Ensayos de viabilidad celular

La línea celular U87 MG derivada de cerebro humano (glioblastoma/astrocitoma) fue cultivada en DMEM-HG (Dulbecco’s Modified Eagle Medium High- Glucose, Gibco by Life Technologies), suplementada con 10 % de suero fetal bovino (Gibco by Life Technologies), 1 % L-glutamina (Sigma-Aldrich Cat # G7513), 100 U/mL penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina (Gibco by Life Technologies), y se mantuvo a 37 °C en una atmósfera de 95 % de aire y 5 % de CO₂. La viabilidad celular se determinó mediante la técnica de exclusión de azul Tripano (^{Strober, 2015}) (Invitrogen Cat # 15250061, USA) 48 h después de la exposición con ALDH1A1 en diferentes concentraciones (Invitrogen Cat # 11388H07E25, USA), los resultados fueron analizados por ANOVA de una vía, seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Biopsias humanas

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Centro Oncológico Estatal (COE) ISSEMyM, Estado de México bajo el protocolo número: COE/UEI/PG/14/2017. No se requirieron consentimientos informados, debido a la naturaleza retrospectiva del estudio. Los datos sobre la historia y evolución de los pacientes se obtuvieron de los registros médicos del hospital y las muestras se obtuvieron de bloques de parafina. Diez muestras de pacientes con glioblastoma y una muestra de cada grado de glioma; GI, GII y GIII fueron utilizadas. Todos los diagnósticos fueron confirmados por imágenes y por el departamento de patología del COE. Todos los pacientes con glioblastoma considerados en este estudio fueron monitoreados desde el comienzo de su tratamiento (cirugía y radioterapia) y hasta su fallecimiento.

Inmunohistoquímica

Las secciones de tejido de cerebro sano, hígado sano y carcinoma ductal mamario infiltrante fueron amablemente donados por el departamento de patología del COE y se utilizaron como tejidos control. Los portaobjetos se bloquearon con 1 % de peróxido (Sigma) durante 5 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante toda la noche a 4 ºC en presencia de anticuerpos para ALDH1A1 (D9J7R) XP (Cell Signaling, Danver, MA, USA, Cat. # 36671S 1: 400) o DYRK1B (Sigma Aldrich, Cat # HPA028786, 1: 400). Posteriormente, las muestras se lavaron con PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora con el anticuerpo secundario, usando un kit Brown/Rabbit ImmunoDetector DAB HRP Brown (Cat. # BSB 0003) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se contra tiñeron con hematoxilina Harris (Sigma-Aldrich, HHS32-1L) y se montaron usando medios de montaje DPX. Los portaobjetos se examinaron con un microscopio óptico (Leica DM500). Las imágenes se obtuvieron con el software de imágenes de microscopios Leica Microsystems, con una amplificación de 40X. Diez campos independientes fueron contados y analizados por medio de un ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls, y los gráficos se realizaron utilizando el software GraphPad Prisma.

Espectrometría de masas

Para detectar la presencia de ALDH1A1 mediante ionización por electrospray, se utilizó el análisis de espectrometría de masas por infusión directa (ESI-MS/MS) (^{Arnold et al., 2015}; ^{Kirwan et al., 2014}). Las muestras de péptidos se analizaron usando un sistema de espectrometría de masas QTRAP 4500 (Sciex, San Francisco, CA) con una NanoSource. Las muestras se desparafinaron e incubaron en un buffer de extracción utilizando el kit Qproteome FFPE Tissue Kit (QIAGEN, USA Cat. # 37623) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas totales se aislaron y se procesaron para la generación de péptidos. Brevemente, el extracto total de proteínas se redujo/alquiló y digirió con tripsina (Promega, Cat. # V5111). Los péptidos resultantes fueron extraídos, desalados con un sistema ZipipC-18 (Millipore, Cat. # ZTC18S096) y resuspendidos en 20 % acetonitrilo y 0.1 % ácido fórmico (^{Aebersold & Mann, 2003}; ^{Megger et al., 2017}) La proteína ALDH1A1 humana recombinante (Invitrogen Cat. # 11388H07E25) se usó como control y recibió el mismo tratamiento de preparación.

