Ubicación del experimento

El trabajo de investigación se realizó en Laboratorio de Microbiología del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN) ubicada en Calzada Antonio Narro 1923, Buenavista, 25315 Saltillo, Coahuila, México.

Material biológico

Las cepas de las bacterias antagonistas fueron proporcionadas por el cepario de Microbiología del Departamento de Parasitología de la UAAAN, las cuales consistieron en tres aislados del género Bacillus spp (B15, BITV y BIBT) y un aislado de Pseudomonas sp (Pd) recuperado de raíz de zacatón (Muhlenbergia macroura). Los aislados se reactivaron y purificaron en Agar nutritivo (AN) y se incubaron a 28 ± 2 °C por 72 h.

Los aislamientos de Bacillus spp y de Pseudomonas sp se identificaron molecularmente con base en la secuenciación del gen 16S del DNAr. Los genes se amplificaron con el usó de un termociclador Verity para PCR de punto final (Applied Biosystems) (^{Jang- Jih et al., 2000}) en las instalaciones del Laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental (LANBAMA) ubicado en San Luis Potosí, México. Adicionalmente las especies ya habían sido caracterizadas morfológicamente al microscópio compuesto y por pruebas bioquímicas.

El aislamiento de los fitopatógenos se realizó de muestras de plántulas de chile serrano de 30 días de cultivo, con síntomas de “Damping off” y procedentes de invernaderos de la región agrícola de Parras de la Fuente, Coahuila, México, durante el verano del año 2019. Para el aislamiento de los hongos fitopatógenos, se eliminó los residuos de sustrato del cepellón, se lavó la planta completa con agua potable en condiciones asépticas, se cortaron pequeños trozos de raíces y tallos con bisturí estéril y se desinfectaron en una solución de NaClO al 1 % por 3 min, se lavó por tres ocasiones con agua destilada estéril por 1.30 min y se dejó secar dentro de una campana de flujo laminar sobre papel estraza estéril. Una vez secos se transfirieron a cajas Petri con Medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA) o V8-Agar (V8-A) y se incubaron a 26 ± 2 °C por 3 días, al observar crecimiento de micelio, este se transfirió a Agar Agua (AA) por 48 horas y se purifico por punta de hifa en cajas Petri con PDA y V8-A.

Prueba de patogenicidad

Se utilizó la técnica empleada por ^{Sánchez et al. (1975}) y modificada por ^{Espinoza-Ahumada et al. (2019}), para ello se germinaron en medio AA 50 semillas de chile hibrido Platino, que se desinfectaron por 3 min en una solución de NaClO al 1 % y lavaron en agua destilada estéril en tres ocasiones. A los 5 días después de la siembra, una vez que desarrollaron el hipocótilo, se transfirieron en grupos de tres semillas a cajas Petri con medio de cultivo AA, cuando se observó el desarrollo de raíz y cotiledones (dos días después), se inoculó en el centro de las cajas Petri un explante de cultivo de 3 mm de diámetro con micelio del fitopatógeno purificado. Las cajas Petri se incubaron a 26 ± 2°C con un fotoperiodo de 12:12 (luz: obscuridad). Para determinar la patogenicidad se evaluó la mortalidad de las plántulas, por nueve días, para ello se utilizó una escala visual de severidad descrita por ^{Apodaca et al. (2004}) con modificaciones, donde; 0 = sin síntomas planta sana, 1 = puntos pequeños necróticos en la raíz o en cotiledones, 2 = necrosamiento en la base de la raíz, 3 = raíz necrosada hasta en un 50 %, 4 = raíz o planta completamente necrosada. Los datos obtenidos se analizaron a través de un análisis de varianza (ANOVA) para estratificar los tratamientos a través de una comparación de medias por Tukey (p ≤ 0.05) y bajo un diseño completamente al azar con dos tratamientos (1 = Pythium aphanidermatum, 2 = Fusarium oxysporum), un testigo absoluto y tres repeticiones.

Determinación del antagonismo In vitro

Este se realizó mediante la técnica de confrontación dual entre antagonista y fitopatógeno en placas con Agar Nutritivo Caldo de Papa (ANCP), para ello las cajas fueron marcadas en cuatro puntos equidistantes cardinales, en cada uno se colocó una asada de cada cepa antagonista, después de 24 o 72 horas se colocó un explante en forma de disco con micelio de cada fitopatógeno por separado y se incubaron a 26 ± 2 °C, hasta que el micelio del testigo lleno por completo la caja de cultivo. El experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar con 4 tratamientos (B15, BITV, BIBT y Pd) y un testigo, con 4 repeticiones por tratamiento para cada fitopatógeno (Fusarium y Pythium). Se midió el crecimiento radial del fitopatógeno (mm) en confrontación con cada cepa bacteriana, este se transformó a porcentaje de inhibición (%I), usando la formula %I= (C-T)/Cx100 descrita por ^{Castillo- Reyes et al. (2015)}, donde C es el diámetro del testigo y T es el tratamiento. Los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANVA) y una prueba de comparación de medias de Tukey (p ≤ 0.05), con el programa estadístico InfoStat versión 2019.1.2.0.

