Obtención y pretratamiento de la materia prima

Se obtuvieron los residuos de uva (variedad merlot) y granada (variedad wonderful) en las regiones de Parras y Cuatro Ciénegas, Coahuila respectivamente. Debido a que estos residuos son perecederos, se les realizó un pretratamiento de deshidratación en una estufa de secado por convección (Biobase Biodustry BOV-T70C) a 60 °C por 24 horas. Se molieron los residuos secos de uva y granada en una licuadora convencional, y se clasificaron utilizando tamices Montinox (México) de tres tamaños, malla #8 (2.36 mm), malla #12 (1.40 mm) y malla #20 (0.85 mm). Se pesó 1 g de cada muestra vegetal, se colocó en 40 mL de agua destilada y se agitó por 20 min. Posteriormente se filtró y se recibió el filtrado en vasos con hielo, el cual fue utilizado para los posteriores análisis, considerada como muestra filtrada.

Determinación de azúcares totales

Para la cuantificación de azúcares totales (^{Dubois et al., 1956}) en el extracto, se colocaron 500 μL de la muestra filtrada en un tubo, 500 μL de fenol (Fermont, México) al 5 % y se colocó a baño de agua con hielo por 5 minutos. Con los tubos dentro del baño con hielo, se añadió lentamente y por las paredes 1000 μL de ácido sulfúrico (Jalmek, México) y se dejó reposar por 15 minutos. Para detener la reacción, se agitó suavemente y se llevó a baño caliente a 50 °C por 5 minutos. Se dejó a enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos. Se leyeron absorbancias en lector de microplacas BIOBASE EL-10 A ELISA a 470 nm. La curva de calibración se realizó utilizando glucosa (Jalmek, México) al 0.1 %.

Cuantificación de azúcares reductores

Para la determinación de azúcares reductores (^{Miller, 1959}), se adicionaron 1000 μL de la muestra filtrada, 1000 μL del DNS preparado y se llevó a baño María (Thermo Scientific), a 50 °C por 5 minutos. Se adiciono 5 mL de agua destilada, se dejó reposar por 5 minutos a temperatura ambiente. Se leyeron absorbancias en lector de microplacas BIOBASE EL-10 A ELISA a 520 nm. Para la curva de calibración se utilizó glucosa (Jalmek, México) al 0.1 %. Para la preparación del reactivo DNS, se calentaron 10 mL de agua destilada a 50 °C en un baño María (Thermo Scientific), con agitación se agregó el ácido 3,5-dinitrosalicílico (Sigma-Aldrich, U.S.A.), hidróxido de sodio (Jalmek, México), tartrato de sodio y potasio (Jalmek, México), fenol (Fermont, México) y sulfito de sodio (Fermont, México) en ese orden, se aforó con agua destilada a 100 mL, para la conservación se mantuvo en oscuridad y en refrigeración.

Análisis de compuestos antioxidantes

Para la determinación de compuestos antioxidantes (^{Molyneux, 2004}), se pesaron 100 mg de muestra y se colocaron 1.5 mL de metanol (Hycel, México) en un tubo cónico de 2 mL. Se agitó en vórtex por 20 segundos, se sonicó por 5 min y posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm por 10 minutos. Se extrajo el sobrenadante y se filtró con pirinolas de nilón de poro 0.45 micrómetros para su posterior análisis. Se preparó el 2,2-difenil-1-picrilhidrasil (DPPH; Sigma-Aldrich, U.S.A.) a una concentración de 60 % p/v. Se colocó la muestra de material vegetal y el radical DPPH en una relación 50:50. Se leyeron absorbancias en lector de microplacas BIOBASE EL-10 A ELISA a 540 nm.

Optimización del proceso de hidrólisis térmica

El proceso de optimización se realizó mediante un diseño factorial fraccionado con arreglos ortogonales, mediante el software Minitab 17.1.0. Se seleccionaron tres factores (tiempo, presión y tamaño de partícula) y se estableció una matriz ortogonal L-9 con tres niveles de variación por factor (Tabla 1).