La distribución de las moléculas en Q1 se analizó a una velocidad de exploración de 100 a 1000 m/z, Da, con 4500 Volts/150 °C, luego los iones para el análisis en MS3 fueron seleccionados usando un de-clustering potential de 120 y una energía de colisión de 20 (^{Arnold et al., 2015}). La búsqueda en la base de datos para la identificación de proteínas se realizó utilizando el buscador de iones “Mascot MS/MS ion search” (Matrix Science: disponible en http://www.matrixscience.com) con la base de datos AA Swiss-Prot y NCBInr para Homo sapiens (humano). Se utilizaron tolerancias de escisión de ± 1.2 Da para el ion precursor y ± 0.6 Da para las masas de los fragmentos de iones. Se consideraron los valores de masa monoisotópica y los valores no restringidos de masa. Adicionalmente, las secuencias de péptidos coincidentes se analizaron utilizando el software MS-BLAST software (Washington University, Saint Louis, MO; disponible en http://genetics.bwh.harvard.edu/msblast/) contra las bases de datos Swiss-Prot and NCBInr para confirmar la coincidencia de los péptidos.

Imagen

Se tomaron imágenes representativas de 3 pacientes con glioblastoma multiforme de su registro clínico del hospital.

Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

La presencia de ALDH1A1 se evaluó adicionalmente utilizando RT-PCR. Para la extracción de RNA, las muestras de biopsia se desparafinaron (^{Bonin & Stanta, 2013}) y se lavaron dos veces en PBS frío, pH 6.8. Después se extrajo el RNA total utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Cat # 15596026. USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de RNA fue medida por densidad óptica utilizando la absorbancia de 260 nm en un espectrómetro de luz Multiskan GO (Thermo Scientific). La calidad del RNA fue verificada por electroforesis en geles de agarosa con ayuda de un sistema de imagen BioDoc-UVP, así como por la relación 260/280 nm. La RT-PCR se realizó utilizando 5 μg de RNA el cual fue tratado con DNAsa (New England BioLabs, Cat # M0303S) y utilizando la transcriptasa reversa MMLV (Invitrogen, Cat # 28025013, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para amplificar ALDH1A1, se usaron los siguientes cebadores: forward 5’CCG TGG CGT ACT ATG GAT GC-3´ y reverse 5´-CGC AAT GTT TTG ATG CAG CCT-3’, para β-Actina, los cebadores utilizados fueron: forward 5’-TGG CACC ACA CCT TCT ACA-3’ y reverse 5’-TCA CGC ACG ATT TCC C-3’.

Ensayos de Western blot

La extracción de proteína total se realizó usando un kit de buffer de lisis para tejido Qproteome FFPE Tissue Kit (QIAGEN, USA Cat. # 37623) siguiendo las instrucciones del fabricante. Muestras con 50 μg de contenido de proteína total fueron separadas en geles de SDS-PAGE al 12 % y transferidas en membranas de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Las membranas fueron bloqueadas por 1 h a temperatura ambiente con leche descremada al 5 %, buffer Tris-salino con 0.1 % Tween-20, y luego se incubaron a 4 °C toda la noche con el anticuerpo primario contra ALDH1A1 (D9J7R) XP (Cell Signaling, Danver, MA, USA, Cat. # 36671S 1:1000) o DYRK1B humano (Sigma Aldrich, Cat # HPA028786, 1:1000). Las trasferencias se lavaron e incubaron con el anticuerpo secundario HRP-Cabra/anti-conejo (Invitrogen Life Technologies, Cat. #656120, 1:5000). Como control positivo, las membranas fueron desnudadas y se volvieron a probar con el anticuerpo monoclonal anti-β-actina (Sigma-Aldrich, Cat. # A3854, 1:1000) y luego con un anti-ratón de cabra (Invitrogen, Cat.#62-6520, 1:5000). Los anticuerpos secundarios se acoplaron con peroxidasa (Life Technologies, Rockford, IL, USA) y las proteínas se revelaron con sustrato de quimioluminiscencia mejorada Western Lightning® Plus-ECL, (Perki-nElmer, Inc., Waltham, MA, USA). Las imágenes de las películas se adquirieron digitalmente con un sistema de imagen BioDoc-It (UVP).