Identificación y caracterización de Bacillus spp y Pseudomonas sp

Las especies bacterianas se identificaron con base a su secuenciación del gen 16S del rRNA. Las especies del género Bacillus denominadas B15, BITV y BIBT mostraron una similitud del 91.91, 98.36 y 96.15 % con la especie B. subtilis con claves de acceso al genbank de MK616213.1, MH619505.1 y KY010584.1 respectivamente. Aunque la cepa B15 coincide con un porcentaje del 91.91 % con la especie B. subtilis este porcentaje se considera bajo, además, esta cepa en estudios anteriores presentó un porcentaje más alto (94.12 %) de similitud con la especie Bacillus pumilus al realizársele pruebas morfológicas y bioquímicas (^{Ordaz, 2004}), por lo que la identificación morfológica y bioquímica es más aceptable. Las tres cepas (B15, BITV y BIBT) presentaron forma típica de bacilo doble con producción de endospora (Figura 1A, B y C), tinción Gram+ y catalasa positiva (^{Sosa et al., 2005}).

Por su parte la bacteria del género Pseudomonas mostró una similitud de un 96.12 % con la especie Pseudomonas donghuensis con clave de acceso MK883145.1. Dicha bacteria aislada de raíz de M. macroura y por siembra en estría en Agar fosfatos (NBRIP) (^{Flores et al., 2014}) presentó formación de colonia amarilla translucida característica del género Pseudomonas spp. Al inicio el aislamiento presentó irregularidad para solubilizar el fosfato tricalcico. Esta bacteria se presentó en forma de bacilo vegetativo individual o en pares, no esporulada (Figura 1D), Gram- (Figura 1E) con flagelos polares y catalasa positiva. En AN a las 48h de incubación sus colonias generan un pigmento amarillo (Figura 1F), mientras en medio King B no producen fluorescencia y sus colonias muestran bordes irregulares. ^{Gao et al. (2012}) reportaron por primera vez a esta especie de Pseudomonas la cual denominaron como Pseudomonas HYS, posteriormente, ^{Gao et al. (2015)} la clasificaron como una nueva especie la cual denominaron P. donghuensis aislada de agua del Lago Donghu de Wuhan en China, otros investigadores reportan su aislamiento de la rizosfera de tomate (^{Ossowicki et al., 2017}), algodón (^{Tao et al., 2020}) y suelo agrícola (^{Ágaras et al., 2018}). Las características presentadas por P. donghuensis aislada en esta investigación son similares a las descritas por ^{Ágaras et al. (2018)} para la especie P. donghuensis SVBP6, pero diferentes a las reportadas por ^{Gao et al. (2015)} los cuales señalan que P. donghuensis HYS desarrolla fluorescencia en agar King A y B, mientras que nuestra cepa no produjo florescencia en medio King B al igual que la reportada por ^{Ágaras et al. (2018)}.

Identificación de las especies causantes de “Damping off”

De las plántulas de chile se aisló un hongo y un oomyceto responsables de “Damping off”. El hongo fitopatógeno mostró hifas septadas, clamidosporas globosas (Figura 2Aa), fialides cortas (Figura 2Ab) donde se insertan microconidias bicelulares en forma de riñón (Figura 2Ba), macroconidias curvas en forma de canoa de tres (Figura 2Bb y Cb) o cuatro septas (Figura 2Ca), con célula pie (Figura 2Bc), además de la formación de esporodoquio (Figura 2D). Estas características morfológicas microscópicas observadas correspondieron al género F. oxysporum según las claves taxonómicas especializadas de ^{Leslie y Summerell (2006}).

La identificación y reporte del oomyceto correspondió a Pythium aphanidermatum, dicho trabajo se publicó anteriormente a esta investigación y se reporta como una cepa agresiva y de crecimiento rápido para provocar “Damping off” (^{Jiménez-Pérez et al., 2022}). Se comprobó que las hifas fueron toruloides cenocíticas (Figura 3Aa), oogonios terminales esféricos lisos (Figura 3Aa, Ba), oósporas apleroticas (Figura 3Bb), anteridios diclinos o monoclinos (Figura 3Ac, Bc), y esporangios filamentosos e irregulares (Figura 3Ca), tal y como se observan en la Figura 3 (^{Van der Plaats-Niterink, 1981}; ^{Watanabe, 2010}; ^{Jiménez-Pérez et al., 2022}).

