Obtención de cepas y producción de inóculo de cinco especies de hongos silvestres comestibles de alta montaña en el centro de México

 

Obtaining strains and spawn production from five species of alpine wild edible mushrooms in the center of Mexico

 

Yolanda Arana-Gabriel¹; Cristina Burrola-Aguilar¹*; Roberto Garibay-Orijel²; Sergio Franco-Maass³

 

¹ Centro de Investigación en Recursos Bióticos, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de México. km 14.5, carretera Toluca-Atlacomulco. C. P. 50200. Toluca, Estado de México. México. Correo-e: cba@uaemex.mx Tel.:+52 (722) 2 96 55 53 (* Autora para correspondencia).

² Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito exterior s/n, Ciudad Universitaria. A. P. 70-233. C. P. 04510. México, D. F.

³ Instituto de Ciencias Agropecuarias y Rurales. Universidad Autónoma del Estado de México. Instituto Literario núm. 100, col. Centro. C. P. 50000. Toluca, Edo. de México. México.

 

Recibido: 25 de abril, 2014
Aceptado: 08 de octubre, 2014

 

RESUMEN

Se obtuvieron cepas de Psathyrella spadicea, Floccularia aff. luteovirens, Clitocybe squamulosa, Flammulina mexicana y Lyophyllum aff. shimeji, cuyos esporomas son recolectados y consumidos por habitantes del Nevado de Toluca, México. Las cepas se estudiaron in vitro en seis medios de cultivo (ACP: Agar croquetas de perro, AM: Agar maíz, PDA-PL: Agar papa dextrosa-peptona y levadura, EMA-PL: Agar extracto de malta-peptona y levadura, PDA y EMA) a 18 °C y 25 °C. Las especies se desarrollaron satisfactoriamente a 18 °C, siendo F. mexicana y L. aff. shimeji las que tuvieron mayor velocidad de crecimiento y producción de biomasa. Flammulina mexicana solo se desarrolló a 18 °C, presentando mayor crecimiento y producción de biomasa en ACP. La cepa de L. aff. shimeji creció a 18 y 25 °C, la mayor velocidad de crecimiento se registró en medio PDA a 18 °C y la mayor producción de biomasa en EMA-PL a 18 °C. Considerando las mejores condiciones para el desarrollo de micelio in vitro, se produjo inóculo primario de F. mexicana y L. aff. shimeji en trigo y sorgo. La mayor densidad del micelio y porcentaje de grano cubierto se obtuvieron con el sustrato de trigo.

Palabras clave: Cultivo in vitro, aislamiento vegetativo, producción de biomasa, velocidad de crecimiento, Flammulina mexicana, Lyophyllum aff. shimeji.

 

ABSTRACT

Strains of Psathyrella spadicea, Floccularia aff. luteovirens, Clitocybe squamulosa, Flammulina mexicana and Lyophyllum aff. shimeji were obtained, their sporomes use to be collected and consumed by inhabitants of the Nevado de Toluca, Mexico. The strains were studied in vitro on six culture media (DFA: Dog food agar, MA: Maize agar, PDA-PL: potato dextrose-peptone and yeast agar, EMA-PL: malt extract agar peptone and yeast, PDA and EMA) at 18 °C and 25 °C. Species satisfactorily developed at 18 °C, F. mexicana and L. aff. shimeji had the highest growth rate and biomass production. Flammulina mexicana only developed at 18 °C showing higher growth and biomass production on DFA. The strain of L. aff. shimeji grew at 18 and 25 °C, the highest growth rate was recorded on PDA at 18 °C and highest biomass production on EMA-PL at 18 °C. Regarding the best conditions for the in vitro development of mycelium, primary spawn was obtained from F. mexicana and L. aff. shimeji in wheat and sorghum. The highest density and percentage of covered mycelium were obtained using wheat substrate.

Keywords: In vitro culture, vegetative isolation, biomass production, growth rate, Flammulina mexicana, Lyophyllum aff. shimeji.