Identificación de ALDH1A1 en tejido de glio-blastoma

En primer lugar, se revisó la historia clínica de los pacientes (Tabla 1), así como las imágenes tomográficas (Figura 1 a-c) de los glioblastomas. Se caracterizaron las biopsias de tejido, y la presencia de ALDH1A1 se evaluó adicionalmente usando RT-PCR (Figura 1 d) y espectrometría de masas (Figura 2).

Figura 1 Glioblastoma (GBM). Imágenes representativas de resonancia magnética de tres pacientes diferentes con GBM. Las imágenes muestran tumores únicos con necrosis central y refuerzo periférico asociado con el medio de contraste de Gadolinio (GD) asociado con un extenso edema de anillo periférico; a) Tumor en corte axial. b) Tumor en corte coronal y en c) Tumor en corte parasagital. d) Análisis de RT-PCR específico para aldh1a1 y β-actina en las muestras del paciente con GBM, como control negativo no se agregó DNA en el ensayo. 

Figura 2 ALDH1A1 detectado en tejido de glioblastoma. a) Un espectro de masas representativo del ion precursor 796.3 m/z de ALDH1A1 en MS3 usando un método de péptidos basado en ESI-MS/MS. El ion precursor corresponde al péptido ANNTFYSAGVFTK, esta secuencia fue analizada por Blastnucleotide y correspondió a la cadena alfa de la aldehído deshidrogenasa (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). b) Parámetros espectrométricos de masas utilizados para la detección de ALDH1A1. 

Efecto de ALDH1A1 en el crecimiento celular de células de glioblastoma U87-MG

Para evaluar el efecto de ALDH1A1 sobre la viabilidad celular, células de glioblastoma humano U87-MG fueron tratadas con diferentes concentraciones de proteína ALDH1A1 recombinante purificada (Figura 3). Los cultivos se evaluaron a las 48 horas después del tratamiento, se cuantificó el número de células viables usando el ensayo de exclusión de azul Tripano. El vehículo sin proteína se utilizó como control. Se observó que ALDH1A1 inducía un aumento en el número de células viables debido al aumento en la proliferación, de una manera dependiente de la concentración. Se cree que el aumento en la viabilidad celular está relacionado con los procesos metabólicos celulares, ya que otros autores también lo han informado (^{Tomita et al., 2016}; ^{Yue et al., 2015}) con respecto a la participación de ALDH1A1 en el proceso de crecimiento celular y proliferación.

Figura 3 ALDH1A1 aumenta la viabilidad celular en células U87-MG de glioblastoma. ALDH1A1 indujo un aumento en el número de células viables de una manera dependiente de la concentración. Efecto de ALDH1A1 en la viabilidad celular en células U87-MG. La gráfica muestra unidades arbitrarias de la células U87-MG viables, determinada por exclusión del azul Tripano a las 48 horas después de tratarse con diferentes concentraciones de ALDH1A1 purificada recombinante. Los controles fueron tratados con el vehículo sin proteína. Las concentraciones de 25 y 50 ng/μL no mostraron diferencia significativa en comparación con el grupo control. El control es diferente de los grupos; 100 ng/µL, 150 ng/µL y 250 ng/µL. La concentración de 250 ng/µL es diferente en comparación con el grupo control, pero no lo es para la concentración de 150 ng/µL o 100 ng/µL. ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. **p<0.001, ***p<0.0001. Las barras son medias + S.D., n=3. 