Proceso de hidrólisis térmica

Para la hidrólisis se utilizaron 2 g de muestra de cada tamaño de material vegetal y se colocaron en bolsas Filtro para fibra (Ankom Technology F57), de porosidad 0.25 micras, junto con 500 mL de agua destilada. Posteriormente se colocaron las bolsas dentro de un reactor de presión de aluminio vaciado. Las muestras fueron clasificadas en “slurry”, haciendo referencia al bagazo de uva después del tratamiento de hidrólisis; y la fracción líquida derivada del tratamiento de hidrólisis, denominada caldo hidrolizado. A estas dos fracciones se les determinó azúcares totales. Después de haber obtenido los resultados de cada una de las muestras, se compararon y se hizo un análisis del diseño factorial, mediante el software estadístico Minitab (versión 17.1.0) para poder seleccionar los mejores valores.

Análisis estadístico

Para el procesamiento de los datos se utilizó el paquete Estadístico Minitab 17.1.0. Se realizó un análisis de varianza de medias (ANOVA) y prueba de comparación de medias Tukey (p ≤ 0.05). Los resultados muestran los valores promedio con la desviación estándar obtenida.

Análisis experimental del tratamiento de hidrólisis térmica

Los niveles evaluados experimentalmente para poder estudiar el proceso de hidrólisis térmica presentaron perfiles de calentamiento y enfriamiento con tiempos de 13±2 min y 22±2 min respectivamente. La Tabla 3 muestra los análisis de varianza efectuados para los azúcares reductores obtenidos de los tratamientos derivados del diseño ortogonal L-9. Para el hidrolizado líquido de uva, los factores tiempo, presión y tamaño de partícula en los niveles individuales evaluados, no mostraron efectos significativos (p ≤ 0.05). Sin embargo, el modelo estimado por el análisis de Taguchi logró determinar, que el mayor efecto para la liberación de azúcares reductores para el hidrolizado está dado por el tamaño de partícula, seguido por el tiempo de duración del proceso (Figura 1).

Figura 1 Efectos principales para las medias de azúcares reductores en el hidrolizado de uva. 

Para el slurry de residuos de uva los tres factores evaluados mostraron un efecto significativo para la liberación de azúcares reductores (p ≤ 0.05), siendo el tiempo el factor que más beneficia al proceso, seguido de la presión en el sistema (Figura 2).

Figura 2 Efectos principales para las medias de azúcares reductores liberados en el slurry de uva. 

En el caso del hidrolizado líquido y del slurry de los residuos de granada, los factores tiempo, presión y tamaño de partícula en los niveles individuales evaluados, no mostraron efectos significativos (p ≤ 0.05) en ambos tratamientos.

El mayor efecto para la liberación de azúcares reductores para el hidrolizado está dado por la presión en el proceso, seguido por el tiempo de duración del proceso (Figura 3); y el mayor efecto para la liberación de azúcares en el slurry, fue el tamaño de partícula, seguido del tiempo del proceso (Figura 4).

Figura 3 Efectos principales para las medias de azúcares reductores liberados en el hidrolizado de granada. 

Figura 4 Efectos principales para las medias de azúcares reductores liberados en el slurry de granada. 

La diferencia en los ANOVAs y el impacto de los factores evaluados en la liberación de los azúcares monoméricos se puede deber a las características del material vegetal. Al emplear los residuos de procesos industriales donde se requieren los azúcares como materia prima, estos carecen de azúcares hidrosolubles disponibles para extracción acuosa a bajas condiciones de tiempo y temperatura.