 

INTRODUCCIÓN

En México se consumen 371 especies de hongos de manera tradicional (Garibay-Orijel & Ruan-Soto, 2014). La recolecta forma parte de los patrones de subsistencia de las poblaciones rurales cercanas a las zonas boscosas, por ser una de las principales fuentes de ingresos y alimentación durante la temporada de lluvias (Alvarado-Castillo & Benítez, 2009; Boa, 2005). El conocimiento micológico tradicional es la base de todo aprovechamiento de los hongos silvestres, pues permite identificar y conocer las especies que pueden ser potencialmente susceptibles de cultivo, con fines de consumo y comercialización, principalmente aquellas que son valoradas regionalmente. Gracias a los patrones de consumo y conocimiento tradicional detallado de los pobladores, también es posible seleccionar especies adaptadas a las condiciones ambientales de la región, brindar elementos para definir sustratos y mejorar la tecnología de la industria del cultivo de hongos, lo cual permite mayor y mejor aprovechamiento del germoplasma propio, reduciendo así su dependencia genética y tecnológica (Garibay-Orijel, Ruán-Soto, & Estrada-Martínez, 2010).

El cultivo de hongos en México promueve beneficios económicos, ecológicos y sociales (Martínez-Carrera, 2002). Actualmente, la mayoría de las cepas utilizadas en el cultivo comercial provienen de regiones de América del Norte, Europa y el sur de Asia. Las cepas son mantenidas bajo métodos convencionales o depositadas en colecciones para su preservación, y son utilizadas en investigaciones orientadas al cultivo de especies comestibles, incremento de la colección de cepas, mejoramiento de los sistemas de cultivo, producción de enzimas y adaptación fisiológica de los hongos (Mata, Salmones, & Gaitán-Hernández, 2010). Algunos géneros con los que se trabajan son: Pleurotus, Lentinula, Neolentinus, Volvariella, Agaricus, Auricularia, Flammulina, Ganoderma, Grifola, Hypsizigus, Lepista y Morchella (Martínez-Carrera, 2002; Mata et al., 2010). De aquí la importancia de realizar estudios encaminados a la obtención, caracterización y aprovechamiento del germoplasma propio de cada región, como es el caso del Nevado de Toluca, Estado de México, donde se han registrado 77 especies de hongos comestibles silvestres (Franco, Burrola, Aguila & Arana, 2012). Algunas de estas especies se consideran con alto potencial de cultivo, por ser saprobias y apreciadas localmente para autoconsumo, como Psathyrella spadicea (P. Kumm.) Singer (clavo de oyamel), Floccularia aff. luteovirens (Alb. & Schwein.) Pouzar (hongo de yema), Clitocybe squamulosa (Pers.) P. Kumm. (tejamanilero) y Flammulina mexicana Redhead, Estrada, & R. H. Petersen (hongo de jara). Esta última ha sido reportada recientemente como comestible (Franco et al., 2012). El género Flammulina es conocido por su distribución cosmopolita y por tener especies comestibles de importancia económica, nutricional y medicinal como F. velutipes (Curtis) Singer (Ge, Yang, Zhang, Mathey, & Hibbet, 2008; Rodrigues, Paccola-Meirelles, De Jesus, & Kazue, 2009; Suárez & Nieto, 2013). Otra especie con importancia culinaria y económica en los mercados regionales es Lyophyllum aff. shimeji (Kawam.) hongo (clavo de llano, clavo de bosque o clavito) (Mariaca, Silva, & Castellanos, 2001), una especie micorrícica facultativa ampliamente distribuida en el este de Asia y en las regiones del norte de Europa (Moncalvo et al., 2002; Visnovsky et al., 2013). Hoy en día, a pesar de que L. aff. shimeji se cultiva exitosamente en medio sintético (Kusuda et al., 2004; Ohta, 1994, 1998), se generan investigaciones dedicadas a su fructificación mediante la asociación con especies arbóreas, en función de la cepa y su origen geográfico (Visnovsky et al., 2014).