Figura 1 Características morfológicas de Bacillus subtilis y Pseudomonas donghuensis. A, B y C) células vegetativas y producción de endoesporas de B. subtilis (A- B15, B- BITV y C- BIBT). D) P. donghuensis células vegetativas, B) tinción Gram. C) colonia bacteriana en medio de cultivo AN. 

Figura 2 Observación microscópica de Fusarium oxysporum. A) a- Clamidospora globosa y b- Fialides, B) a- Microconidias, b- Macroconidia de 3 septos y c- célula pie. C) a- Macroconidias de 4 septos y b- de 3 septos. D) Esporodoquio. 

Figura 3 Observación microscópica de P. aphanidermatum. A) a- hifas toruloides cenocíticas, b- oogonio y c- anteridio, B) a- oogonio, b- oóspora aplerotica y c- anteridio. C) a- esporangios. 

Prueba patogenicidad

En la prueba de patogenicidad, las plántulas chile inoculadas con explante de cultivo con micelio de F. oxysporum (Figura 4B) a los cuatro ddi causaron puntos necróticos en la raíz, que se desarrollaron y crecieron hasta necrosar por completo las plántulas a los nueve ddi, además, se detectó crecimiento abundante de micelio blanco que cubría por completo a las plántulas, por lo cual ocasiono el 100 % de la mortalidad de las plántulas (Figura 4E). En plántulas de chile inoculadas con P. aphanidermatum (Figura 4C), a los tres ddi mostraron necrosis, raíces colonizadas por micelio, los cotiledones con manchas necróticas y a los cinco ddi las plántulas mostraron abundante crecimiento de micelio, ocasionando el 100 % de la mortalidad de las plántulas (Figura 4F). En testigos se observó crecimiento de raíz, tallo y cotiledones normal, sin signos o síntomas de necrosis (Figura 4A-D). De acuerdo a la escala de severidad de ^{Apodaca et al. (2004}) el nivel de daño observado en los cotiledones, hipocótilo y raíz de las plántulas inoculadas con P. aphanidermatum y F. oxysporum es del más alto nivel (4), ya que fueron causantes la muerte de las plántulas, mientras que en los testigos no hubo daños. Por ello se comprueba que las especies P. aphanidermatum y F. oxysporum fueron agentes causales del “Damping off” y muerte de plántulas de chile.

Los resultados de este estudio coinciden con los reportes de otros autores, sobre la capacidad de estos fitopatógenos para causar “Damping off”, como ^{Gravel et al. (2005}) que reportaron a P. aphanidermatum y P. ultimum como agentes etiológicos del “Damping off” y pudrición de semillas en plántulas de tomate, al igual que ^{González et al. (2013}), que reportan a los fitopatógenos Pythium y Fusarium en almácigos de tomate. Mientras que ^{Sánchez et al. (2015}) reportan a F. oxysporum como agente causal del “Damping off” en almácigos de cebollas. De manera similar ^{Rivera-Jiménez et al. (2018}) reportaron que F. oxysporum causó la muerte de un 49.54 % de plántulas de chile poblano en 30 días de la prueba en condiciones de invernadero, en contraste con este trabajo que se realizó en condiciones in vitro y donde provocó una mayor mortalidad de plántulas en menor tiempo (9ddi).

Figura 4 Prueba de patogenicidad. A) Tratamiento testigo. B) Tratamiento inoculado con F. oxysporum. C) Tratamiento inoculado con P. aphanidermatum. D) Tratamiento testigo a los nueve ddi. E) Tratamiento inoculado con F. oxysporum a los nueve ddi. F) Tratamiento inoculados con P. aphanidermatum a los cinco ddi. 

Determinación del antagonismo In vitro

En las confrontaciones de F. oxysporum con cepas de Bacillus subtilis y P. donghuensis, se encontró diferencia estadística significativa (p ≤ 0,05) en el porcentaje de inhibición. Todas las cepas de Bacillus mostraron capacidad inhibitoria, siendo B. subtilis (BITV) la de mayor eficiencia para inhibir el crecimiento micelial de F. oxysporum, en un 56.24 % (Fig. 5- C), seguida de B. subtilis (BIBT) con 49.62 % (Figura 5A) y el aislado de B. subtilis (B15) con la menor inhibición (39.35 %) (Figura 5B). La cepa de P. donghuensis (Pd) no inhibió el crecimiento de F. oxysporum (Figura 5D) durante los seis días que duró el experimento, tiempo que tardo el testigo en crecer en toda la placa de cultivo (Figura 5E) (Tabla 1).

