texto en 
Inglés (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
Introducción
Colletotrichum gloeosporioides (Penz & Sacc.), es considerado un patógeno importante que afecta diversos frutos tropicales y subtropicales (Gutiérrez-Martínez et al, 2017), algunos de los más afectados son: la guanábana (Annona muricata L.) (Ramos-Guerrero et al., 2018), el mango (Mangifera indica L.) (Gutiérrez-Martínez et al., 2017), la papaya (Carica papaya Penz. & Sacc.) (Molina-Chaves et al., 2017) y el aguacate (Persea americana Mill.) (Rodríguez-López et al., 2009). La falta de protocolos en el manejo postcosecha puede favorecer infecciones por este hongo, provocando pérdidas de frutos que oscilan entre el 10 y el 50 % de la producción total (Torres-Calzada et al., 2013). Convencionalmente, el uso de fungicidas como el Benomilo, es una de las principales estrategias para reducir las infecciones fúngicas por C. gloeosporioides, sin embargo, se ha reportado resistencia al efecto de estos compuestos (Ali & Mahmud, 2008). Por otro lado, los consumidores son conscientes de la residualidad de estos compuestos químicos en el medio ambiente y su impacto negativo en la salud humana (Abd-Elsalam et al., 2019). Por las razones antes mencionadas, es necesario buscar tratamientos alternativos que sean amigables con el ambiente, seguros y efectivos. En este sentido, el quitosano, es un biopolímero policatiónico, no tóxico, con la capacidad de formar un recubrimiento comestible, evaluado en el control de diversos hongos aislados de diversos frutos tropicales y subtropicales como: C. gloeosporioides, Rhizopus stolonifer (guanábana) (Ramos-Guerrero et al., 2018), Colletotrichum sp. (mango) (GutiérrezMartínez et al., 2017), Botryosphaeria sp. (pera) (Wang et al., 2017) y Penicillium digitatum Pers. y Penicillium italicum Pers. (cítricos) (Al-Sheikh & Yehia, 2016). A su vez se evaluaron nanocompuestos de silicatoquitosano frente a moho gris (Botrytis cinerea) en uvas de mesa (Youssef et al., 2019). El silicato de sodio es considerado un compuesto GRAS (Palou, 2018), la eficacia de este compuesto se ha reportado contra Alternaria alternata (melón) (Bi et al., 2006), Monilinia fructicola (melocotón) (Pavanello et al., 2016) (cítricos) (Li et al., 2019), Musicillium theobromae (plátano) (Youssef et al., 2020) con buenos resultados. El objetivo de esta investigación fue evaluar la efectividad del quitosano y el silicato de sodio aplicados de manera individual y combinados a diferentes concentraciones sobre el crecimiento micelial y la esporulación de C. gloeosporioides. Además, mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) se observó el efecto de los tratamientos sobre las hifas del hongo.
Material y Métodos
Materias primas
El quitosano se adquirió en America Natural Ingredients® (grado alimenticio, DAC 90 %, viscosidad 50-200 mpa s-1) y el silicato de sodio se compró en Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO, USA). Se utilizó agar papa dextrosa (Sigma-Aldrich®, EE. UU.) para la incorporación del quitosano y silicato de sodio en el ensayo in vitro.
Aislamiento de C. gloeosporioides
El hongo utilizado en este trabajo se obtuvo de una cepa identificada en trabajos anteriores, se reactivó inoculando frutos y posteriormente se realizó su identificación macro y microscópica con ayuda de claves dicotómicas.
