Antagonismo in vitro

Se evaluó el antagonismo in vitro de T. asperellum (Ta), T. harzianum (Th), T. longibrachiatum (Tl), y las actinobacterias Streptomyces sp. (A7), S. tubercidicus (A19) y S. viridochromogenes (A27) contra C. theobromicola aislado de inflorescencias de guanábana en los municipios de Compostela y San Blas, Nayarit, México. La identificación y patogenicidad de este hongo en inflorescencias se confirmó con estudios previos. La cepa fue depositada en el cepario del Laboratorio de Parasitología Agrícola (Cemic 03) de la Universidad Autónoma de Nayarit. Los antagonistas fueron proporcionados por el cepario del Laboratorio de Patología Vegetal y Control Biológico del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Sede Chihuahua-Campus Cuauhtémoc. Las confrontaciones se realizaron en cajas de Petri (90 × 15 mm) que contenían el medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA, DIBICO^®). El efecto antifúngico de los antagonistas vs C. theobromicola se determinó por el método de confrontación de cultivos. Las cepas de Streptomyces spp., se crecieron en medio de cultivo PDA por 10 d, para lo cual se colocaron discos de cultivo de 7 mm de diámetro en los cuatro puntos cardinales de las cajas de Petri que contenían PDA, después de esta incubación se sembraron en el centro de las cajas, discos de cultivo de 7 mm del hongo C. theobromicola de 7 d de edad (micelio y conidios sin cuantificar). Las cepas de Trichoderma se confrontaron mediante cultivos duales, para lo cual el antagonista se colocó en un extremo de la caja y el patógeno en el extremo opuesto de la caja de Petri, ambos fueron sembrados el mismo día. Ambos experimentos se realizaron por triplicado donde cada repetición constó de tres cajas de Petri, y como testigo positivo se utilizaron nueve cajas de Petri con PDA sembradas con C. theobromicola en ausencia de los antagonistas (^{Ruiz-Cisneros et al., 2017}). Las cajas se incubaron a 28 °C en una incubadora Novatech^® (modelo EI60-AIA) en ausencia de luz y el crecimiento radial de los microorganismos confrontados se midió sistemáticamente cada 24 h por 3 y 4 d para las cepas de Trichoderma spp. y 12 d para las cepas de Streptomyces spp. El antagonismo in vitro se evaluó mediante la estimación del porcentaje de inhibición del crecimiento radial del patógeno (PICR), usando la fórmula PICR = (R1 - R2) / R1 × 100, donde R1 fue el crecimiento radial del patógeno testigo y R2 el crecimiento radial del patógeno en la confrontación. El tipo de antagonismo de Trichoderma se determinó mediante la escala de ^{Bell et al. (1982)}, la cual consta de cinco tipos: (1) El antagonista ocupa completamente la superficie del medio de cultivo cubriendo totalmente al patógeno; (2) el antagonista sobrepasa las dos terceras partes de la superficie del medio de cultivo; (3) el antagonista y el patógeno colonizan cada uno aproximadamente la mitad de la superficie del medio y ninguno domina al otro; (4) el patógeno sobrepasa al crecimiento del antagonista colonizando tres cuartas partes de la caja; (5) el agente fitopatógeno cubre totalmente la caja. Mientras que el tipo de antagonismo por parte de las cepas de Streptomyces se determinó de acuerdo con la escala propuesta por ^{Pérez-Corral et al. (2015)}, donde propone seis tipos. (1) Crecimiento nulo del hongo (0 %); (2) crecimiento radial (1 % a 25 %); (3) crecimiento radial (26 % a 50 %); (4) crecimiento radial mayor a 50 %; sin sobrecrecer al actinomiceto; (5) presencia de halo; y (6) sobre-crecimiento al 100 % del actinomiceto por parte del hongo (sin antagonismo).

