El encino como infusión de hierbas para la producción de té Kombucha

Se ha estudiado la aceptabilidad de infusiones de hierbas de diferentes especies de Quercus, encontrando que las hojas de encino con mayor contenido fenólico (3 a 13 mg·g^-1) tienen menor aceptabilidad (^{Rocha- Guzmán et al., 2012}), tal es el caso del té de hierbas de Q. resinosa, que a pesar de su contenido fenólico saludable comprobado, no es aceptado totalmente por toda la gente. Esto se debe al fenómeno de astringencia, donde los polifenoles presentes unen las proteínas ricas en prolina de la saliva en la boca, dando lugar a un precipitado insoluble. Este estímulo también afecta las propiedades reológicas de la saliva, dando lugar a la fricción y la reducción de la lubricidad. ^{Vázquez-Cabral et al. (2014)} utilizaron el microbioma Kombucha (té de hongo chino) para fermentar las infusiones de hojas de encino, lo que aumentó su aceptabilidad sensorial sin detrimento de sus propiedades nutracéuticas. Los resultados de este estudio mostraron mayor capacidad antioxidante y aceptabilidad sensorial, al reducir el sabor astringente distintivo del té de hierbas. Kombucha es una bebida ligeramente ácida que se produce por la fermentación de té negro y azúcar a través de una asociación simbiótica de bacterias y levaduras que forman el "hongo del té". La bebida se remonta a alrededor del 220 a. C. en China, donde fue reconocida por la dinastía Tsin debido a las propiedades energizantes y desintoxicantes de la infusión (^{Dufresne & Farnworth, 2000}), y se ha consumido por sus propiedades profilácticas y terapéuticas en todo el mundo. Este producto de fermentación es conocido por diferentes nombres: en Rusia, donde se ha preparado durante dos siglos, se le llama "Tea Kvass", mientras que en Japón se conoce como "kōcha kinoko". Tradicionalmente, para que un producto sea considerado Kombucha tiene que estar hecho solo de té negro o té verde endulzado, ya que poseen la fuente de nitrógeno que necesitan los microorganismos que se liberan durante la decocción de té como purinas y derivados de xantina, tales como la cafeína, la teofilina y los alcaloides estimulantes del sistema nervioso central (^{Frank, 1995}). La amplia investigación sobre el té negro/verde y sus efectos en la salud es una buena referencia para comprender los mecanismos complejos que intervienen en la actividad fisiológica del té y la Kombucha (^{Dufresne & Farnworth, 2000}). Las células de levadura hidrolizan la sacarosa en glucosa y fructosa produciendo etanol como metabolito (Figura 1) (^{Reiss, 1994}; ^{Sievers, Lanini, Weber, Schuler-Schmid, & Teuber, 1995}). Mientras que las bacterias del ácido acético convierten la glucosa en ácido glucónico y la fructosa en ácido acético, existen otros metabolitos producidos tales como el ácido láctico, ácido glucurónico y glicerol. La oxidación de los polifenoles del té durante la fermentación conduce a la formación de catequinas, teaflavinas, ácido teaflavias y polímeros de proantocianidina, así como la síntesis de vitaminas B y ácido fólico (^{Dufresne & Farnworth, 2000}). Los compuestos fenólicos están involucrados en diversas funciones, tales como absorción de nutrientes, síntesis de proteínas, actividad enzimática, fotosíntesis, formación de componentes estructurales y defensa contra factores ambientales adversos. Los polifenoles dietéticos muestran un efecto antioxidante significativo/propiedad de eliminación de radicales; sin embargo, los mecanismos por los que expresan sus efectos benéficos contra varias enfermedades crónicas comunes, tales como las enfermedades cardiovasculares, la diabetes y el cáncer, no están totalmente claros, pero al parecer implican la interacción con vías de señalización molecular y maquinaria relacionada que regulan los procesos celulares como la inflamación (^{González et al., 2011}).