Los objetivos de esta investigación fueron aislar vegetativamente, en diferentes medios de cultivo, cepas de algunas especies de hongos usadas como alimento en el Nevado de Toluca; estudiar las características de las cepas e identificar el medio más adecuado para el cultivo in vitro y producción de inóculo primario en relación con la velocidad de crecimiento y producción de biomasa.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Los esporomas de hongos comestibles de importancia alimenticia y económica se recolectaron, a partir de un muestreo dirigido hacia los bosques de Abies religiosa (Kunth) Schltdl. & Cham., donde los pobladores de las comunidades del Nevado de Toluca suelen encontrarlos. Los esporomas fueron identificados y caracterizados conforme a Franco et al. (2012). Los ejemplares voucher se depositaron en la colección de hongos del Herbario Nacional de México en el Instituto de Biología de la UNAM (MEXU) bajo los siguientes números: 27404 (C. squamulosa); 27405 (F. aff. luteovirens); 27406 (L. aff. shimeji); 27407, 27408 (P. spadicea) y 27409, 27410, 27411 (F. mexicana).

Aislamiento y caracterización de cepas

Las cepas se obtuvieron por aislamiento vegetativo en los medios agar papa dextrosa (PDA) y agar extracto de malta (EMA); se tuvieron 20 repeticiones por medio de cultivo e incubaron a 18 y 25 °C en oscuridad (Chang & Miles, 2004; Stamets, 2000). Posteriormente, las cepas se resembraron en seis medios de cultivo: agar croquetas de perro (ACP), agar maíz (AM), agar papa dextrosa-peptona y levadura (PDA-PL), agar extracto de malta-peptona y levadura (EMA-PL), EMA y PDA (Stamets, 2000). En el Cuadro 1 se muestran las formulaciones de cada uno de estos. Todos los medios se esterilizaron a 121 °C y 15 lb de presión, se agregaron 0.05 g de cloranfenicol (SIGMA^MR) como antibiótico y se midió el pH, dando los siguientes valores: EMA = 4.8, PDA = 5.5, AM = 6.1, ACP = 6.2, EMA-PL = 5, PDA-PL = 5.7. Las cepas de F. mexicana y L. aff. shimeji fueron depositadas con las claves IE 974 e IE 975, respectivamente, en el cepario del Instituto de Ecología (INECOL) en Xalapa, Veracruz, México.

Una vez que el micelio invadió por completo la caja de Petri, se hizo la caracterización macroscópica con base en lo señalado por Cruz-Ulloa (1995). Para ello, se tomó el micelio en la fase de crecimiento exponencial y se realizaron preparaciones temporales con rojo congo al 10 %; se observó la presencia de fíbulas y se midió el diámetro de las hifas a 100x (20 hifas por tratamiento) con ayuda del programa Motic digital Microscope DMB3-223 (Motic China Group Co., Ltd., 2001-2004).

Evaluación de la velocidad de crecimiento y producción de biomasa

Con ayuda de un horadador se tomó un disco (5 mm de diámetro) de agar con micelio que se colocó en el centro de la caja de Petri (9 cm de diámetro); se tuvieron seis réplicas por medio de cultivo. Las cajas se incubaron a 18 y 25 °C en oscuridad, y cada tercer día se midió el diámetro de la colonia con un vernier (calibrador vernier metal 5" PRETUL^®, ver-6p, China). La velocidad de crecimiento se calculó con la fórmula utilizada por Huerta, Martínez-Carrera, Sánchez, y Leal-Lara (2009):

Velocidad de crecimiento = (Df - Di) / (Tf - Ti)

Donde:

Df = Diámetro final de crecimiento

Di = Diámetro inicial de crecimiento

Tf-Ti = Días de crecimiento micelial

La biomasa se cuantificó midiendo el peso seco mediante la técnica modificada de Santiago-Martínez, Estrada-Torres, Varela, y Herrera (2003). Una vez concluido el periodo de incubación, las cepas se colocaron en agua hirviendo para eliminar el agar, se enjuagaron con agua caliente y se secaron en un horno a 80 °C por 24 h.

