Aislamientos de Trichoderma

Cincuenta aislamientos de Trichoderma, agrupados en nueve especies, fueron caracterizados en el presente trabajo (Cuadro 1). Estos aislamientos se obtuvieron de la rizósfera de T. cacao como parte de un estudio de diversidad de Trichoderma en el agroecosistema cacao del estado de Tabasco, México, los cuales fueron confirmados a especie mediante morfología y secuencias ITS (^{Torres-de la Cruz et al., 2015}). Actualmente, estos aislados forman parte de la colección de Trichoderma de la División Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. El aislamiento de M. roreri fue proporcionado por el Laboratorio de Fitopatología del Colegio de Postgraduados Campus Tabasco, previamente identificado por morfología y secuencia ITS (número de acceso GenBank: GU108605). Todos los aislamientos se conservaron y multiplicaron en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA).

Micoparasitismo de Trichoderma sobre M. roreri

La habilidad micoparasítica de los aislamientos de Trichoderma sobre M. roreri se evaluó según el método de cajas de Petri precolonizadas (^{Evans, Holmes, & Thomas, 2003}). Un fragmento de 5 mm de diámetro se obtuvo de colonias de M. roreri de 10 d de edad y se colocó cerca del borde de una caja de Petri de 9 cm de diámetro con medio PDA. Las cajas de Petri con medio inoculado se incubaron durante 37 d a 25 ± 1 °C en oscuridad. Posteriormente, un fragmento de inóculo de Trichoderma de 0.5 x 2.5 cm, obtenido del borde de una colonia de 4 d de edad, se sembró en el lado opuesto del inóculo de M. roreri. Las cajas precolonizadas por M. roreri e inoculadas con Trichoderma se incubaron durante 15 d bajo las mismas condiciones señaladas para la precolonización. Cinco repeticiones por aislamiento y cinco del tratamiento testigo fueron establecidos. El testigo consistió de cajas precolonizadas por M. roreri sin la inoculación de Trichoderma.

Después de la incubación, 10 muestras de 0.5 mm de diámetro se extrajeron iniciando del inóculo de M. roreri en dirección al inóculo de Trichoderma. Las muestras se sembraron en cajas de Petri con medio PDA e incubaron a 25 ± 1 °C bajo oscuridad. Las muestras se observaron durante 7 d para detectar la presencia del micoparásito (Trichoderma) o fitopatógeno (M. roreri) y evaluar el porcentaje de micoparasitismo con la siguiente fórmula:

PP = (CT x 100) / N

Antibiosis de Trichoderma sobre M. roreri

La antibiosis de los aislamientos de Trichoderma sobre M. roreri se evaluó sobre cultivos pareados de acuerdo con ^{Holmes, Schroers, Thomas, Evans, y Samuels (2004)}. La antibiosis se calculó por el porcentaje de reducción del crecimiento radial de M roreri. Para ello, un fragmento de 5 mm de diámetro de M. roreri de 10 d de edad se colocó en la periferia de una caja de Petri con medio PDA. Las cajas inoculadas se incubaron en oscuridad durante 7 d a 25 ± 1 °C, para establecer la colonia. Posteriormente, la colonia de M. roreri fue confrontada con el micoparásito, para lo cual, un fragmento de 5 mm de diámetro de Trichoderma de 4 d de edad se sembró en el lado opuesto a M. roreri. Todas las cajas se incubaron a 25 ± 1 °C en oscuridad, se establecieron cinco repeticiones por aislamiento y testigo. El tratamiento testigo consistió en colonias de M. roreri sin confrontación con Trichoderma. El crecimiento radial se registró diariamente hasta que uno de los aislamientos tuviera contacto micelial con M. roreri. El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial fue determinado por la fórmula de ^{Abbott (1925)}:

PA = [(CR - CRT) / CR] x 100

Antagonismo potencial de Trichoderma sobre M. roreri

El antagonismo potencial de los aislamientos de Trichoderma sobre M. roreri fue obtenido mediante la fórmula:

AP = (MP + PA) / 2

Crecimiento micelial de Trichoderma

El crecimiento micelial se evaluó de acuerdo con ^{Dimbi, Maniania, Lux, y Mueke (2004)}. Un fragmento de 5 mm de diámetro se obtuvo del borde de colonias de Trichoderma de 4 d de edad y se colocó en el centro de una caja de Petri con medio PDA. Las cajas se incubaron a 25, 30 y 35 °C (las tres temperaturas con ± 1 °C) con fotoperiodo de 12 h luz y 12 h oscuridad; cinco repeticiones por aislamiento y temperatura se establecieron. El radio del crecimiento micelial se registró cada 12 h; la prueba finalizó hasta que una de las colonias llenó la caja de Petri. Las medidas del último registro se utilizaron en el análisis estadístico. El crecimiento radial (r) se transformó en área de crecimiento (A, cm²) con la fórmula A = πr². El área correspondiente a cada mm de crecimiento radial se expresó en porcentaje. Así, el efecto de la temperatura sobre el crecimiento micelial se evaluó mediante el porcentaje de inhibición e incremento del área, al pasar de 25 a 30 °C y de 25 a 35 °C:

Producción de conidios de Trichoderma

A partir de cultivos de Trichoderma de 4 d de edad, un fragmento de 5 mm de diámetro se sembró en cajas de Petri con medio PDA. El fragmento inoculado se incubó a 25, 30 y 35 °C (las tres temperaturas con ± 1 °C), con un fotoperiodo de 12 h luz y 12 h oscuridad durante 16 d. Cinco repeticiones por aislamiento y temperatura fueron establecidas. Los conidios se cosecharon de la superficie del cultivo y el conteo se realizó en una cámara de Neubauer (Hausser Scientific, USA). La concentración de conidios·mL^-1 se estimó mediante la fórmula siguiente:

C = (Cc) (4 x 10⁶) (Fd / 80)

El efecto de la temperatura sobre la producción de conidios se evaluó de la misma manera a lo indicado en crecimiento micelial.

Análisis estadístico

Los datos de micoparasitismo, antibiosis, antagonismo potencial, crecimiento micelial y producción de conidios se analizaron bajo un diseño completamente al azar. El micoparasitismo, la antibiosis y el antagonismo potencial consistieron de 50 tratamientos (cada uno de los aislamientos evaluados). El crecimiento micelial y la producción de conidios constaron de 40 tratamientos, debido a que se descartaron los aislamientos que no mostraron micoparasitismo y que tuvieron los valores más bajos de AP. Previo al análisis, los datos de micoparasitismo, antibiosis y antagonismo potencial se transformaron al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción, y los datos de crecimiento micelial y producción de conidios se transformaron a log (x+1). Los datos se sometieron a un ANOVA y prueba de separación de medias de Tukey (P < 0.05) mediante SAS® (^{Statistical Analysis System [SAS], 1998}).

Micoparasitismo de Trichoderma sobre M. roreri

El Cuadro 2 presenta el porcentaje de micoparasitismo de los 50 aislamientos nativos de Trichoderma evaluados sobre M. roreri. Los aislamientos mostraron diferencias significativas (P = 0.0001) y el porcentaje osciló de 0 a 100 %. Nueve aislamientos alcanzaron 100 % de micoparasitismo a los 15 d de incubación y 10 aislamientos no mostraron dicha característica. Los aislamientos con micoparasitismo sobre M. roreri pertenecen a las especies T. harzianum (Rifai), T. virens (Mill, Giddens & Foster) Arx, T. spirale (Bissett), T. brevicompactum (Kraus, Kubicek & Gams), T. koningiopsis (Samuels, Suárez & Evans) y T. asperellum (Samuels, Lieckf & Nirenberg). Se puede hipotetizar que estas especies producen una matriz de enzimas que permiten parasitar a M. roreri. Al respecto, el micoparasitismo de aislamientos de T. harzianum, T virens, T. asperellum y T. koningiopsis sobre M. roreri se ha reportado por ^{Evans et al. (2003)} y ^{Krauss et al. (2006)}; mientras que el micoparasitismo de T. brevicompactum y T. spirale se documenta Duque, y Orduz (2008), quienes indican que los aislamientos de una misma especie pueden actúar de diferente manera.