Preparación de soluciones de silicato de sodio y quitosano
Se prepararon soluciones de quitosano a concentraciones de 0.1 %, 0.5 %, 1 % y 1.5 % (p/v) de quitosano en 100 mL de ácido acético glacial al 2 % (v/v). La solución se mantuvo en agitación constante de 3 a 5 horas a temperatura ambiente y se ajustó el pH a 5.6 mediante la adición de NaOH (1N) (González-Estrada et al., 2020). Las soluciones de silicato de sodio se prepararon utilizando el protocolo propuesto por Ge et al. (2017) con algunas modificaciones, las soluciones se prepararon agregando 0.5 %, 1 %, 1.5 % y 2 % de silicato de sodio en 100 mL de agua destilada (v/v). La técnica propuesta por Guo et al. (2019) se utilizó para la preparación de los tratamientos combinados con algunas modificaciones, en soluciones de quitosano previamente preparadas (100 mL) a concentraciones de 0.1 %, 0.5 %, 1 % y 1.5 %, se agregó silicato de sodio a diferentes concentraciones (0.5 %, 1 %, 1.5 % y 2 %), los tratamientos combinados se estabilizaron (pH de 5,6) con una solución de NaOH (1N). El control positivo consistió en una solución de ácido acético al 2 % (pH 5.6) y un control negativo consistió en medio de cultivo PDA sin tratamiento.
Ensayos in vitro
Inhibición del crecimiento micelial
La medición radial del crecimiento micelial del hongo se realizó siguiendo el protocolo propuesto por Gutiérrez-Martínez et al. (2017) con algunas modificaciones, se inocularon con el hongo placas Petri que contenían el quitosano (CHI), silicato de sodio (Na2SiO3) y los tratamientos combinados de PDA CHI-Na2SiO3 colocando discos de PDA (3 mm de diámetro) con el micelio del hongo (n= 3, por duplicado). El desarrollo del crecimiento micelial se registró utilizando un vernier digital (Truper®). Los resultados se expresaron en porcentaje de inhibición.
Efectos en la esporulación
Para la esporulación se siguió el protocolo propuesto por Cortés-Rivera et al. (2019), se añadió agua destilada estéril (10 mL) en las placas de Petri empleadas en la prueba de crecimiento micelial que contenía el hongo, luego se frotó la colonia del hongo utilizando una barra de vidrio estéril, la solución obtenida se filtró con una gasa estéril y se transfirió tubos de 10 mL. Finalmente, se utilizó una cámara de Neubauer (Hausser Scientific®) para determinar el número de esporas/mL.
Evaluación de la interacción de mezclas de quitosano y silicato de sodio
La interacción de la combinación de tratamientos se realizó empleando el método de Abbott, con el protocolo propuesto por De Oliveira et al. (2017), considerando factores como la concentración, el efecto de la aplicación individual de los tratamientos y su combinación así como el tipo de interacción. Se utilizó la siguiente fórmula:
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Se seleccionaron los tratamientos más efectivos para observar su efecto sobre el desarrollo de C. gloeosporioides mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Seguimos el método descrito por Ramos-Guerrero et al. (2018) (Annona muricata con algunas modificaciones, de cada tratamiento se cortaron muestras de discos miceliales (3 mm) y se colocaron en viales de vidrio que contenían 3 mL de solución de Karnovsky (pH 7.4) durante 24 h a 4 °C, las muestras se agitaron siete veces manualmente durante las primeras 7 horas y finalmente las muestras se dejaron en refrigeración hasta completar las 24 h.
Análisis estadístico
Para la aplicación individual de los tratamientos se aplicó un diseño de bloques completamente al azar. Se aplicó el modelo lineal generalizado para conocer la cinética de crecimiento del patógeno durante los días de incubación de los tratamientos combinados. Cada experimento se repitió dos veces. Los datos obtenidos se analizaron mediante un ANOVA (análisis de varianza) y se aplicó una prueba de Tukey (p ≤ 0.05) para la comparación de medias utilizando el software Statistica 10®.
