de T1 (61.38 y 59.58 %, respectivamente), superaron el valor señalado por ^{Habte, Fox, Aziz, y El-Swaify (1988)} para L. leucochepala ‘K8’, inoculada con Glomus agregatum N. C. Schenck & G. S. Sm. (30 % de colonización). Lo planteado permite inferir que las esporas utilizadas en los ensayos tuvieron condiciones adecuadas para la germinación y, tal cual lo señalaron dichos autores, los hongos se comportaron como buenos colonizadores. Los resultados demostraron la afinidad entre los HMA y P. dulce, especie perteneciente a las fabáceas, lo cual coincidió con los resultados obtenidos por ^{Patreze y Cordeiro (2005)}, quienes indicaron 24.72, 42.25 y 15.35 % de colonización de hongos micorrízicos nativos en Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong, Inga laurina (Sw.) Willd. y Platypodium elegans Vogel, respectivamente. Los valores superiores a 50 % de colonización, en relaciones micorrízicas, favorecen la sucesión ecológica y nivel de sobrevivencia, tal cual lo señalan ^{Kumar, Raghuwanshi, y Upadhyay (2003)} en Acacia auriculiformis A. Cunn. ex Benth., A. catechu (Willd.) Wight & Arn., A. procera (Roxb.) Willd., A. nilotica (L.) Delile, Albizia lebbeck (L.) Benth., Prosopis juliflora (SW) DC., Pongamia pinnata (L.) Pierre, Dalbergia sissoo Roxb. ex DC. y Tamarindus indica (L.), especies de la familia Fabaceae.

Con respecto al porcentaje de arbúsculos, la fluctuación entre los tratamientos con R. manihotis, F. mosseae y S. heterogama en P. dulce se justifica, ya que estas estructuras son de vida corta, con ocurrencia estacional y de formación sensible a la variación de los factores ambientales y metabolismo fisiológico de la planta hospedante (^{Alexander, Meier, Toth, & Weber, 1988}).

Por otra parte, el bajo porcentaje de vesículas determinado en este estudio (18.95 y 15.95 % para R. manihotis y F. mosseae, respectivamente) se explica por el hecho de que la formación de estas estructuras de almacenamiento depende del tipo de hongo micorrízico, de su desarrollo dentro de la raíz y de los factores ambientales (^{Hawley & Dames, 2004}; ^{Kumar et al., 2003}).

Anatomía de la colonización de los hongos micorrízicos arbusculares

La Figura 1 ilustra la colonización de los hongos micorrízicos arbusculares R. manihotis (A y E), S. heterogama (B y G) y F. mosseae (C, D y F). La colonización en P. dulce se evidenció en las raíces terminales, manteniéndose la integridad de las células corticales. Las hifas formaron hifopodios engrosados, los cuales fueron el medio de penetración a través o entre las células rizodérmicas (Figura 1B). Estas observaciones coincidieron con las descritas por ^{Garriock, Petersonm, y Ackerley (1989}), quienes consideraron que dichas estructuras son similares a las de los hongos patogénicos. Las hifas inter e intracelulares se desarrollaron desde los puntos de penetración (Figuras 1B y 1D) en sentidos de dirección circunferencial y longitudinal, recorriendo el parénquima cortical, sin llegar al cilindro vascular (Figuras 1F y 1G).

Figura 1 Colonización de los hongos micorrízicos arbusculares Rhizopagus manihotis (A y E), Scutellospora heterogama (B y G) y Funneliformis mosseae (C, D y F) en aclarados (A, B, C, D y E) y secciones transversales (F y G) de raíces de Pithecellobium dulce; donde se pueden observar rizodermis (ri), corteza (c), cilindro vascular (cv), hifa extrarradical (he), hifopodio (ap), hifa intrarradical (hi), rulo intracelular (r), exodermis (ex), endodermis (en), arbúsculo (a) y tronco o base del arbúsculo (ta). 

De acuerdo con el desarrollo del micelio intrarradical, el comportamiento morfológico observado en P. dulce fue intermedio entre el tipo Arum (Figuras 1A, 1B y 1F) y Paris (Figuras 1C y 1D). Durante la primera fase de colonización, el segundo tipo morfológico fue predominante en sentido circunferencial, ya que el simbionte fúngico se propagó en el parénquima cortical por medio de hifas intracelulares de grosor considerable (Figura 1F); posteriormente, se formaron arbúsculos como estructuras terminales dentro de las células, además de espirales o rulos intercelulares (Figura 1C). Las interfases arbusculares en los tipos Arum y Paris fueron similares. En los arbúsculos se pudo distinguir el tronco o base, mientras que las terminaciones de los extremos se dividieron dicotómicamente (Figura 1E). Estos resultados coincidieron con los reportados por ^{Shi, Chen, Feng, Liu, y Christie (2006)} en especies de Meliaceae, y con los de ^{Armstrong y Peterson (2002)} en Panax quinquefolius L. Aunque la función de las hifas enrolladas en el tipo morfológico Paris aún es incierta, ^{Cavagnaro, Smith, Ayling, y Smith (2003)} afirmaron que estas proveen un área interfacial tan amplia como los arbúsculos, lo cual podría estar relacionado con la transferencia de nutrientes en especies vegetales tolerantes a estrés ambiental y de crecimiento lento. Por su parte, ^{Hawley y Dames (2004)} consideraron que el hospedante podría determinar el tipo morfológico dominante, indicando que las diferentes estructuras no son más que adaptaciones para la sobrevivencia del hongo.