Los aislamientos que no mostraron parasitismo sobre M. roreri corresponden a T. pleuroticola (Yu & Park), T. longibrachiatum (Rifai) y T. reesei (Simmons). Lo anterior coincide con ^{Garcia-Simoes, Tauk-Tornisielo, Rocha- Niella, y Tapia-Tapia (2012)}, quienes evaluaron dichas especies sin encontrar parasitismo sobre M. perniciosa (Stahel) Aime y Phillips-Mora, especie emparentada con M. roreri. Trichoderma pleuroticola también ha sido reportada como patógeno de hongos comestibles (^{Sobieralski et al., 2012}). La ausencia de micoparasitismo de estas especies sugiere que M. roreri no se encuentra en el grupo de hospederos.

Antibiosis de Trichoderma sobre M. roreri

El Cuadro 3 presenta los resultados de la prueba de antibiosis de Trichoderma sobre M. roreri. Todos los por primera vez. En este estudio, el parasitismo de aislamientos de una misma especie fue variable, lo cual concuerda con Hoyos-Carvajal, aislamientos mostraron antibiosis con diferencias significativas entre ellos (P = 0.0001). El porcentaje de antibiosis fluctuó de 6.8 % a 55.5 %; los valores más altos (40-55.5 %) se obtuvieron con algunos aislamientos de T. asperellum (TCC051 y TCC024) T. koningiopsis (TCC084, TCC020 y TCC063), T. pleuroticola (TCC002), T. virens (TCC021) y T. harzianum (TCC056, TCC077 y TCC115). La acción antibiótica de los aislamientos de T. harzianum también ha sido descrita sobre el crecimiento micelial de M. roreri y M. perniciosa (^{Bailey et al., 2008}).

Los aislamientos de T. longibrachiatum, T. reesei y T. pleuroticola mostraron antibiosis sobre M. roreri (Cuadro 3), aunque no presentaron micoparasitismo (Cuadro 2). La presencia de antibiosis sin micoparasitismo sugiere que los aislamientos poseen metabolitos con actividad antifúngica, o bien que no permiten el crecimiento del patógeno, debido a los mecanismos de competencia por espacio y nutrientes (^{García-Simoes et al., 2012}).

Antagonismo potencial de Trichoderma sobre M. roreri

El Cuadro 4 muestra que hubo diferencias significativas (P = 0.0001) en el antagonismo potencial de Trichoderma sobre M. roreri; el porcentaje osciló de 6.8 a 68.8 %. Al evaluar el antagonismo potencial como la sumatoria de micoparasitismo y antibiosis actuando sinérgicamente, se observó que algunos aislamientos de T. virens (TTC017, TTC058 y TTC015), T. harzianum (TTC062 y TTC090) y T. spirale (TTC004) mostraron los valores más altos, mientras que los porcentajes más bajos se obtuvieron con los aislamientos que no mostraron micoparasitismo. De acuerdo con ^{Monte (2001)}, la combinación de parasitismo y antibiosis puede resultar en niveles antagónicos importantes.

