Producción de semillas

Se estableció un semillero de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) en Motul, Yucatán. Se utilizaron semillas de la variedad Mayapán proporcionadas por el INIFAP campo experimental Mococha, se sembraron en charolas germinadoras con sustrato a base de musgo canadiense (Sunshine, Proveedora Agrícola, Guadalajara, México). A los 35 días después de la siembra (das) las plántulas se establecieron en una parcela de 200 m² en el campo experimental Mocochá del INIFAP. La distancia de siembra entre plantas fue de 0.30 m y entre filas de 1.50 m. El manejo agronómico se realizó de acuerdo a ^{Tun (2001)}.

Aproximadamente a los 45 das comenzó la floración, en esa etapa se etiquetaron las flores que estaban en antesis. Los frutos se cosecharon inmaduros (verdes), medio-maduros (pintos) y maduros (naranjas) a los 28, 35 y 40 días post-antesis (dpa), respectivamente. A una parte de los frutos cosechados se les extrajo las semillas inmediatamente (testigo: frutos sin almacenar), como tradicionalmente lo hacen los productores de plántulas de la región. Otra parte de los frutos cosechados (verdes, pintos y maduros) se almacenaron durante 7 y 14 días postcosecha, a una temperatura de 25 ± 2 °C y 60 % de humedad relativa (HR). Después del período de almacenamiento correspondiente, las semillas se extrajeron de los frutos con un descorazonador de manzanas, se desinfectaron con cloro al 2 % durante tres minutos y se enjuagaron con agua destilada tres veces. Finalmente, las semillas se secaron a la sombra hasta alcanzar un contenido de humedad dentro del rango de 6-10 % (^{SNICS, 2014}), la prueba de contenido de humedad se realizó de acuerdo a la Asociación Internacional de Pruebas de Semillas (^{ISTA, 2004}). Las semillas se almacenaron en bolsas de polietileno plateadas y se conservaron en refrigeración a 10 °C hasta su evaluación (7 días después). Los tratamientos fueron: V fruto verde sin almacenar, V7 = fruto verde almacenado 7 días, V14 = fruto verde almacenado 14 días, P = fruto pinto sin almacenar, P7 = fruto pinto almacenado 7 días, P14 = fruto pinto almacenado 14 días, M = fruto maduro sin almacenar, M7 = fruto maduro almacenado 7 días, M14 = fruto maduro almacenado 14 días.

Variables evaluadas

Todas las evaluaciones de germinación, emergencia y crecimiento se realizaron en el laboratorio de Biotecnología y Fisiología Vegetal del Instituto Tecnológico de Conkal, México.

Para determinar el contenido de humedad (MC), cinco muestras de 0.5 g de semillas de cada uno de los tratamientos se secaron en un horno de convección de aire forzado a 103 °C hasta obtener el peso seco constante (aproximadamente 17 h). El peso fresco inicial (FW) y el peso seco final (DW) se utilizaron para calcular el contenido de humedad de semillas de acuerdo al ^{ISTA (2004)} con la siguiente formula:

La conductividad eléctrica (EC) se determinó sumergiendo durante 24 horas un lote de 50 semillas en 50 mL de agua destilada desionizada a 25 °C, las lecturas se realizaron con un conductímetro (Consort C931, Debruyne Instruments, Wichelen, Bélgica). Se evaluaron cuatro repeticiones de 50 semillas por tratamiento de acuerdo a ^{Vidigal et al. (2009)}. El porcentaje de germinación (%G) se evaluó sembrando 20 semillas por caja Petri, se utilizaron cajas de 90 mm de diámetro, y como sustrato se utilizaron toallas de papel humectadas con 4 mL de agua destilada desionizada, se establecieron cinco cajas por tratamiento, cada caja representó una repetición. El cuarto de crecimiento donde se evaluó la germinación tenía una temperatura de 22 ± 1 °C, una humedad relativa de 60 % y se encontraba en total oscuridad. La germinación se contabilizó durante 14 días y se consideró una semilla germinada cuando se observó la protrusión radicular. Se utilizó la fórmula:

dónde %G = porcentaje de germinación, n = número total de semillas germinadas al final de la evaluación y N = número de semillas sembradas.

La emergencia de plántulas se evaluó en charolas germinadoras de 200 cavidades durante 7 días. Se sembraron 20 semillas por repetición y cinco repeticiones por tratamiento. Se utilizó como sustrato musgo canadiense (Sunshine, Proveedora Agrícola, Guadalajara, México). Para calcular el porcentaje de emergencia (%E) se utilizó la misma fórmula con la que se calculó el %G.