El análisis estadístico se hizo con el programa Statgraphics^® Centurión XVI (Statpoint Technologies, Inc., 2009). Los datos de F. mexicana se sometieron a un ANOVA considerando el medio de cultivo como factor, y la velocidad de crecimiento y producción de biomasa como variables de respuesta. Los datos del hongo L. aff. shimeji también se trataron con un ANOVA, donde los factores fueron la temperatura y el medio de cultivo, y las variables de respuesta fueron la velocidad de crecimiento y producción de biomasa. Las diferencias significativas entre medios de cultivo se determinaron con una prueba de rangos múltiples de Tukey (P ≤ 0.05). Debido a que la velocidad de crecimiento de P. spadicea, F. aff. luteovirens y C. squamulosa fue muy lenta, la producción de biomasa no se cuantificó, por lo que dichas cepas no se analizaron estadísticamente.

Producción de inóculo

La producción de inóculo de L. aff. shimeji se evaluó en los medios PDA y EMA-PL, y F. mexicana se evaluó en ACP y PDA-PL, utilizando granos de trigo y sorgo como sustrato (10 réplicas por tratamiento). Los granos fueron sometidos a un proceso de hidratación (Gaitán-Hernández, Salmones, Pérez-Merlo, & Mata, 2006; Stamets, 2000). El trigo, además de la hidratación, se sometió a un proceso de cocción (evitando que se deshiciera o tuviera una consistencia dura) con la finalidad de romper el endospermo y que las hifas penetraran con mayor facilidad. El exceso de agua se eliminó y se pesaron 200 g de cada grano, se adicionaron 3.5 g de cal-kg ^-1 y se colocaron en frascos de vidrio. Los frascos se taparon con papel aluminio para su esterilización en la autoclave a 15 Ib y 121 °C durante 1 h. Previo a la inoculación se midió el pH y la humedad (%). La inoculación se hizo a 18 °C con el micelio que presentó mayor biomasa y velocidad de crecimiento en los medios de cultivo, colocando tres fragmentos de 1 cm² sobre la semilla. A los 30 días de incubación se obtuvo el porcentaje de grano invadido por el hongo, también se evaluó la densidad del micelio mediante el análisis cualitativo modificado de Villegas, Pérez, y Arredondo, (2007): 1.0-2.0 = micelio poco denso (0-30 % del grano cubierto por micelio), 2.1-3.0 = micelio medianamente denso (31-80 % del grano cubierto por micelio), 3.1-5.0 = micelio denso (81-100 % del grano cubierto por micelio).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se aislaron e identificaron cepas de Flammulina mexicana, Lyophyllum aff. shimeji, Psathyrella spadicea, Clitocybe squamulosa y Floccularia aff. luteovirens. Las especies con mejor desarrollo en el cultivo in vitro para la producción de inóculo fueron F. mexicana y L. aff. shimeji.

Caracterización de cepas

Psathyrella spadicea (P. Kumm.) Singer (clavo de oyamel).

La cepa creció únicamente en PDA-PL con pH de 5.7 a 18 °C, alcanzando 3.2 cm de diámetro en tres meses. La cepa tuvo forma circular con margen fimbrado, crecimiento del micelio sumergido con textura algodonosa, superficie plana, densidad escasa y de color café (Figura 1a). En cuanto a las características microscópicas, las hifas midieron de 2.1 a 3.3 µm de diámetro; se observaron ramificadas, septadas, sinuosas y con fíbulas frecuentes.

Floccularia aff. luteovirens (Alb. & Schwein.) Pouzar (hongo de yema).