Tejidos de glioblastoma presentaron inmunoreactividad a ALDH1A1 y DYRK1B

La expresión de ALDH1A1 y DYRK1B se evaluó en los tejidos de glioblastoma mediante tinción inmunohistoquímica. Se observaron diferentes patrones de expresión y se clasificaron según su intensidad en las células tumorales (Figura 3, 4). Se establecieron tres categorías: focal, débil disperso y negativo en neoplasia (pero positiva en endotelio). DYRK1B también mostró inmunorreactividad en tejido de glioblastoma, y su patrón de expresión era muy similar al de ALDH1A1, se observaron varianzas iguales entre ALDH1A1 y DYRK1B, (p=0.2881), por lo que se utilizó la misma clasificación. Con las observaciones anteriores, la expresión de ALDH1A1 y DYRK1B fue evaluada en gliomas de bajo grado (Figura 4) por inmunohistoquímica. Interesantemente, en el grado I fue negativo; en el grado II mostró un focal débil, mientras que en el grado III se observó una expresión débil disperso. Se cree que estas diferencias en los patrones de expresión en el glioblastoma (Figura 5) pueden tener alguna relación con el progreso de la enfermedad, y es importante continuar investigando. La expresión de ALDH1A1 y DYRK1B también se observó en las muestras de tumores mediante la técnica de Western blot (Figura 6 a-b), en el grupo focal, la señal fue más intensa con respecto a la débil disperso y neoplasia negativa en comparación con la muestra de cerebro sano, mientras que para DYRK1B la señal fue más intensa en focal y débil disperso en comparación con la muestra de cerebro sano.

Figura 4 Expresión de ALDH1A1 y DYRK1B en gliomas. Imágenes representativas de ensayos inmunohistoquímicos para ALDH1A1 y DYRK1B en diferentes grados de gliomas. Para ALDH1A1; a) Cerebro sano, b) Hígado sano como control positivo, c) Glioma Grado I (GI), d) Glioma Grado II (GII), d) Glioma Grado III (GIII). Para DYRK1B; f) Cerebro sano., g) Carcinoma ductal invasivo de mama como control positivo, h) Glioma Grado I (GI), i) Glioma Grado II (GII), j) Glioma Grado III (GIII). Imágenes en magnificación 40X. 

Figura 5 Patrones de expresión de ALDH1A1 y DYRK1B en Glioblastoma. Imágenes representativas de ensayos inmunohistoquímicos para ALDH1A1 y DYRK1B. Se usó tejido cerebral humano sano como control negativo para ALDH1A1 y DYRK1B, se utilizó tejido hepático sano como control positivo para ALDH1A1 y se utilizó tejido de carcinoma ductal invasivo como control positivo para DYRK1B. Se observaron tres patrones de expresión diferentes en los tejidos de pacientes con tejido de glioblastoma; focal, débil disperso y negativo en neoplasia (pero positivo en endotelio). Imágenes en magnificación 40X. 

Figure 6 Expresión de ALDH1A1 y DYRK1B en tejidos de Glioblastoma y tiempo de supervivencia en pacientes con Glioblastoma. Una imagen representativa de Western blot. a-b) Muestra la expresión de ALDH1A1, DIRK1B y como control β-actina, determinado por Western blot. c-d) Porcentaje de células positivas para ALDH1A1 y DYRK1B con respecto a su patrón de expresión observado. ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. e) Gráfica del tiempo de supervivencia con respecto al patrón de expresión de ALDH1A y DIYRK1B. Kaplan-Meier, n=10. 

Los patrones de expresión de DYRK1B y ALDH1A1 tienen una correlación significativa con la supervivencia general

El número de células positivas por campo para ALDH1A1 y DYRK1B se cuantificó, analizó y evaluó frente a la supervivencia general por paciente (Figura 6e). Para cada paciente, el tropismo entre ALDH1A1 y DYRK1B en las muestras fue equivalente. Debido a que los patrones de inmunoreactividad mostraron resultados interesantes, se analizó la correlación de la cantidad de células positivas vs el tiempo de supervivencia con un valor de -0.874, por lo que se cree que esta tendencia juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad. La mayor supervivencia global se observó en la clasificación de expresión de neoplasia negativa, mientras que la clasificación de expresión débil disperso tuvo la más baja.