Las bacterias y los hongos en Kombucha forman una simbiosis poderosa que es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes potenciales (^{Balentine, Wiseman, & Bouwens, 1997}; ^{Liu, Hsu, Lee, & Liao, 1996}). Las principales bacterias que se encuentran en el hongo del té son: Acetobacter xylinum Brown (^{Balentine et al., 1997}), Bacterium gluconicum Hermann (^{Reiss, 1994}), Acetobacter aceti Pasteur y Acetobacter pasteurianus Kozulis & Parsons (^{Liu et al., 1996}). Las levaduras comunes identificadas en el hongo del té son: Schizosaccharomyces pombe Lindner, Saccharomycodes ludwigii Hansen, Kloeckera apiculata Reess, Saccharomyces cerevisiae Meyer, Zygosaccharomyces bailii Barnett, Brettanomyces bruxellensis Kufferath & Von Laer, B. lambicus Koff & Van Laer, B. custersii Florenz, Candida y Pichia (^{Balentine et al., 1997}; ^{Liu et al., 1996}; ^{Mayser, Fromme, Leitzmann, & Gruender, 1995}). En consecuencia, la bebida de Kombucha ha mostrado actividad antimicrobiana al igual que las bebidas fermentadas producidas a partir de otras infusiones de hierbas como Thymus vulgaris L., Lippia citriodora Palau, Rosmarinus officinalis L., Foeniculum vulgare Mill. y Mentha piperita L. (^{Battikh, Bakhrouf, & Ammar, 2012}). Estos análogos de Kombucha han mostrado gran potencial antimicrobiano, en particular contra cepas de Candida, que los convierte en bebidas de salud prometedoras. Curiosamente, el potencial antimicrobiano de las bebidas de Kombucha no solo se debe a la acidez o a sus ácidos orgánicos (glucónico, glucurónico, láctico, y acético), sino también a otros metabolitos biológicamente activos (polifenoles, vitaminas, aminoácidos, antibióticos y micronutrientes) que se biosintetizan durante el proceso de fermentación, mejorando el perfil nutracéutico de la bebida.

El proceso de fermentación del té Kombucha implica como primera etapa, la acción de la levadura que fermenta la glucosa y fructosa en etanol, que continúa la oxidación a ácido acético mediante la acción de las bacterias de ácido acético. La principal fuente de carbono en este proceso es la sacarosa. Esta azúcar se hidroliza mediante la enzima invertasa proveniente de la levadura en el consorcio de Kombucha, dejando disponible la fructosa y glucosa. Las levaduras metabolizan el azúcar con preferencia inicial por la fructosa para producir etanol. La glucosa no metabolizada inicialmente por la levadura se utiliza por las bacterias en el consorcio y mediante la acción de la catalasa se convierte en ácido glucono delta lactona, que se transforma espontáneamente en ácido glucónico (Figura 1). Otra forma de metabolizar la glucosa es mediante la oxidación a ácido glucurónico. La importancia fisiológica de este ácido orgánico se basa en su capacidad para conjugarse con diversas sustancias endógenas y exógenas (es decir, xenobióticos) que forman glucurónidos, los cuales se producen mediante una reacción catalizada por la enzima udp-glucuronil transferasa. Las moléculas hidrófobas pequeñas que contienen oxígeno, nitrógeno, azufre o grupos funcionales de carboxilo pueden conjugarse químicamente con ácido glucurónico para producir glucurónidos más polares y ácidos que son más solubles en agua a pH fisiológico en comparación con los precursores, alterando sus propiedades de metabolismo, transporte o excreción.

Algunos de los efectos positivos atribuidos al consumo de Kombucha, basados principalmente en testimonios y observaciones personales, son: propiedades antibióticas, regulación intestinal y gástrica, actividad glandular, alivio de dolencias reumáticas, control de gota, tratamiento contra hemorroides, nivel de colesterol y regulación de aterosclerosis, limpieza de toxina en la sangre, y como control para la diabetes, nerviosismo y problemas de envejecimiento; algunas propiedades han sido probadas mediante estudios científicos y experimentales. En 1995, la Food and Drug Administration (FDA) reportó dos casos de enfermedad graves donde se involucró el consumo de Kombucha. Una persona murió debido a perforaciones en el tracto intestinal causadas por acidosis grave, y la otra persona que sobrevivió mencionó que había aumentado el tiempo de fermentación de 7 a 14 días. Estos casos se investigarony se concluyó queelconsumode Kombucha no es perjudicial a bajas dosis de 100 mL·día^-1. La FDA recomienda que el periodo de fermentación no exceda los 10 días, debido a que el aumento de la acidez puede conducir a niveles potencialmente dañinos para los consumidores (^{Nummer, 2013}).