Para obtener la tasa de germinación (GR) se contabilizó la germinación durante 14 días y se calculó con la fórmula para velocidad de germinación de semillas propuesta por el ^{ISTA (2004)}:

dónde GR = tasa de germinación, ni = número de semillas germinadas durante el intervalo Ti, Ti = tiempo desde la siembra hasta el día del conteo.

Para la tasa de emergencia (ER) se contabilizó a diario el número de plántulas emergidas hasta los 7 das y se utilizó la misma fórmula con la que se calculó la GR.

La longitud de radícula se evaluó a los 7 y 14 das, se tomaron fotografías de 10 plántulas por tratamiento y se procesaron con el software ImageJ (National Institute of Health, Maryland, Estados Unidos) para calcular la longitud de la radícula.

Con los datos de longitud de la radícula se calculó la tasa de crecimiento relativa de la longitud radicular, de acuerdo a la fórmula propuesta por ^{Hunt et al. (2002)}:

dónde RGR_RL = tasa de crecimiento relativo de la longitud de la radícula; lnL1 = logaritmo natural de la longitud de la radícula a los 7 das; lnL2 = logaritmo natural de la longitud de la radícula a los 14 das; T1 = día que se efectuó la primera medición (7 das); T2 = día que se efectuó la segunda medición (14 das).

Diseño experimental y análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar, con arreglo bi-factorial, un factor fue el estado de maduración de los frutos (verdes, pintos y maduros) y otro factor el periodo de almacenamiento postcosecha de los frutos (7 y 14 días postcosecha; testigo = sin almacenar). Los datos en porcentaje fueron transformados con la raíz cuadrada de arcoseno; a todos los datos se les realizó un análisis de varianza (ANOVA, p≤0.05). Se realizó una prueba de comparación de medias (Tukey, α = 0.05) en las variables donde hubo diferencias significativas entre tratamientos. Los análisis se realizaron en el software Statistica 7 (Statsoft, Tulsa, Ok, USA).

Contenido de humedad

El contenido de humedad en las semillas de todos los tratamientos estuvo entre 6 y 10 %. De acuerdo con ^{Copeland & McDonald (2001)}, ese es el intervalo de humedad de las semillas vivas, además es el rango que establece el ^{SNICS (2014)} en todas las categorías de semillas (básicas, registrada, certificada y habilitada).

Conductividad eléctrica

La conductividad eléctrica (EC) de las semillas está asociada al flujo de solutos (aminoácidos, azúcares) y electrolitos (principalmente potasio) a través de las membranas celulares (^{Vidigal et al., 2009}). De acuerdo a la comparación de medias la EC más baja se observó en los tres estados de maduración con 14 días de almacenamiento (UR14, 0.6; HR14, 0.6; R14, 0.6 µS mL^-1) y en las semillas de frutos pintos y maduros con 7 días de almacenamiento (HR7, 0.6; R7, 0.6 µS mL^-1); los valores de conductividad eléctrica más altos fueron en las semillas de frutos verdes sin almacenar (UR, 1.5 µS mL^-1) (Figura 1). Valores bajos de conductividad eléctrica en semillas es un indicador de membranas celulares estables, con menor flujo de solutos y electrolitos (^{Powell, 1986}), es decir, son semillas con mayor vigor, germinación y viabilidad. Bajo este contexto, las semillas de los frutos verdes sin almacenar tuvieron mayor flujo de solutos y electrolitos, es probable que las semillas se encontraban en un estado de madurez fisiológicamente inmaduro. Sin embargo, al almacenar los frutos verdes durante 14 días (UR14) la conductividad eléctrica de las semillas disminuyó 40 % (lenta liberación de solutos y electrolitos), esto indica que durante el almacenamiento postcosecha de los frutos las semillas continuaron su maduración y estabilizaron sus membranas celulares (^{Dias et al., 2006}).

Figura 1 Conductividad eléctrica (EC) de semillas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) extraídas de frutos verdes (Unripe), pintos (Half-ripe) y maduros (ripe); sin almacenar (not-stored) y almacenados durante 7 y 14 días postcosecha. Literales diferentes indican diferencias estadísticas entre tratamientos (Tukey, α = 0.05; DMS = 0.00606). n = 200. 