Discusión

El glioblastoma multiforme es una enfermedad con un pronóstico particularmente pobre y una supervivencia general corta. Se ha demostrado que las proteínas involucradas en los principales procesos metabólicos de las células pueden alterarse en enfermedades como el cáncer, especialmente en aquellas involucradas en procesos que promueven la proliferación y la supervivencia. La presencia de DYRK1B en el glioblastoma, que se ha caracterizado en este tipo específico de cáncer (^{Vilenchik et al., 2019}), y que han sido encontradas de manera estable en muestras clínicas, ha mostrado un patrón de expresión similar a ALDH1A1, y una correlación inversa con la supervivencia general de los pacientes en este estudio, aunque existe controversia con respecto a la presencia de ALDH1A1 y la supervivencia, como ^{Adam et al. 2012} que describieron ALDH1A1 como un marcador de diferenciación astrocítica durante el desarrollo cerebral y un mejor marcador de pronóstico en pacientes que sufren glioblastoma primario. Con suerte, esto permitirá que surjan nuevas líneas de investigación sobre las vías de señalización en el glioblastoma, con la esperanza de dilucidar los mecanismos en los que convergen las vías para la señalización del ciclo celular y apoptosis. Hay otros informes, como ^{Rasper et al. 2010} donde informan que se encontraron células ALDH1+ cerca de los vasos tumorales o alrededor de áreas necróticas, hipotetizando que las células madre tumorales de GBM se localizan predominantemente en la proximidad de los vasos tumorales que muestran una estrecha interacción con células endoteliales, también ^{Tomita et al. 2016} indicaron que ALDH1A es un nuevo marcador de células madre y está presente en diferentes tipos de cáncer. Se han planteado muchas preguntas al respecto, y es necesario continuar investigando las consecuencias de la sobreexpresión de DYRK1B en el glioblastoma y las diferencias en los patrones histológicos de expresión. La relación entre la expresión de ALDH1A1 y el pronóstico clínico en diferentes grados de glioma (^{Alexandra et al., 2012}; ^{Liu et al., 2017}; ^{Xu et al., 2015}) y entre pacientes con GBM es cada vez más evidente. En conjunto, la alta expresión de ALDH1A1 se propone como pronóstico pobre. Además, ALDH1A1 se considera un objetivo prometedor para mejorar el tratamiento de GBM de acuerdo con su papel previo como mediador de la resistencia a la temozolomida en pacientes con GBM (^{Schäfer et al., 2012}), lo que requiere un mayor número de investigaciones de su comportamiento a nivel molecular. Por otro lado, aunque ALDH1A1 ha sido reportado en varios tipos de cánceres (^{Gong et al., 2014}), incluido el glioblastoma, también es importante que investiguemos más el por qué ocurren estos diferentes patrones de expresión. Los análisis de correlación de los patrones de expresión de ALDH1A1 y DYRK1B vs la supervivencia general dejan muchas preguntas sin respuesta. Se cree que DYRK1B, así como ALDH1A1, tienen una participación importante en la progresión de la enfermedad y deben estudiarse más a fondo en GBM, dado su potencial como marcadores pronósticos (^{Gong et al., 2014}; ^{Rasper et al., 2010}) o nuevos objetivos terapéuticos. Aunque ALDH1A1 y DYRK1B (^{Friedman, 2013}; ^{He et al., 2018}; ^{Huangfu & Anderson, 2005}; ^{Olmez et al., 2015}) son proteínas completamente diferentes, es necesario realizar más estudios para determinar las vías en las que están involucrados, y sí hay alguna otra que compartan. Una perspectiva que tenemos para el futuro es cuantificar los niveles de expresión de ALDH1A1 con respecto a DYRK1B usando qPCR, y evaluar cómo esto se correlaciona con la activación de otras quinasas dependientes del crecimiento activas en el sistema neurológico, tal como Akt, Erk, o ciclina D1. Además, determinar los niveles de expresión de ALDH1A1 y DYRK1B en plasma en comparación con los niveles encontrados en el tejido tumoral ayudaría a evaluar si las interrupciones en la expresión de estos dos genes pueden detectarse en etapas más tempranas de la enfermedad a través de exámenes de sangre periférica. El hallazgo en este proyecto permitió observar la detección de DYRK1B en el glioblastoma, con diferentes patrones de expresión y un comportamiento de expresión que se parece mucho al observado en ALDH1A1, así como la tendencia que tienen estos patrones con respecto al tiempo de supervivencia.