El análisis y optimización de las condiciones de hidrólisis térmica para los residuos de uva mostraron que las interacciones entre tiempo-tamaño y presión-tamaño presentan los mayores índices de severidad (27.41 % y 20.76 % respectivamente). Para los residuos de granada, la interacción más crítica con el 34.29 % de severidad fue la de presión-tamaño. El tamaño de partícula facilita la hidrólisis, debido a la ampliación del área de contacto, además de solubilizarse en mayor medida a tamaños más pequeños de partícula (^{Grajales Martínez et al., 2018}).

Con lo anterior, se pudo determinar las condiciones que más favorecen la liberación de azúcares reductores de hidrolizados de residuos de uva, como son: tiempo de 10 min, presión de 10 psi y tamaño de 1.40-1.70 mm; mientras que para el slurry son: tiempo de 15 min, presión de 15 psi y tamaño de 2.36-2.80 mm. Las condiciones para los hidrolizados de residuos de granada son: tiempo de 15 min, presión de 20 psi y tamaño de 1.40-1.70 mm; mientras para el slurry: tiempo de 5 min, presión de 15 psi y tamaño de 2.36-2.80 mm.

Las condiciones antes mencionadas, logran una mejor extracción del contenido de azúcares reductores (Tabla 5), lo que permite generar un valor agregado a estos residuos, y poderlos emplear como sustrato en diversos procesos para la obtención de biomoléculas o biocombustibles.

En ambos residuos vegetales, el proceso de hidrólisis logra incrementar la extracción de los azúcares reductores presentes en los vegetales, comparado con los valores iniciales de las respectivas muestras de uva y granada. La cantidad de agua absorbida en las partículas permite dar acceso a las moléculas de agua, lo que ayuda a hinchar el material vegetal, generando regiones amorfas y favorecer el proceso de hidrólisis (^{Kapoor et al., 2019}).

Los tratamientos de hidrólisis logran convertir la pared vegetal recalcitrante, conformada principalmente por lignina, en compuestos de hemicelulosa de mayor accesibilidad hacia los azúcares monoméricos. ^{Zietsman et al. (2017)} identificaron que el tratamiento térmico al que sometieron sus muestras de residuos de uva logró eliminar la pectina incrementar los carbohidratos liberados (xilano, xiloglucano, celulosa y polímeros de manano) en los sobrenadantes obtenidos. ^{Dos Santos Rocha et al. (2017)} al realizar estudios de tratamientos hidrotérmicos sobre bagazo de caña de azúcar, reportan que los tratamientos térmicos pueden remover la hemicelulosa hasta un 85 % favoreciendo la conversión de carbohidratos en oligómeros y monómeros.

Las condiciones de presión (temperatura) y tamaños de partícula evaluadas logran remover la lignina de la fase líquida (hidrolizado) siendo más evidente en los residuos de granada que en los de uva (Tabla 4). La baja cantidad de glucosa en la uva hidrolizada se puede deber a la conversión de los azúcares monoméricos iniciales en hidroximetilfurfural y furfural (^{Dos Santos Rocha et al., 2017}).

Los análisis de la capacidad antioxidante en los materiales de bagazo de uva y residuos de granada se ven relacionados con los tiempos de residencia y temperatura, debido a las características que presentan las proantocianidinas, antocianinas y flavonoides de sufrir hidrólisis conforme se incrementan los tiempos de hidrólisis (^{Petrović et al., 2016}), lo que representa una baja en su actividad antioxidante al ser sometidas a mayores tiempos y temperaturas de proceso térmico. La actividad antioxidante está ligada a los compuestos fenólicos presentes en el material vegetal y a los derivados de la degradación de la lignina por el tratamiento térmico. En el caso de los hidrolizados de uva y granada, se mostraron reducciones en el efecto antioxidante de las muestras tratadas con la termo-hidrólisis. La concentración y el tipo de compuestos fenólicos presentes en los hidrolizados dependen de las condiciones de operación (temperatura y tiempos de residencia) así como del material lignocelulósico tratado y su contenido inicial de compuestos fenólicos (^{Moure et al., 2017}).