^{Jayabalan, Subathradevi, Marimuthu, Sathishkumar, y Swaminathan (2008)} encontraron que el contenido fenólico total en el té negro aumentó gradualmente (de 80 a 100 µg·g^-1) con el tiempo de fermentación (0 a 18 días), obteniendo un nivel alto de antioxidantes con la capacidad de capturar radicales libres y especies reactivas de oxígeno. Un caso similar fue reportado por ^{Vázquez-Cabral et al. (2014)}, quienes observaron que el contenido fenólico (~1 mg·g^-1) se relaciona con el tiempo de fermentación, aunque la aceptación sensorial se ve afectada. Esto último se atribuyó a la reducción de aceptabilidad sensorial de los metabolitos de biotransformación de sacarosa que interfieren con el sabor, así como la presencia de flavan-3-oles tales como la catequina y epicatequina. Es posible que la conversión metabólica de los compuestos fenólicos en infusiones de encino mediante el microbioma Kombucha se deba a la glucuronidación de compuestos flavonoides. Esto puede aumentar su biodisponibilidad, siendo las hojas del encino una rica fuente de elagitaninos y flavonoides, que han mostrado actividades biológicas importantes en pruebas in vitro e in vivo.

Conjugación de polifenoles y su biodisponibilidad

La biodisponibilidad puede entenderse como la integración de varios procesos por los cuales una fracción de un nutriente o medicamento ingerido está disponible para la digestión, absorción, transporte, uso y eliminación (^{Hurrell & Egli, 2010}). Un aspecto importante en relación con la biodisponibilidad de los polifenoles es su estabilidad química durante la digestión gástrica y curso intestinal. El consumo total de polifenoles implica una interacción compleja que incluye la bioquímica de glucósidos de polifenol, su metabolismo de aglicón y la tasa de transporte de cada forma. La mayoría de los flavonoides que entran en la circulación sistémica en forma conjugada son sulfatados o glucuronizados.

La mayoría de las actividades biológicas in vitro se realizan utilizando las formas de aglicona de los glicósidos de polifenol. En particular, la mayoría de los flavonoides, excepto las catequinas, están presentes en plantas y alimentos como B-glucósidos. Se reconoce que la glicosilación influye en las propiedades químicas, físicas y biológicas de los polifenoles. Una vez ingeridos, y antes de entrar en la circulación general, estos glucósidos pueden sufrir hidrólisis (^{Berrin, McLauchlan, Needs, & Williamson, 2002}; ^{Németh, Plumb, Berrin, & Juge, 2003}). Después que los flavonoides se hidrolizan pueden someterse a la conjugación mediante reacciones de metilación, sulfatación o glucuronidación, ya que muestran en general una capacidad alta de conjugación en sus concentraciones plasmáticas muy bajas (^{Manach, Scalbert, Morand, & Remesy, 2004}). Las catequinas se someten a una biotransformación amplia, incluyendo glucuronidación, lo que aumenta su biodisponibilidad. La bioconversión de flavan-3-oles como la metilación u otras reacciones de conversión puede ocurrir en los enterocitos o más tarde en las células hepáticas (^{Tapiero, Tew, Nguyen Ba, & Mathé, 2002}). Dentro de los enterocitos, las agliconas se convierten en glucurónidos que pueden pasar a través de sus membranas basolaterales, viajando hasta el sistema vascular y posteriormente a la circulación sistémica; también pueden ser transferidos de regreso al compartimiento luminal por P-glicoproteína o proteínas resistentes a múltiples fármacos.

La glucuronidación es una de las reacciones más comunes utilizadas por el hígado para producir metabolitos polares (hidrófilos). La glucuronidación implica la transferencia de componentes de ácido glucurónico a partir de ácido udp-glucurónico a un sustrato mediante cualquier udp-glucuronosil transferasa. Se sabe que el ácido udp-glucurónico es un intermediario en el proceso y se forma en el hígado. Las sustancias resultantes de la glucuronidación se identifican como glucurónidos y son más solubles en agua. Por lo tanto, este sistema se utiliza por el cuerpo humano para permitir la eliminación posterior a través de la orina o heces. Las hormonas también pueden someterse a glucuronidación para permitir la transportación más fácil por todo el cuerpo. La conjugación de las moléculas xenobióticas con especies moleculares de hidrófilos tal como el ácido glucurónico se conoce como Metabolismo Fase II.

Los experimentos in vitro que utilizan agliconas flavonoides o conjugados glicosilados (^{Lolito, Zhang, Yang, Crozier, & Grei, 2011}) han demostrado que la glucuronidación quercetina o sulfatación quercetina afectan su resultado inhibitorio sobre la expresión de moléculas de adhesión, mientras que la metilación conserva su actividad antinflamatoria. El galato de epigalocatequina no conjugado altamente documentado (EGCG) es la forma más abundante detectada en el plasma, con una relación que va desde 77 a 90 % de la ingesta. Por otro lado, otras catequinas parecen altamente conjugadas con grupos de ácido glucurónico y/o sulfato (^{Rahman, Biswas, & Kirkham, 2006}).