Resultados y Discusión
Ensayo de inhibición micelial
La aplicación de los tratamientos con quitosano mostró un porcentaje de inhibición que oscilo entre el 9799 % del crecimiento micelial de C. gloeosporioides (Figura 1). De acuerdo al análisis estadístico, se obtuvieron diferencias significativas (p ≤ 0.05) con respecto a los tratamientos de silicato de sodio, el control positivo y el control negativo (Tabla 1). La eficacia del quitosano se debe a la interacción de los grupos amino libres con las estructuras del patógeno y no por la presencia de ácido acético, la estabilización del quitosano a pH (5.6) evita la actividad antifúngica del ácido acético presente en la solución de quitosano, previamente reportado (Hassan et al., 2012; Kang et al., 2003; Narendranath et al., 2001). En este sentido, con la aplicación de ácido acético solo se obtuvo un 11 % de inhibición del crecimiento micelial. Una de las principales características fisicoquímicas del quitosano es su propiedad catiónica al generar atracciones electrostáticas, induciendo cambios en la permeabilidad de la membrana plasmática desestabilización de las funciones vitales del patógeno, previamente reportado (Gutiérrez-Martínez et al., 2018; Rahman et al., 2014; Ramos-Guerrero et al., 2018). Los tratamientos de silicato de sodio mostraron resultados desfavorables en el control del desarrollo del hongo (Figura 1). Solo se obtuvo inhibición del crecimiento micelial del 9 % (Tabla 1). Estos resultados no concuerdan con los reportados por Ge et al. (2017) y Bi et al. (2006). Ambos autores reportaron efectividad fungicida mediante la aplicación de silicato de sodio (100 mM) contra los hongos T. roseum y A. alternata, respectivamente. Sin embargo, los cambios morfológicos en el desarrollo de las hifas fueron evidenciados por SEM (Figura 3D), el silicato de sodio parece causar deshidratación de las hifas como parte de su mecanismo fungistático, que se basa en la modificación del pH en el medio (haciéndolo más alcalino) provocando alteraciones en la membrana plasmática y orgánulos desorganizados, previamente reportado (Niu et al., 2016).
Figura 1 Efecto silicato de sodio y quitosano a diferentes concentraciones en el crecimiento micelial de C. gloeosporioides a los 10 días de incubación (27 ± 2 °C).
Tabla 1 Efecto de la aplicación de silicato de sodio y quitosano en el porcentaje de inhibición y esporulación de C. gloeosporioides incubado durante 10 días a 27 ± 2 °C.
| Treatments | Mycelial growth (% of inhibition) |
Sporulation (spores*106/mL) |
|---|---|---|
| Negative control | 0 ± 0 a | 3.5 ± 2.86 e |
| Control | 11.39 ± 10.67 a | 0.4 ± 0.83 abc |
| Chitosan 0.1 % | 99.3 ± 0.06 b | 0 a |
| Chitosan 0.5 % | 99.3 ± 0.15 b | 0 a |
| Chitosan 1 % | 99.3 ± 0.17 b | 0 a |
| Chitosan 1.5 % | 99.3 ± 2.02 b | 0 a |
| Sodium silicate 0.5 % | 9.87 ± 7.83 a | 2.6 ± 0.44 abc |
| Sodium silicate 1 % | 9.42 ± 4.36 a | 0.6 ± 2.00 c |
| Sodium silicate 1.5 % | 7.65 ± 0.55 a | 0.9 ± 2.30 d |
| Sodium silicate 2 % | 4.07 ± 0.66 a | 2.7 ± 2.86 de |
Los datos en la misma columna seguidos de diferentes letras minúsculas son significativamente diferentes (p ≤ 0.05) según la prueba de Tukey. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n=3).
Figura 2 Efecto de la combinación de silicato de sodio y quitosano en el desarrollo micelial de C. gloeosporioides durante 10 días de incubación (27 ± 2 °C).
Figura 3 Micrografías de C. gloeosporioides en contacto con los diferentes tratamientos magnificado a 1000x, bar= 200 µm. A) Control negativo, B) Control (ácido acético 2 %), C) Quitosano 1 %, D) Silicato de sodio 0.5 %, E) Quitosano 0.5 % + Silicato de sodio 1.5 % y F) Quitosano 1 % + Silicato de sodio 0.5 %.
La combinación de tratamientos así como la concentración evaluada mostraron un efecto significativo (p < 0.05) sobre el desarrollo micelial del hongo en comparación con el control y el control negativo (Tabla 2). Según el índice de Abbott (Tabla 3), las combinaciones de estos tratamientos muestran un efecto aditivo en todas las concentraciones evaluadas, estos resultados concuerdan con la investigación de Guo et al. (2019), en su estudio el efecto aditivo se obtuvo mediante la combinación de quitosano y silicato de sodio mejorando la efectividad de tratamientos aplicados de manera individual al reducir la incidencia de A. alternata hasta en un 50 % en comparación con el tratamiento control.
