Nota científica

 

Desinfección y selección de inóculo in vitro de Abies religiosa

 

In vitro desinfection and explant selection of Abies religiosa

 

J. G. Álvarez–Moctezuma¹; J. L. Rodríguez–de–la–O²; J. García–Ruíz²

 

¹ División de Ciencias Forestales, Universidad Autónoma Chapingo, Apartado Postal 37, Chapingo, Estado de México. C. P. 56230. Teléfono: 01 (595) 952–1500 Ext. 5468. Fax: 01 (595) 952–1637. Correo–e: jogualmo@correo.chapingo.mx. Autor para correspondencia.

² Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo, Km. 38.5 Carretera México–Texcoco, Chapingo, Estado de México. C. P. 56230 Teléfono: 01 (595) 952–1500 Ext. 6236 y 6325. Correo–e: jrguez@correo.chapingo.mx.

 

Recibido: 23 de octubre, 2006
Aceptado: 30 de enero, 2007

 

RESUMEN

Los bosques de Abies religiosa en el Ajusco (México) están en declinación. Se requiere reestablecer poblaciones a partir de algunos árboles supervivientes en laderas afectadas. Los objetivos fueron evaluar las condiciones in vitro que permitan el establecimiento aséptico de semillas y seleccionar el inóculo más adecuado para la producción de plántulas en A. religiosa. Para la germinación in vitro se probaron desinfectantes (H₂O₂, C₂H₅OH, NaOCl). Se evaluaron inóculos (semilla completa, embriones aislados completos o mitades –corte transversal–, y cotiledones y primeras hojas verdaderas de plántulas germinadas in vitro) para su establecimiento in vitro. El mejor tratamiento para desinfectar la semilla de A. religiosa es sumergirla en H₂O₂ (3 % v/v) y agitar 24 h. Los mejores inóculos para la propagación in vitro fueron la semilla completa y primeras hojas primarias.

Palabras clave: asepsia, H₂O₂, CH₃OH, NaOCl, abeto, semilla.

 

ABSTRACT

Abies religiosa forests in Ajusco (Mexico) are in declination. It is required to restore populations using some survivor trees from affected slopes. The aims were to evaluate in vitro environmental for aseptic establishment of seeds and select the ad hoc explants for plantlet production in A. religiosa. Disinfectants were tested (H₂O₂, C₂H₅OH, NaOCl) for in vitro germination. Explants were evaluated (complete seed, complete or half –transversal cut– isolated embryo, and cotyledons and first leaves from in vitro germinated plantlets) for their in vitro establishment. The best treatment for A. religiosa seed disinfection is dips it in 3% v/v H₂O₂ and shakes 24 h. The best explants for in vitro propagation were complete seed and first leaves.

Keywords: asepsis, H₂O₂, CH₃OH, NaOCl, fir, seed.

 

INTRODUCCIÓN

El A. religiosa es arborescente, crece a elevadas altitudes y los bosques que forma representan la vegetación clímax en la región (Martínez, 1953) se distribuye en nueve entidades federativas de México (Gómez, 2003). Sus principales usos son madera, papel, medicina, techado (Bojorges, 1990), árbol de navidad (Elizaldi, 1979) y captura de carbono (Valenzuela, 2001).

Los bosques de A. religiosa del Ajusco son amenazados por factores crecientes que los han conducido a un proceso de declinación (Álvarez et al., 1998). Se requiere reestablecer las poblaciones originales, a partir de la escasa semilla de los árboles supervivientes en las laderas más afectadas. Las técnicas in vitro asegurarán la reproducción del material.

El objetivo del presente estudio fue evaluar las condiciones in vitro que permitan el establecimiento aséptico de semillas y seleccionar el inóculo más adecuado para la producción de plántulas en A. religiosa.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

La semilla fue recolectada en la primavera del 2006, bajo polinización abierta en el Ajusco, México. Se usó el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo, donde la semilla fue lavada con detergente y enjuagada con agua corriente; después se colocó en etanol al 70 % durante un minuto.

Desinfección

Los tratamientos fueron a) H₂O₂ al 3 % (v/v) y se agitó 24 h en Orbit Shaker, b) C₂H₅OH al 70 % (v/v) durante 1 min, c) NaOCl al 3, 5 y 10 % (v/v) durante 5, 15 o 20 min y d) agua desionizada estéril. Se lavó tres veces con agua estéril. La sala de incubación a 28.05 µMm^–2s^–1 (lámpara fluorescente DURO–TEST, Slim Line 75W), fotoperíodo: 16 h luz y 25 °C (±2 °C). El medio de cultivo fue Murashige y Skoog (1962) al 50 % con 0.60 µM de tiamina, 277 µjM de inositol, ácido cítrico y ácido ascórbico a un pH de 5.7 ±1; se esterilizó por 20 min y la cristalería y material durante 40 min a 120 °C y 1.5 kg·cm^–2. Se contaron semillas contaminadas y necrosadas a los 32 días.