La cepa obtenida creció en medio EMA (pH 4.8) y AM (pH 6.1) a 18 °C. En medio EMA, la cepa alcanzó diámetro máximo de 3.5 cm en tres meses; presentó forma y margen circular, crecimiento de micelio aéreo, textura algodonosa, superficie plana, densidad abundante y de color blanca (Figura 1b). Microscópicamente, las hifas se observaron ramificadas, septadas, sinuosas y con fíbulas escasas, y midieron de 2.1 a 3.3 µm de diámetro. En medio AM, la cepa midió 4 cm de diámetro en dos meses, con forma y margen irregular, crecimiento de micelio aéreo, textura aterciopelada, superficie irregular y de color blanca. Las hifas variaron de 1.7 a 2.1 µm de diámetro; se observaron ramificadas, septadas, lisas y con fíbulas frecuentes.

Clitocybe squamulosa (Pers.) P. Kumm. (tejamanilero).

La cepa se aisló en PDA con pH de 5.5 a 18 °C alcanzando 3.2 cm de diámetro en tres meses; creció con forma irregular, margen liso, micelio sumergido, textura aterciopelada, superficie plana, densidad escasa y de color amarilla (Figura 1e); desarrolló hifas de 2.8 a 4.2 µm de diámetro, ramificadas, septadas, tortuosas y con fíbulas frecuentes.

Flammulina mexicana Redhead, Estrada & R. H. Petersen (hongo de jara).

La cepa creció en los seis medios de cultivo (EMA, PDA, AM, ACP, EMA-PL y PDA-PL) a 18 °C. En los seis medios, la cepa presentó forma circular, margen fimbrado, crecimiento de micelio de tipo aéreo, textura algodonosa, superficie plana y de color blanco con algunas tonalidades amarillo-marrón, con la tonalidad más marcada en PDA (Figura 1d). Una vez que el micelio invadió por completo el medio de cultivo, las cajas de Petri se almacenaron a 4 °C; a tal temperatura, la especie formó primordios en el medio AM. En cuanto a las características microscópicas, las hifas fueron ramificadas, septadas, lisas y con fíbulas frecuentes. El diámetro de las hifas difirió en cada uno de los medios: en EMA-PL y PDA-PL fue de 1.8 µm (1.5-2.1 µm), seguidos de EMA y PDA con 2 µm (1.7-2.4 µm), ACP con 2.4 µm (2.1-2.8 µm) y en AM de 3 µm (2.7-3.4 µm).

Lyophyllum aff. shimeji (Kawam.) hongo (clavo de llano, clavo de bosque o clavito).

La cepa aislada creció en los seis medios de cultivo (EMA, PDA, AM, ACP, EMA-PL y PDA-PL) a 18 y 25 °C. La cepa presentó forma circular en todos los medios a las dos temperaturas, margen liso a fimbrado, con crecimiento de micelio postrado-sumergido o postrado aéreo, textura aterciopelada o algodonosa, superficie plana o cóncava y de color blanco con café en PDA-PL y EMA, y color blanco en el resto de los medios (Figura 1e). Microscópicamente, las hifas fueron ramificadas, septadas y con fíbulas. A 18 °C, el diámetro de las hifas varió en cada uno de los medios de cultivo: PDA = 1.3 µm (1.2-1.5 µm), EMA = 1.4 µm (1.3-1.5 µm), EMA-PL: 1.6 µm (1.5-1.9 µm), AM = 1.8 µm (1.5-2.1 µm), ACP = 1.9 µm (1.7-2.1 µm) y PDA-PL = 2 µm (1.5-2.5 µm). A 25 °C, las hifas midieron: PDA = 1.9 µm (1.7-2.1 µm), EMA: 1.9 (1.7-2.3 µm), EMA-PL: 1.6 µm (1.3-2.1 µm), AM = 1.7 µm (1.5-2 µm), ACP = 2.2 µm (1.9-2.6 µm) y PDA-PL = 1.7 µm (1.5-1.9 µm).