Germinación y emergencia

El almacenamiento postcosecha de los frutos durante 14 días incrementó el porcentaje de germinación de las semillas en los tres estados de maduración de frutos (R14, 98 %; HR14, 94 % y UR14, 91 %), muy cerca estuvo el porcentaje de germinación de las semillas R7 (91 %); pero, la germinación de HR7 (73 %), HR (69 %) y UR7 (61 %) fue al menos 25 % inferior a la de R14; así mismo, la germinación de las semillas obtenidas de frutos verdes sin almacenar fue la más baja (18 %) (Figura 2A). Es evidente que la maduración del fruto al momento de la cosecha afectó la germinación de las semillas (UR, 18 %; HR, 69 % y R, 83 %). Además, el almacenamiento postcosecha de los frutos antes de obtener sus semillas incrementó el porcentaje final de germinación, sin importar el estado de maduración en el que se cosecharon los frutos, es decir, la germinación de las semillas provenientes de frutos verdes, pintos y maduros almacenados durante 14 días incrementó 73, 25 y 15 %, respectivamente en comparación con los frutos sin almacenar. Es probable que el embrión de las semillas inmaduras (UR) tenga las estructuras (radícula, hipocótilo y cotiledones) necesarias para germinar, pero sin la madurez fisiológica y las reservas que se requieren durante la germinación (^{Ohto et al., 2007}; ^{Trigiano et al., 2008}). Almacenar los frutos de chile habanero (verdes, pintos, maduros) por 14 días incrementó la germinación con valores mayores a 90 %, este valor es superior al requerido para semillas de chile habanero (85 %) en las categorías (básica, registrada, certificada y habilitada) del ^{SNICS (2014)} y a lo reportado por ^{Dos-Santos et al. (2016}) quienes obtuvieron 85 % de germinación en semillas de frutos maduros de C. chinense almacenados por siete días. En este sentido, ^{Carrillo et al. (2009)} mencionan que las semillas del género Capsicum completan su madurez fisiológica pasando por un período de reposo, que puede ser de una a seis semanas después de que los frutos fueron cosechados. La viabilidad de las semillas asociada a los tiempos de almacenamiento postcosecha de los frutos se atribuye a que los frutos del género Capsicum son climatéricos y continúan su maduración fisiológica en paralelo con el embrión de la semilla, esto permite que la semilla termine su proceso de formación y disminuya el contenido de ácido abscísico (ABA) preparándose para la germinación (^{Kermode, 1995}).

Figura 2 A) Germinación de semillas y B) Emergencia de plántulas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) extraídas de frutos verdes (UR), pintos (HR) y maduros (R); sin almacenar y almacenados durante 7 (UR7, HR7 y R7) y 14 (UR14, HR14 y R14) días postcosecha. Los datos son medias, * = diferencias estadísticas significativas entre tratamientos (ANOVA, p ≤ 0.05; DMS en %G = 0.177; DMS en %E = 0.294), n = 100. 

En la emergencia de plántulas se observaron diferencias estadísticas significativas (p≤0.05) desde el primer día después de la siembra. El almacenamiento de los frutos postcosecha favoreció la emergencia de las plántulas, los tratamientos R14 (98 %), HR14 (88 %) y UR14 (94 %) superaron a los tratamientos sin almacenamiento R (74 %), HR (68 %) y UR (6 %) por 24, 20 y 88 %, respectivamente; R7 (92 %) fue el único de los tratamientos almacenados durante siete días con emergencia de plántulas superior al 85 %, el resto de los tratamientos estuvo por debajo del 80 % (Figura 2B). En este sentido, ^{Doijode (2001)} menciona que durante el almacenamiento postcosecha de los frutos, el embrión continúa su proceso de maduración fisiológica hasta completar una adecuada formación en todas sus etapas (histodiferenciación, acumulación de reservas y tolerancia a la desecación), lo cual desencadena cambios en las concentraciones endógenas de ácido giberélico y ácido abscisico, esto favorece la emergencia y la longitud radicular de las plántulas.

Tasa de germinación y emergencia

Las tasas de germinación y emergencia son un indicador de la velocidad a la que germinan las semillas y emergen las plántulas, respectivamente. Al igual que en el porcentaje de germinación (%G), la tasa de germinación (GR) de semillas provenientes de los tratamientos R14 (19.22 germinadas/día), HR14 (20.08 germinadas/día), UR14 (17.59 germinadas/día) y R7 (16.62 germinadas/día) fue estadísticamente superior (Tukey, α = 0.05) al resto de los tratamientos (Tabla 2), esta tendencia se observó desde el séptimo día después de la siembra donde sólo estos tratamientos (R14, HR14, UR14 y HR7) habían superado el 50 % de la germinación (Figura 2A). Sin embargo, en la tasa de emergencia (ER) el número de plántulas emergidas por día de R14 (13.93 plántulas/día) fue estadísticamente similar a las de UR14 (12.67 plántulas/día), pero superior al resto de los tratamientos (Tukey, α = 0.05); con excepción de R7 (9.95 plántulas/día) y R (7.05 plántulas/día) los tratamientos provenientes de frutos almacenados siete días (HR7 y UR7) y sin almacenar (HR y UR) tuvieron tasas de emergencia por debajo de 5 plántulas/día (Tabla 2), lo cual se reflejó en el porcentaje de emergencia (Figura 2B). De acuerdo con ^{Matthews & Khajeh-Hosseini (2006)} una germinación lenta produce plántulas heterogéneas, pero tasas altas de emergencia se correlacionan con plántulas más grandes y homogéneas (^{Demir et al., 2008}). Así mismo, ^{Bradford (2004)} y ^{Bewley et al. (2013)} mencionan que frutos inmaduros (verdes) proporcionan semillas de baja calidad, pero almacenarlos por un periodo de tiempo antes de la extracción de las semillas, puede incrementar la germinación hasta 73 % y la emergencia de plántulas hasta 88 %.