Tabla 2 Efecto de la combinación de tratamientos de silicato de sodio y quitosano en el porcentaje de inhibición del desarrollo micelial y esporulación de C. gloeosporioides durante 10 días de incubación a 27 + 2 °C.
| Treatments | Mycelial growth (% of inhibition) |
Sporulation (spores*106/mL) |
|---|---|---|
| Negative control | 0 ± 0 a | 3.5 ± 2.86 e |
| Control (acetic acid 2%) | 11.39 ± 10.67 ab | 0.4 ±0.83 abc |
| Chitosan 0.1%+ Sodium silicate 0.5% | 75.35 ± 33.28 bc | 2.6 ± 1.67 d |
| Chitosan 0.1% + Sodium silicate 1% | 75.65 ± 32.53 bc | 0.6 ± 1.94 abc |
| Chitosan 0.1% + Sodium silicate 1.5% | 64.46 ± 43.41 abc | 0.9 ± 2.30 bc |
| Chitosan 0.1%+Sodium silicate 2% | 70.51 ± 27.26 bc | 2.7 ± 1.87 d |
| Chitosan 0.5%+Sodium silicate 0.5% | 96.26 ± 4.56 c | 0.8 ± 1.51 bc |
| Chitosan 0.5%+Sodium silicate 1% | 95.93 ± 5.28 c | 0 a |
| Chitosan 0.5% + Sodium silicate 1.5% | 99.51 ± 0.34 c | 0.1 ± 0.89 ab |
| Chitosan 0.5% + Sodium silicate 2% | 99.55 ± 0.11 c | 0 a |
| Chitosan 1% + Sodium silicate 0.5% | 99.47 ± 0.20 c | 0 a |
| Chitosan 1% + Sodium silicate 1% | 95.31 ± 4.13 c | 0 a |
| Chitosan 1% + Sodium silicate 1.5% | 99.63 ± 0.36 c | 0 a |
| Chitosan 1% + Sodium silicate 2% | 96.38 ± 4.47 ab | 0 a |
| Chitosan 1.5% + Sodium silicate 0.5% | 50.97 ± 17.32 abc | 0 a |
| Chitosan 1.5% + Sodium silicate 1% | 60.07 ± 8.70 bc | 0 a |
| Chitosan 1.5% + Sodium silicate 1.5% | 74.55 ± 6.05 c | 0 a |
| Chitosan 1.5% + Sodium silicate 2% | 99.59 ± 0.23 c | 0 a |
Los datos en la misma columna seguidos de diferentes letras minúsculas son significativamente diferentes (p ≤ 0.05) según la prueba Tukey. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n=3).
Tabla 3 Determinación de la efectividad de la combinación de tratamientos.