Velocidad de crecimiento y producción de biomasa

El hongo P. spadicea alcanzó diámetro máximo de 3.2 cm en tres meses; F. aff. luteovirens, 3.5 cm en tres meses; y C. squamulosa, 3.2 cm en tres meses. Debido a que la velocidad de crecimiento fue muy lenta en estas especies, la producción de biomasa no se cuantificó.

El Cuadro 2 muestra los resultados de la comparación de medias de Tukey de la velocidad de crecimiento y producción de biomasa de F. mexicana en los diferentes medios de cultivo. Respecto a F. mexicana, existieron diferencias significativas en la velocidad de crecimiento (F_5,35 = 2.32, P < 0.0001) y producción de biomasa (F_5,35= 11.30, P < 0.0001) en los seis medios de cultivo. La mayor velocidad de crecimiento micelial (0.65 cm·día^-1) se registró en los medios ACP y AM, alcanzando 9 cm de diámetro en 13 días. La velocidad de crecimiento micelial más lenta (0.31 cm-día^-1) se registró en el medio PDA, con un tiempo de colonización entre 25 a 27 días. En EMA, EMA-PL y PDA-PL hubo invasión de 9 cm de diámetro a los 17, 19 y 21 días, respectivamente. En cuanto a la producción de biomasa, los mejores medios fueron PDA-PL, EMA-PL y ACP, siendo estadísticamente similares (P ≤ 0.05).

La velocidad de crecimiento de L. aff. shimeji fue diferente significativamente con respecto a la temperatura (F_1,71 = 494.55, P < 0.0001) y el medio de cultivo (F_5,71 = 207.02, P < 0.0001) y hubo interacción significativa (F =152.93, P < 0.0001) entre ambos factores. Con relación a la producción de biomasa, también se encontraron diferencias estadísticas significativas con respecto a la temperatura (F_5,71 = 16.73, P < 0.0001) y el medio de cultivo (F_5,71 = 8.44, P < 0.0001), existiendo interacción significativa (F_5,71 = 19.09, P < 0.0001) entre ambos factores. El Cuadro 3 muestra los resultados de la comparación de medias de Tukey de la velocidad de crecimiento y producción de biomasa de L. aff. shimeji en los diferentes medios de cultivo. La velocidad de crecimiento significativamente mayor se presentó en PDA a 18 °C (0.40 cm·día^-1), invadiendo la caja de Petri en 21 días. La velocidad de crecimiento significativamente menor se registró en ACP y AM, ambos medios a 25 °C. A esta misma temperatura, algunos medios presentaron crecimiento irregular, ya que existieron periodos donde no hubo crecimiento o como el caso de AM y ACP donde el micelio dejó de crecer a los 23 días, alcanzando solo 5 cm de diámetro y manteniéndose así hasta el día 31 que se dejó de monitorear. Por otra parte, la producción de biomasa significativamente mayor se presentó en EMA-PL a 18 °C (0.22 g). De manera contrastante, la cepa de L. aff. shimeji que creció en PDA a 18 °C tuvo la mayor velocidad de crecimiento, pero también menor producción de biomasa.