Colonización de los hongos micorrízicos arbusculares a los 105 días después de la siembra

El Cuadro 2 presenta los resultados de la colonización de R. manihotis, F. mosseae y S. heterogama en P. diadelphum a los 105 dds. La colonización de los tres HMA fue mayor de 90 %, siendo estadísticamente similar (P > 0.05). El porcentaje de hifas, arbúsculos y vesículas también fue similar en los tres tratamientos.

La interacción e intercambio bidireccional entre la planta y el hongo micorrízico se evidenciaron con un porcentaje de arbúsculos satisfactorio en cada tratamiento. El valor más bajo fue de 69.7 % en F. mosseae, mientras que el máximo correspondió a R. manihotis (85.7 %); los tres tratamientos fueron estadísticamente similares (P > 0.05). La importancia de la presencia de arbúsculos radica en que estas estructuras participan directamente en el transporte de compuestos necesarios para el desarrollo de la planta y el hongo (^{Ortas, 2009}).

Los porcentajes de vesículas intrarradicales fueron 85.7 y 12.2 para R. manihotis y F. mosseae, respectivamente. Estos valores permitieron inferir que la interacción entre P. diadelphum y los inóculos utilizados si se llevó a cabo, ya que la colonización fue mayor de 90 %. A pesar de los márgenes de diferencia de los valores, el análisis de varianza (P < 0.05) no detectó diferencias significativas entre las variables evaluadas. Los valores bajos se deben a que las vesículas se forman con la finalidad de almacenar sustancias de reservas, por lo que son menos percibidas hasta que el hongo se encuentra totalmente establecido.

Los resultados demostraron que el nivel de asociación de P. diadelphum con R. manihotis, F. mosseae y S. heterogama es alto, considerando las categorías de clasificación propuestas por ^{Kumar et al. (2003)}.

La relación micorrízica de P. diadelphum concuerda con lo expresado por ^{Saslis-Lagoudakis, Chase, Robinson, Russell, y Klitgaard (2008)}, quienes determinaron que el éxito en el establecimiento de Platymiscium se debe al desarrollo de estrategias para optimizar su desarrollo y adaptación en biomas secos, a su vez ^{Smith y Smith (1997)} indicaron la existencia de una simbiosis micorrízica en las leguminosas de la subfamilia Papilionoideae.

Para los individuos de la familia Fabaceae se han reportado porcentajes altos de colonización por hongos micorrízicos. En este mismo sentido, en un estudio realizado en seis familias de angiospermas, Fabaceae ocupó el tercer lugar en colonización con valores superiores de 50 % (^{Ali, Mubassara, Rahman, Alam, & Khan, 2008}). Del mismo modo, ^{Rey, Chamorro, y Ramírez (2005)} determinaron colonización superior de 60 % cuando emplearon la doble inoculación con cepas de rizobios en Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit, mientras que ^{Ingleby, Wilson, y Munro (2007)} señalaron que las fabáceas de porte arbóreo Senna siamea (Lam.) H. S. Irwin & Barneby, Gliricidia sepium (Jacq.) Kunth ex Walp. y Calliandra calothyrsus Meisn. son altamente dependientes de las micorrizas y, por consiguiente, responden satisfactoriamente a la inoculación. Por su parte, ^{Sylvia, Alagely, Kent, y Mecklenburg (1998)} determinaron que las plantas que crecen en contenedores presentan mayor porcentaje de colonización que aquellas que crecen en espacios abiertos, tal como lo observaron en Acacia farnesiana (L.) Willd.

Los porcentajes de arbúsculos en P. diadelphum fueron elevados, correspondiendo con las categorías de moderada a muy altas de acuerdo con ^{Kumar et al. (2003)}, a pesar de que estas estructuras son consideradas de corta vida (^{Alexander et al., 1988}). Caso contrario ocurrió con las vesículas; la ausencia de estas se atribuyó a que el hongo se encuentra en una fase activa de desarrollo (^{Hawley & Dames, 2004}).