Prueba de inóculo

Los inóculos evaluados fueron a) semilla completa, b) embriones aislados completos, c) embriones cortados en mitades (corte transversal), d) cotiledones y e) primeras hojas verdaderas de plántulas germinadas in vitro. Se cultivaron en las condiciones mencionadas. A los 14 días se contabilizaron los inóculos vivos.

Para ambos estudios el diseño fue completamente al azar con 20 repeticiones (cajas Petri con 10 semillas cada una). Los datos se transformaron [x'=(x+0.5)^–2] para el análisis de varianza. Las medias se compararon con la prueba de Diferencia Mínima Significativa (DMS).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Desinfección

El H₂O₂ mostró la menor cantidad de semillas contaminadas y necrosadas. En el caso de NaOCl, a mayor concentración y tiempo de exposición, menor incidencia de hongos y bacterias, pero aumentaron las semillas necrosadas por toxicidad (DMS, P<0.05) (Cuadro 1).

El H₂O₂ es eficaz en la desinfección de semilla forestal en Pseudotsuga menziesii (Dumroese et al., 1988) y en Pinus ponderosa reduce niveles de Fusarium (James y Genz, 1981). El H₂O₂ incrementa la germinación en Pinus spp. porque ablanda la testa y aumenta la permeabilidad (Barnett, 1998). El H₂O₂ es más oxidativo que el cloro o ClO₂ (Barnett, 1998), se degrada en agua (ATSDR, 2004) y libera O₂ y H₂O, sin residuos tóxicos (Barnett, 1998). El H₂O₂ es bactericida, viricida y fungicida (HRM, 1993) y las bacterias no tienen enzimas para degradarlo (láñez, 1998). La agitación minimiza la demanda química del O₂ (Sánchez, 2004) y reduce la infección bacteriana (Riofrío, 2004).

Grahsl et al. (1991) desinfectaron semilla de Abies alba en una solución de NaOCl durante 24 h, los embriones aislados pasan a una inmersión de CH₃OH con ácido ascórbico. El C₂H₅OH y NaOCl también fueron efectivos para desinfectar semilla de Agave parrasana (Santacruz et al., 1999) y A. victoriae–reginae (Martínez et al., 2003). El cloro es eficaz en la mayoría de las bacterias patógenas, pero es imprevisible contra hongos y virus (HRM, 1993); el cloro oxida el material celular (EPA, 1999). El C₂H₅OH actúa desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas y como agente deshidratante; es letal para bacterias, irregular para hongos y virus e inocuo sobre esporas; al combinarlo tiene mayor acción germicida (Mateos, 2004).

Para una desinfección externa de la semilla García et al. (1994) remojaron semilla de Pinus pinea en C₂H₅OH al 70 % durante 2 min y HgCl al 0.3 % por 15 min. Se ha desinfectado con C₂H₅OH y HgCl en Pinus spp. (Tang y Ouyang, 1999).

Prueba de inóculo

A los 14 días después de la siembra, los únicos inóculos vivos fueron la semilla completa y primeras hojas verdaderas de plántulas germinadas in vitro. La semilla iniciaba el proceso de germinación. Los otros inóculos se necrosaron (DMS, P<0.05) (Cuadro 2).

La regeneración de plantas en especies forestales vía embriogénesis somática y organogénesis está progresando. Se ha obtenido la regeneración de órganos y embriones a partir de semilla en Abies alba (Schuller et al., 1989; 2000), A. fraseri (Guevin y Kirby, 1997), Acer pseudoplatanus (Grahsl et al., 1991), Picea abies, (Verhagen y Wann, 1989), P. sitchensis (Drake et al., 1997), Pinus pinea (García et al., 1994), P. radiata (Schestibratov et al., 2003), P. taeda (Tang y Ouyang, 1999; Niella y Rocha, 2004), Quercus glauca y Q. leucotrichophora (Purohit et al., 2002).

Los inóculos comúnmente usados para promover la regeneración de coníferas son ricos en almidón, como cotiledones, hipocótilos y embriones (Roca y Mroginski, 1991). En coníferas, la principal fuente de inóculo para la inducción de callo son embriones aislados de semilla, ya que poseen un potencial embriogénico mayor comparado con cualquier otra parte de la planta adulta. Grahsl et al. (1991) utilizaron hipocótilos aislados de semillas, y Schuller et al. (1989) embriones cortados longitudinal y transversalmente. Cotiledones de P. pinea se usaron para inducción de yemas (García et al., 1994). Pero los embriones aislados no fueron un buen inóculo en A. religiosa (DMS, P<0.05).

Sin embargo, se requiere seguir evaluando inóculos en estructuras de individuos adultos (David, 1987), que puedan ser valorados forestalmente y propagarse masivamente in vitro los individuos sobresalientes.

 

CONCLUSIONES

El mejor tratamiento para desinfectar la semilla de A. religiosa es sumergirla en H₂O₂ (3 % v/v) y agitar 24 h. Los mejores inóculos para la propagación in vitro fueron la semilla completa y en segundo lugar las primeras hojas primarias.

 

AGRADECIMIENTOS

A CONAFOR y CONACYT (CONAFOR–2002–C01–6181).

 

LITERATURA CITADA

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