El crecimiento del micelio de cada una de las especies en los diferentes medios de cultivo está relacionado con la teoría de que, bajo condiciones nutricionales favorables, los hongos incrementan la ramificación de sus hifas y, por consiguiente, la cantidad de biomasa, aumentando la eficiencia de suministro de nutrientes al incrementarse el área superficial del micelio (Harris, 2008; Jennings & Lysek, 1999). Por lo contrario, en condiciones limitantes de nutrientes, el micelio tiende a ser menos ramificado para maximizar la disponibilidad de estos (Prosser & Tough, 1991). Con respecto al pH, este valor únicamente se midió en los medios de cultivo, más no fue una variable que se ajustara; sin embargo, el valor registrado en cada medio podría hacer referencia sobre los posibles rangos a manejar en estudios posteriores. El pH está involucrado en el metabolismo de los nutrientes y en la permeabilidad de la membrana, por lo que puede ser uno de los factores que estén afectando el desarrollo del micelio; Miles y Chang (1997) mencionan que la mayoría de los hongos presentan mejor crecimiento vegetativo en un medio que va de lo ácido a lo neutral. Esto se ve reflejado en las especies F. mexicana y L. aff. shimeji, ya que desarrollaron el mayor diámetro de hifas en los medios ACP y AM con pH de 6.2 y 6.1, respectivamente. Vázquez-García, Santiago-Martínez, y Estrada-Torres (2002), en un estudio con cepas de hongos ectomicorrícicos, mencionan que el pH afecta el crecimiento, biomasa y el patrón de ramificación del micelio; el pH a la vez puede ser afectado por la fuente de N. Otro factor importante se muestra en las especies que desarrollaron micelio aéreo y tuvieron mayor velocidad de crecimiento; esto puede deberse a que el micelio aéreo favorece el proceso respiratorio al incrementarse la difusión del oxígeno y, por lo tanto, se genera la energía necesaria para mantener el metabolismo celular (Rahardjo, Weber, Le Comte, Tramper, & Rinzema, 2002). La relación C/N y el pH deben considerarse en la elaboración de medios más adecuados para las cepas de P. spadicea, C. squamulosa y F. aff. Luteovirens, las cuales tuvieron velocidad de crecimiento más lenta en comparación con F. mexicana y L. aff. shimeji. Además hay que considerar y relacionar dichos factores con el hábitat de cada especie; por ejemplo, P. spadicea está registrada como sapropárasita (Vašutová, 2008), sus requerimientos nutricionales y el pH son específicos, lo cual se reflejó en la pérdida de la cepa al tratar de reaislarla.

La formación de primordios de F. mexicana, en cultivo puro, confirma la identidad de la cepa y es un indicativo de su capacidad de fructificación, la cual depende de las características nutricionales y ambientales como luz, temperatura y concentración de CO₂ (Stamets, 2000; Yamanaka, Namba, & Tajiri, 2000). La selección de cepas fúngicas con capacidad para formar primordios en conjunto con la investigación encaminada a conocer sus características nutricionales y ambientales, pueden constituir las bases de futuras investigaciones para el cultivo de hongos (Díaz, Flores, & Honrubia, 2009; Stamets, 2000).

Producción de inóculo

El inóculo primario se produjo de F. mexicana y L. aff. shimeji, ya que fueron las especies con mejor desarrollo en el cultivo in vitro. En el caso de F. mexicana se utilizó el micelio que creció en los medios ACP y PDA-PL, pues no presentaron diferencias estadísticas significativas en cuanto a la mayor producción de biomasa de acuerdo con la prueba de Tukey (Cuadro 2); además, con el medio ACP se registró también la mayor velocidad de crecimiento. Los granos de trigo (60 % de humedad y pH 8.3) y sorgo (70 % de humedad y pH 7) se utilizaron debido a su disponibilidad, bajo costo y calidad. El Cuadro 4 muestra la evaluación cualitativa del inóculo a los 20 días de incubación; las mejores condiciones las presentó el trigo con ACP, desarrollando micelio denso y el mayor porcentaje (98.3 %) de grano cubierto.

La producción de inóculo de L. aff. shimeji se hizo con el micelio de medio PDA y EMA-PL, debido a que la cepa tuvo mayor velocidad de crecimiento en PDA y producción de biomasa en EMA-PL. En el Cuadro 4 se muestra la evaluación del inóculo a los 30 días de incubación, donde el trigo inoculado con micelio de ambos medios resultó el más adecuado para la producción de inóculo primario, por presentar micelio denso y mayor porcentaje de grano cubierto. En ambas especies, el micelio del inóculo primario presentaba hifas ramificadas, septadas y con fíbulas frecuentes.