Figura 5 Antagonismo in vitro de las diferentes cepas de Bacillus spp., en contra de F. oxysporum a los seis días de confrontación en comparación con el testigo. A) BIBT, B) B15, C) BITV, D) Pd. y E) Testigo. 

Para las confrontaciones contra P. aphanidermatum los tratamientos se realizaron 72 horas antes de inocular el fitopatógeno, pues este oomiceto mostró un crecimiento micelial muy rápido al desarrollarse en toda la caja de cultivo en solo 32 horas de incubación (Figura 6E). A diferencia del ensayo de F. oxysporum ninguna de las cepas de B. subtilis mostró inhibición contra este oomyceto (Figura 6A-C), solo la cepa de P. donghuensis inhibió en un 56 % el crecimiento micelial del P. aphanidermatum (Figura 6D) (Tabla 2).

Figura 6 Antagonismo in vitro de las diferentes cepas contra P. aphanidermatum a las 32 horas después de la confrontación. A) BIBT, B) BITV, C) B15, D) Pd, y E) Testigo. 

Existen diversos estudios que demuestran la capacidad antagónica del género B. subtilis en contra de diversos fitopatógenos, por ejemplo, ^{Mejía- Bautista et al. (2016}) reportan rangos de inhibición variados (21.28- 71.70 %) en contra de dos cepas de Fusarium (F. equiseti y F. solani) en confrontación con 10 cepas de Bacillus spp (4- B. subtilis, 1- B. cerus, 1- B. amyloliquefaciens y 4- Bacillus spp) siendo las cepas de B. subtilis CBMT51 y CBRF8 las de mayor actividad inhibitoria con porcentajes de inhibición del 71.70 % y 69.92 % en contra de F. equiseti y F. solani respectivamente, mientras que en esta investigación se obtuvieron rangos de inhibición del 39.35 al 56.24 % con las tres cepas de Bacillus en contra de F. oxysporum. ^{Khedher et al. (2020}) reportaron la inhibición de F. oxysporum del 54.7 % utilizando a B. subtilis, siendo este resultado similar al obtenido en este trabajo (56.24 %) utilizando la cepa de B. subtilis (BITV). Por su parte ^{Sosa et al. (2005}) confrontando 17 cepas de Bacillus spp, demostraron su capacidad inhibitoria en contra de diversos fitopatógenos, siendo P. aphanidermatum uno de ellos, contrastando con nuestra investigación donde ninguna de las tres cepas de Bacillus logro inhibir al oomyceto a las 32 h que duro el experimento a diferencia del trabajo de ^{Sosa et al. (2005)} el cual la cepa de P. aphanidermatum presento un crecimiento lento de 72 h para llenar la caja Petri. Algunos autores mencionan que la inhibición generada por Bacillus spp se debe a la capacidad de síntesis de algunos antibioticos (Iturina A y surfactina) y enzimas líticas (^{Asaka & Shoda, 1996}; ^{Sosa et al., 2005)}

Los resultados obtenidos con P. donghuensis respaldan lo propuesto por ^{Gao et al. (2015}) quienes sugieren a esta especie como candidata para control biológico por su alta capacidad de síntesis de sideroforos, la cual es mayor que otras cepas (^{Gao et al., 2012}). Existen reportes del antagonismo de P. donghuensis en contra de algunos fitopatógenos, por ejemplo, ^{Ossowicki et al. (2017}) reportan la inhibición del crecimiento de Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum, Verticillium dahliae y Pythium ultimum con la cepa de P. donghuensis P482. Esta misma cepa (P482) también demostró tener efectividad contra bacterias como; Dickeya solani y Pseudomonas syringae pv. syringae (^{Matuszewska et al., 2021}). ^{Tao et al. (2020}) inhibieron a V. dahliae con la cepa P. donghuensis 22G5. De manera similar, ^{Muzio et al. (2020}) reportaron la inhibición de Macrophomina phaseolina por P. donghuensis SVBP6. Los autores citados atribuyen la capacidad antagonista de P. donghuensis a su alta capacidad de síntesis sideroforos especialmente del 7-hidroxitropolona un sideróforo no fluorescente, no reportado en otras especies de Pseudomonas. En la actualidad aún son pocos los estudios realizados con esta especie de Pseudomonas en contra de hongos fitopatógenos, teniéndose solamente reportes con las cepas mencionadas anteriormente denominadas P482, 22G5 y SVBP6, tal es el caso que en la actualidad no se encuentran resultados de una cepa de P. donghuensis capaz de inhibir a P. aphanidermatum y sin actividad inhibitoria en contra de F. oxysporum como se demostrado en este trabajo.