| Mixtures | Individual application of treatments |
Combination of treatments |
Abbott method | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MGI % Chitosan |
MGI % Sodium silicate |
MGI % observed |
MGI % expected |
AI | Effect | |
| Chitosan 0.1% + Sodium Silicate 0.5% | 99.3 | 9.87 | 75.35 | 99.37 | 0.76 | Additive |
| Chitosan 0.1% + Sodium Silicate 1% | 99.3 | 9.42 | 75.65 | 99.37 | 0.76 | Additive |
| Chitosan 0.1% + Sodium Silicate 1.5% | 99.3 | 7.65 | 64.46 | 99.35 | 0.65 | Additive |
| Chitosan 0.1% + Sodium Silicate 2% | 99.3 | 4.07 | 70.51 | 99.33 | 0.71 | Additive |
| Chitosan 0.5% + Sodium Silicate 0.5% | 99.18 | 9.87 | 96.26 | 99.26 | 0.97 | Additive |
| Chitosan 0.5% + Sodium Silicate 1% | 99.18 | 9.42 | 95.93 | 99.25 | 0.97 | Additive |
| Chitosan 0.5% + Sodium Silicate 1.5% | 99.18 | 7.65 | 99.51 | 99.24 | 1.00 | Additive |
| Chitosan 0.5% + Sodium Silicate 2% | 99.18 | 4.07 | 99.55 | 99.21 | 1.00 | Additive |
| Chitosan 1% + Sodium Silicate 0.5% | 99.26 | 9.87 | 99.47 | 99.33 | 1.00 | Additive |
| Chitosan 1% + Sodium Silicate 1% | 99.26 | 9.42 | 95.31 | 99.33 | 0.96 | Additive |
| Chitosan 1% + Sodium Silicate 1.5 % | 99.26 | 7.65 | 99.63 | 99.32 | 1.00 | Additive |
| Chitosan 1% + Sodium Silicate 2 % | 99.26 | 4.07 | 96.38 | 99.29 | 0.97 | Additive |
| Chitosan 1.5% + Sodium Silicate 0.5 % | 97.82 | 9.87 | 50.97 | 98.04 | 0.52 | Additive |
| Chitosan 1.5% + Sodium Silicate 1 % | 97.82 | 9.42 | 60.07 | 98.03 | 0.61 | Additive |
| Chitosan 1.5% + Sodium Silicate 1.5% | 97.82 | 7.65 | 74.55 | 97.99 | 0.76 | Additive |
MGI % = inhibición del crecimiento micelial (%), índice de Abbott (AI) ≥ 1.5 (sinérgico), (AI) en el rango ≥ 0.5 a 1.5 (Aditivo) y (AI) ≤ 0.5 (antagonista).
Ensayo de inhibición de la esporulación
En la prueba de esporulación, la aplicación individual de los tratamientos de quitosano, mostró el mejor desempeño con una inhibición total sobre la formación de esporas (Tabla 1). Por el contrario, los tratamientos de silicato de sodio redujeron el número de esporas del 4 al 9 % dependiendo de la concentración evaluada. Para los tratamientos combinados, incluso cuando la prueba de Abbott mostró un efecto aditivo, la concentración de quitosano parece jugar un papel clave en la eficacia de los tratamientos (Tabla 2). La combinación de quitosano al 0.1 % y silicato de sodio redujo la esporulación en un rango del 22 al 81 %. Se obtuvieron mejores resultados con las concentraciones de quitosano al 0.5 % al reducir la esporulación del 76 al 100 %. Al igual que las concentraciones de quitosano al 1 y 1.5 %, inhibiendo completamente el proceso de esporulación. Estos resultados indican que el efecto fungicida del quitosano no solo afecta el desarrollo micelial, sino que, también es capaz de inducir cambios a nivel molecular, provocando afectaciones, principalmente estructurales y morfológicas en la célula fúngica como se evidencia por SEM (Figura 3F) y previamente reportado (Sun et al., 2008; Song et al., 2016). Estos resultados son importantes debido a que una inhibición positiva en este proceso puede reducir la dispersión del hongo y evitar infecciones en hospedadores susceptibles a este patógeno.
Microscopía electrónica de barrido
Las micrografías del patógeno se muestran en la Figura 3. En el control negativo (Figura 3A) se observó micelio con aspecto sano y sin afectaciones. En el tratamiento de control (ácido acético al 2 %), se observa hinchazón y deformación de las hifas (Figura 3B), lo que implica afectaciones a nivel estructural y también una reducción en el proceso respiratorio del hongo, previamente reportado (Kang et al., 2003). Los tratamientos de quitosano (Figura 3C) mostraron un micelio compactado con reducción de tamaño, este efecto puede deberse a la interacción que causa la contracción de hifas, previamente reportado (Ramos-Guerrero et al., 2018; Berumen-Varela et al., 2015). En las micrografías del hongo expuesto al silicato de sodio (Figura 3D), en comparación con el control negativo se puede observar un efecto de deshidratación en las hifas, estas alteraciones podrían ser causadas por un daño de la membrana celular afectando su permeabilidad, previamente reportado por Wang et al. (2010). Los tratamientos combinados (Figura 3F), mostraron micelio contraído, se pueden observar múltiples deformaciones y el efecto de deshidratación, como resultado del efecto de los tratamientos.