En ambas especies, el trigo fue más eficiente en la producción de inóculo. Este tipo de grano favorece al micelio para tener más vigor, por lo que se considera como un suplemento nutricional (Stamets, 2000). Tanto la humedad como el pH del grano se encuentran en el rango óptimo para el crecimiento del micelio; el rango óptimo de humedad es de 50 a 75 % (Miles & Chang, 1997; Sánchez & Rosye, 2001) facilitando la disponibilidad de los nutrientes. El pH influye directamente sobre las proteínas de la membrana y la actividad de las enzimas ligadas a la pared celular (afecta su metabolismo), por lo que si el pH del sustrato donde crece un hongo no es adecuado, aunque las condiciones de temperatura y nutrientes sean óptimos, el crecimiento será afectado (Miles & Chang, 1997; Sánchez & Rosye, 2001). En este estudio no hubo comparación entre granos, debido a que no pasaron por el mismo tratamiento; ya que el trigo fue hervido y el sorgo no, proceso que generó la mayor disponibilidad de nutrientes en el trigo (Stamets, 2000) y favoreció el crecimiento del micelio, lo cual también es reportado para especies como Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm., P. pulmonarius (Fr.) Quél. y Lentinula edodes (Berk.) Pegler (Holguín & Suárez, 2011; Ríos, Hoyos, & Mosquera, 2010; Villegas et al., 2007).

De acuerdo con los resultados de biomasa, velocidad de crecimiento y producción de inóculo primario, L. aff. shimeji y F. mexicana pueden considerarse como alternativas importantes y viables para el cultivo de nuevas especies de hongos silvestres en México. Además, hay relación con especies ya cultivadas como F. velutipes y L. shimeji, que a pesar de que esta última es considerada una especie micorrícica, se conoce el medio de cultivo sintético para la producción de cuerpos fructíferos (Ohta, 1998).

Además de evaluar la producción de esporomas en diferentes sustratos con las cepas ya estudiadas, es necesario realizar investigaciones enfocadas al aislamiento de nuevas cepas de hongos, para comparar la eficiencia entre ellas, probar diferentes granos para producción de inóculo, modificar y controlar las variables de pH y humedad de los granos. Con F. mexicana sería importante utilizar aserrín de las ramas de Senecio cinerarioides A. Rich., como sustrato; especie de jara donde el hongo se desarrolla y que generalmente es utilizada como leña. En el caso de L. aff. shimeji es factible utilizar el medio sintético propuesto por Otha (1994) y, de manera conjunta, diseñar una estrategia que permita introducirla al mercado y así formar parte de una alternativa viable de aprovechamiento sustentable para las personas que viven en zonas rurales.

 

CONCLUSIONES

El cultivo in vitro permite conocer los requerimientos nutricionales y ambientales de las especies de hongos. Las cepas aisladas presentaron desarrollo favorable a 18 °C de incubación, esto se atribuye a la temperatura del Nevado de Toluca que varía de -3 a 18 °C. Los medios de cultivo utilizados en la presente investigación son considerados generalistas ya que se desconocen los requerimientos nutricionales específicos de las especies utilizadas; sin embargo, proporcionan información importante para identificar factores a los que las cepas son sensibles, mediante su fisiología. Los hongos F. mexicana y L. aff. shimeji fueron las especies más adecuadas para la producción de inóculo primario; siendo el trigo el mejor vehículo para la propagación de micelio. Con la información obtenida, en conjunto con el conocimiento de sus características biológicas, se generan las bases para futuras investigaciones relacionadas a mejorar sus condiciones de cultivo in vitro y experimentar con su fructificación.

 

REFERENCIAS

Alvarado-Castillo, G., & Benítez, G. (2009). El enfoque de agroecosistemas como una forma de intervención científica en la recolección de hongos silvestres comestibles. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 10, 531-539. Obtenido de http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=93912996022        [ Links ]

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