Crecimiento micelial de Trichoderma

El análisis estadístico mostró diferencias significativas (P = 0.0001) en el crecimiento micelial de los aislamientos de Trichoderma en cada temperatura evaluada. Los resultados se presentan en el Cuadro 5. A 25 °C, el crecimiento micelial osciló entre 21 y 40 mm. Las cepas TTC063 y TTC084 de T. koningiopsis, y TTC021 y TCC017 de T. virens obtuvieron el mayor crecimiento a las 60 h. A 30 °C, el crecimiento micelial fluctuó entre 18.3 y 40 mm; las cepas TCC021, TCC017, TCC102 y TCC104 de T. virens, TCC084 de T. koningiopsis, y TCC100, TCC073 y TCC090 de T. harzianum expresaron el mayor crecimiento. Al pasar de 25 a 30 °C, 30 de 40 aislamientos incrementaron su crecimiento y tres lo mantuvieron (TTC021, TTC084 y TTC017). La Figura 1 muestra la comparación gráfica de los cambios ocurridos en el crecimiento micelial de los aislamientos de Trichoderma ante los cambios de temperatura. A 35 °C, el crecimiento micelial fluctuó de 2.1 a 29 mm y la cepa TCC017 (T. virens) presentó el mayor crecimiento. A esta temperatura, todos los aislamientos disminuyeron el crecimiento micelial respecto al obtenido a 25 y 30 °C; la inhibición fluctuó de 23 hasta 99.5 % (Figura 1).

Figura 1 Cambios de inhibición o incremento del crecimiento micelial de los aislamientos nativos de Trichoderma al pasar de 25 a 30 °C y de 25 a 35 °C. 

Todos los aislamientos crecieron en las tres temperaturas evaluadas; sin embargo, el rango de temperaturas favorables para 82 % de los aislamientos fue de 25 a 30 °C. Al respecto, ^{Jalil, Norero, y Apablaza (1997)} reportaron que la temperatura óptima para T. harzianum es de 27 °C. El crecimiento notable de todas las cepas en un intervalo de 25 a 35 °C sugiere adaptabilidad a las temperaturas altas donde el cacao se desarrolla.

Producción de conidios de Trichoderma

El análisis estadístico mostró diferencias significativas (P = 0.0001) en la producción de conidios de los aislamientos de Trichoderma en cada temperatura evaluada (Cuadro 6). A 25 °C, la producción fluctuó de 1.4 x 10⁷ a 3.1 x 10⁹ conidios·mL^-1. Las cepas con mayor producción fueron TTC063 y TTC051 de las especies T. koningiopsis y T. asperellum, respectivamente. A 30 °C, la producción de conidios osciló entre 0.05 x 10⁸ y 2.6 x 10⁹ conidios·mL^-1; las cepas TTC102 y TTC017 de T. virens, y TTC115 de T. harzianum presentaron la mayor producción. A esta temperatura, 65 % de los aislamientos incrementaron la producción de conidios con relación a la producción obtenida a 25 °C (Figura 2). A 35 °C, la producción de conidios osciló entre 0 y 3.9 x 10⁸ conidios·mL^-1. Los aislamientos TTC084 (T. koningiopsis), TTC104 y TTC016 (T. virens) mostraron la mayor producción. A esta temperatura, 97.5 % de los aislamientos disminuyeron la producción de conidios, respecto a la obtenida a 25 y 30 °C; seis aislamientos mostraron inhibición total (Figura 2). La inhibición fluctuó de 12.3 hasta 100 %. Solo el aislamiento TTC104 (T. virens) incrementó la producción de conidios, respecto a los valores obtenidos a 25 y 30 °C.

Figura 2 Cambios de inhibición o incremento en la producción de conidios de aislamientos nativos de Trichoderma al pasar de 25 a 30 °C y de 25 a 35 °C. 

Dado que las esporas son las estructuras activas de los hongos agentes de biocontrol, la producción de conidios es una característica importante en la selección de aislamientos promisorios (^{Vélez-Arango, Estrada-Valencia, González-García, Valderrama- Fonseca, & Bustillo-Pardey, 2001}). Al respecto, 85 % de los aislamientos produjeron conidios en el intervalo de 25 a 35 °C (Cuadro 6), lo cual puede ser explicado por el origen tropical de los aislamientos; sin embargo, el rango de temperatura favorable para la producción fue de 25 a 30 °C. Los aislamientos con mayor producción de conidios en el rango de temperaturas evaluadas fueron: TTC063 (T. koningiopsis); TTC051, TTC001, TTC035 (T. asperellum); TTC102 (T. virens); y TTC115 (T. harzianum), con una producción superior de 1 x 10⁹ conidios·mL^-1.