Longitud y tasa de crecimiento relativo de las radículas

En la longitud de raíces de plántulas, tanto a los siete como a los catorce días después de la siembra (das) se observaron diferencias estadísticas significativas (ANOVA, p≤0.05) entre tratamientos. A los 7 das las raíces de R14 (3.8 cm) fueron las más largas; en contraste, las raíces de UR (0 cm) no crecieron (Figura 3A). A los 14 das R14 tuvo las raíces más largas (6.3 cm), pero los valores de los tratamientos HR14 (5.2 cm), UR14 (5.5 cm) y R7 (5.3 cm) fueron muy cercanos; sin embargo, las raíces de UR fueron las más cortas (0.49 cm) (Figura 3A). En la tasa de crecimiento relativo con base en la longitud radicular (RGR_RL) se observaron tendencias muy similares. En los tres tratamientos donde se almacenaron los frutos durante 14 días (R14, HR14 y UR14, 1.57, 1.56 y 1.63 mm cm^-1 día^-1, respectivamente) y en R7 (1.58 mm cm^-1 día^-1) y HR7 (1.53 mm cm^-1 día^-1) no hubo diferencias estadísticas significativas, pero sí fueron estadísticamente superiores a los tratamientos HR (1.24 mm cm^-1 día^-1), UR7 (1.33 mm cm^-1 día^-1) y UR (0 mm cm^-1 día^-1) (Figura 3B).

Figura 3 A) Longitud de raíz (RL) y B) Tasa de crecimiento relativo de la RL (RGR_RL) de plántulas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) provenientes de semillas extraídas de frutos verdes (UR), pintos (HR) y maduros (R); sin almacenar (not-stored) y almacenados durante 7 (UR7, HR7 y R7) y 14 (UR14, HR14 y R14) días post cosecha. Los datos son medias ± EE. * = diferencias estadísticas significativas (ANOVA, p≤0.05). Literales diferentes indican diferencias estadísticas entre tratamientos (Tukey, α = 0.05, DMS en RL a los 7 días = 0.418; DMS en RL a los 14 días = 0.856; DMS RGR_RL = 0.366), n = 50 

En general, la longitud radicular de plántulas incrementó con el almacenamiento y con la maduración del fruto, en este trabajo las raíces de las plántulas provenientes de semillas colectadas de frutos verdes y pintos sin almacenar fueron las que menor crecimiento presentaron (Figura 4). Al respecto, ^{Cervantes et al. (1998)} y ^{Paponov et al. (2000)} mencionan que la deficiencia en el incremento de la longitud radicular deja en desventaja a las plántulas para obtener recursos para subsistir.

Figura 4 Semillas de chile habanero a los siete días después de la siembra, extraídas de frutos verdes (UR), pintos (HR) y maduros (R); sin almacenar y almacenados durante 7 (UR7, HR7 y R7) y 14 (UR14, HR14 y R14) días postcosecha. 

De acuerdo con el ^{ISTA (2004)}, el vigor de la semilla es la suma total de las propiedades que determinan el nivel potencial de actividad y desarrollo durante la germinación y la emergencia de la plántula. Es evidente que las semillas de frutos maduros per se producen plántulas más vigorosas, pero almacenar frutos pintos o verdes durante 14 días antes de extraer sus semillas, propicia la producción de plántulas vigorosas. En este sentido, se asume que el embrión de las semillas de chile habanero continuó su proceso de maduración mientras permaneció unido a la placenta del fruto, sin importar que el fruto estuviera en la planta o en almacenamiento postcosecha. En la industria semillera cosechar frutos verdes o pintos para la extracción de semillas en lugar de esperar a que el fruto alcance su madurez total en la planta es importante porque evita la exposición de frutos a daños bióticos o abióticos en campo. De igual manera, adelantar la cosecha de los frutos (verdes y pintos) puede incrementar el número de cortes en el ciclo de un cultivo, debido a que los asimilados de carbono (fotosintatos) que demandan los frutos para su maduración se canalizan a la formación de nuevos primordios florales (^{Marcelis et al., 2004}; ^{Garruña-Hernández et al., 2012}).