La glicosilación afecta las propiedades químicas, físicas y biológicas de los polifenoles. La extracción de azúcar proveniente de flavonoides glicosilados, mediante la acción de glicosidasas y por consiguiente la acción hidrófila, induce una difusión pasiva de la aglicona a través de las microvellosidades intestinales. Los polifenoles dietéticos son sustratos de βglucosidasas, udp-glucuronosil transferasa o catecol-O-metilo transferasa en el intestino delgado, y también de diversas enzimas fase I y II en el hígado (^{Rechner et al., 2002}). En cuanto a la bioconversión de flavan-3-oles y flavonoles, dos importantes subclases de flavonoides asociados con la salud humana, pueden ocurrir reacciones de conjugación (metilación, sulfatación y glucuronidación) tanto en los enterocitos como en las células hepáticas. Los flavanoles, tales como (-)-epicatequina están a menudo acilados, especialmente por el ácido gálico. Las sustituciones galoilas resultantes no afectan aparentemente los coeficientes de partición de compuestos y su biodisponibilidad tan dramáticamente como lo hace la glicosidación (^{Tapiero et al., 2002}). Los flavan-3-oles aparentemente pasan a través de membranas biológicas y son absorbidos sin desconjugación o hidrólisis. Por lo tanto, cuando se consume (+)-catequina, a dosis de 2 g, su fracción de plasma varía de 0.2 a 2 % del total consumido, detectándolo después de 30 min como catequina sin conjugación y después de 120 min como catequina metilada. Después de 8 h, 40 % de la catequina se detecta en la orina como derivado metilado, sulfatado y glucuronizado. Los flavan-3-oles no alteran los niveles de antioxidantes endógenos y productos de bioconversión en presencia de ácidos fenólicos tales como vanílico, 4-hidroxibenzoico, 3,4-dihidroxibenzoico, y 3-metoxi- 4-hidroxihipurico (^{Rodrigo, Miranda, & Vergara, 2011}).

Otros compuestos modelo como el ácido elágico y los elagitaninos han mostrado actividad antitumoral en pruebas in vitro e in vivo. Tales compuestos se han propuesto como profitoestrógenos debido a que la biodisponibilidad de los metabolitos derivados de elagitaninos de la microflora del colon, conocidos como urolitinas (derivados de hidróxido benzopiran- 6-ona), han mostrado actividad antiestrógena en modelos in vitro (^{Larrosa, González-Sarrías, García- Conesa, Tomás-Barberán, & Espín, 2006}). ^{Azorín-Ortuño et al. (2008)} evaluaron in vivo la seguridad de un encino con sabor a leche en polvo, pero no fue posible detectar elagitaninos y metabolitos derivados en el hígado, riñón y útero de ratas, debido a la baja cantidad de elagitaninos administrados (0.094 mg·día^-1). Sin embargo, fue posible identificar urolithin A glucurónido en la orina y urolithin A en las heces, confirmando que la producción como metabolitos derivados de la microflora es independiente de la estructura o concentración de los elagitaninos. ^{Espín et al. (2007)} evaluaron la biodisponibilidad y metabolismo de elagitaninos de cerdo ibérico y la distribución en diferentes tejidos con el fin de proporcionar información sobre la biodisponibilidad en humanos. Los autores mostraron que los elagitaninos liberan ácido elágico en condiciones fisiológicas in vivo, que se metaboliza gradualmente en el intestino para producir urolithin D y C, finalizando con urolithin A y B. Cuando se absorben los metabolitos, la primera glucuronidación puede ocurrir en las células intestinales, encontrando su camino a la aorta; una vez que los compuestos están en el hígado, se metabolizan para producir glucurónidos y sulfatos que pueden secretarse en la bilis. La presencia de ácido elágico en la bilis y la orina, y la ausencia en tejidos intestinales, sugiere que dicho ácido se puede absorber en la primera parte del tracto gastrointestinal.

El uso de otras hierbas analógicas como el romero (R. officinalis) ha despertado gran interés científico, debido a sus principales componentes diterpénicos: ácido carnósico y carnosol, que confieren significado biológico de la planta, incluyendo actividades antinflamatorias, antiobesogénicas, antiangiogénicas y anticancerígenas. ^{Romo-Vaquero et al. (2013)} llevaron a cabo un estudio sobre el perfil metabólico del lumen intestinal, hígado, plasma y cerebro en ratas hembras Zucker tratadas con extracto oral de romero, señalando que la conjugación de ácido carnósico y carnosol se debe principalmente a la glucuronidación. La presencia del glucurónido de ácido carnósico en el hígado y el plasma se confirmó, aunque la incidencia de ácido carnósico metilado fue más abundante en el plasma que en el intestino y el hígado.