La inoculación con HMA causó resultados satisfactorios; sin embargo, no hubo prevalencia constante de un hongo micorrízico sobre otro, aunque los porcentajes de colonización hayan sido elevados. Este resultado permite inferir que una planta hospedante puede interrelacionarse con diversos HMA, respuesta que puede medirse a través de los efectos en la sobrevivencia y diversidad de especies vegetales en un ecosistema (^{Scotti & Corrêa, 2004}). Es necesario considerar los factores extrínsecos de la planta (^{Jansa, Smith, & Smith, 2008}), ya que la cuantificación de estructuras del hongo dentro de la raíz es variable.

Cada especie fúngica tiene características potenciales para establecer las simbiosis, tal es el caso de las especies de Gigasporaceae que son lentas para colonizar, pero sus hifas alcanzan mayor extensión en el suelo durante la germinación de la espora y posterior a este periodo (^{Matekwor, Andoh, & Nonaka, 2007}). La dinámica de crecimiento y desarrollo de la planta hospedante y del hongo micorrízico regula simultáneamente el intercambio bidireccional; por tanto, la sincronización depende de diversos factores que definen la complejidad de la relación (van del Heijden & Scheublin, 2007).

Anatomía de la colonización

La Figura 2 ilustra la colonización de los hongos micorrízicos arbusculares S. heterogama (A y C), R. manihotis (B y H) y F. mosseae (D, E, F y G). En las secciones longitudinales y transversales de raíces de P. diadelphum se observó un gran volumen de hifas delgadas, transparentes y cenocíticas, rodeando las raíces terminales (Figura 2A).

Figura 2 Colonización de los hongos micorrízicos arbusculares Scutellospora heterogama (A y C), Rhizopagus manihotis (B y H) y Funneliformis mosseae (D, E, F y G) en aclarado (A, B, C, D, E y F) y secciones transversales (G y H) de raíces de Platymiscium diadelphum; donde se pueden observar rizodermis (ri), exodermis (ex), corteza (c), hifa extrarradical (he), hifa intrarradical (hi), arbúsculo (a), espora intrarradical (ei) y tubo germinativo (tg) y tronco o base del arbúsculo (ta). 

En las raíces se evidenció la presencia de esporas e hifopodios en la rizodermis, los cuales iniciaron la colonización intrarradical (Figuras 2C, 2E y 2F); posteriormente, las hifas se ramificaron extendiéndose desde la exodermis hasta la región del cilindro central (Figura 2H). ^{Sbrana y Giovannetti (2005)} y ^{Zhu et al. (2006)} afirmaron que la germinación de la espora y la formación de hifopodios representan el principal evento morfogenético específico, cuya diferenciación es mediada por señales desconocidas, lo que probablemente incluya las químicas y mecánicas sensitivas, propias del tipo de hifa.

Durante la colonización intrarradical en P. diadelphum, las hifas de los HMA presentaron patrones de desarrollo correspondientes a tipos intermedios entre el Paris (Figuras 2D y 2G) y Arum (Figura 2H). La colonización se extendió de una célula a otra y se formaron espirales para originar rulos intercelulares (Figuras 2D y 2G); estas características correspondieron al tipo Paris. El desarrollo de las hifas se extendió en sentido longitudinal intercelularmente y a nivel de la corteza. Las hifas formaron, en ciertos intervalos, ramificaciones laterales que penetraron la pared celular; se ramificaron dicotómicamente originando arbúsculos (Figura 2C); y, a pesar del ciclo de vida tan efímero, siguieron el patrón establecido para el tipo morfológico Arum. La interfase arbuscular fue similar en los tipos morfológicos Arum y Paris.

A juicio de ^{Armstrong y Peterson (2002)}, las hifas enrolladas del tipo Paris interactúan con el citoesqueleto y están separadas del citoplasma de las células del hospedante por una matriz interfacial, formada en el compartimiento apoplástico, mostrando esta similaridad con la micorriza tipo Arum. Cabe destacar que la interfase de las hifas intercelulares contribuye de forma significativa en la liberación de fósforo a las células hospedantes.

Al parecer, la expresión de uno u otro desarrollo morfológico del HMA está fuertemente controlado por la planta hospedante (^{Matekwor et al., 2007}). ^{Urcelay, Tecco, y Chiarini (2005)} afirmaron que los tipos intermedios entre Arum y Paris presentan características formadas por las mismas especies de HMA y que la formación de estructuras micorrízicas en las raíces está determinada por la interacción de las especies de plantas y hongos involucrados. El tipo intermedio de desarrollo morfológico del HMA observado en P. diadelphum coincidió con lo reportado por ^{Smith y Smith (1997)} para Fabaceae. Por su parte, ^{Cavagnaro et al. (2003)} consideraron que este es el comportamiento morfológico más común.

La asociación tipo Paris ha sido determinada con mayor frecuencia en árboles y plantas de ecosistemas semiáridos (^{Yamato & Iwasaki, 2002}), característica presente en P. diadelphum.