Evaluación in vitro de fungicidas

Se evaluó la sensibilidad de C. theobromicola a siete fungicidas comerciales: Maxtrobyn^® (azoxistrobin SC), ExCitrus^® (Extracto cítrico + quercetina), Canelys^® (Extracto de Cinnamomum zeylanicum), Hidrocu^® PH (Hidróxido de cobre), Pull75WG^® (óxido cuproso), SCORE^® 250 EC (Difenoconazol) y SWITCH^® (cyprodinil + fludioxonil) 62.5 WG (Tabla 1). Las dosis evaluadas, fueron consideradas en función a las dosis recomendadas por el fabricante, mitad de la dosis recomendada [dosis baja (D1)], dosis recomendada [dosis media (D2)] y dosis recomendada más la mitad de ésta [dosis alta (D3)]. El experimento consistió de cinco repeticiones donde cada repetición constó de una caja de Petri para cada dosis con cinco testigos para cada tratamiento. Se mezcló cada dosis del fungicida con el PDA a 48 °C y se agitó para homogeneizar la mezcla antes de ser vertida en las cajas de Petri (90 × 15 mm). Posteriormente, se colocaron discos (explantes de 0.7 mm) del cultivo de C. theobromicola de 7 d de edad, en el centro de las cajas de Petri. Los testigos consistieron de la siembra del hongo C. theobromicola en PDA en ausencia de los fungicidas. El crecimiento radial del hongo se midió cada 24 h por 12 d, tiempo en el cual los testigos llenaron por completo las cajas de Petri (^{Gaviria et al., 2013}). Con base en estas mediciones se calculó el PICR de C. theobromicola con la formula arriba mencionada.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente al azar. A los datos del PICR se les aplicó un análisis de varianza y una prueba de separación de medias por Tukey (α = 0.05) mediante el programa Statistical Analysis System (^{Sas Institute Inc., 2009}).

Antagonismo in vitro

Los seis antagonistas de Streptomyces y Trichoderma mostraron altos PICR sobre C. theobromicola, los PICR mostraron diferencias significativas en la prueba de separación de medias por Tukey (α = 0.05) (Figura 1), destacando las cepas de Streptomyces, que inhibieron el crecimiento del patógeno entre 90 y hasta el 100 %: La cepa A27 lo inhibió por completo (100 %), seguida por las cepas A19 y A7 con 96.18 y 90.4 %, respectivamente. Las tres cepas A27, A19 y A7 mostraron halos de inhibición de 26.35, 26.03 y 24.2 mm, respectivamente.

Figura 1 PIRG y halo de inhibición de antagonistas vs C. theobromicola. Streptomyces sp. (A7), Streptomyces tubercidicus (A19), Streptomyces viridochromogenes (A27), Trichoderma asperellum (Ta), Trichoderma harzianum (Th) y Trichoderma longibrachiatum (Tl). Las barras con mismas letras no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05). 

El antagonismo fue del tipo 1 para A27 donde el crecimiento del hongo fue nulo (0 %) y tipo 2 para A7 y A19 donde el crecimiento radial fue de 1 a 25 %. Estos resultados difieren con los obtenidos por ^{Dávila et al. (2013)}, ya que al evaluar in vitro aislados de Streptomyces sp. contra hongos fitopatógenos como Alternaria sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp. y Colletotrichum sp., reportaron inhibiciones menores al 62 %, donde la mayor inhibición la registraron contra Colletotrichum sp. La capacidad antifúngica de nuestras cepas de Streptomyces evaluadas pudo deberse a la producción de algún compuesto fungistático (^{De Lima et al., 2012}; ^{Atta, 2015}; ^{Pathalam et al., 2017}). Ya que, al respecto ^{Srividya et al. (2012)} mencionan que uno de los mecanismos de biocontrol de Streptomyces es mediante la producción de enzimas micolíticas principalmente quitinasa y β-1, 3 glucanasa así como celulasa, lipasa y proteasa. En un estudio realizado por ^{Saravana et al. (2014)} encontraron que el principio activo de la cepa SCA 7 de Streptomyces sp. fue el compuesto 2,4-bis (1,1-dimetiletil) fenol. En el mismo sentido ^{Shaik et al. (2017)} encontraron tres aislados de Streptomyces con actividad antifúngica los cuales producían los metabolitos bioactivos alpha amilasa, lipasa, proteasa y celulasa. ^{Atta (2015)} encontró que S. torulosus produce tunicamicina, un antibiótico de amplio espectro contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y de hongos unicelulares y filamentosos. Las tres cepas de Trichoderma también mostraron potencial antifúngico in vitro al inhibir a C. theobromicola hasta en un 92.27 %, siendo T. longibrachiatum la cepa más efectiva, seguida de las cepas T. harzianum y T. asperellum con inhibiciones del 83.33 y 80.48 %, respectivamente. Las tres cepas de Trichoderma mostraron antagonismo tipos; 1 para T. asperellum y T. harzianum (es decir el antagonista ocupó completamente la superficie de la caja cubriendo totalmente al patógeno) y 2 para T. longibrachiatum (donde el antagonista sobrepasó las dos terceras partes de la superficie de la caja). Trichoderma se ha propuesto como un agente potencial de control biológico de Colletotrichum spp., debido a su rápido crecimiento y a la actividad de sus enzimas líticas como quitinasas, endoglucanasas y exoglucanasas (^{Hoyos et al., 2008}; ^{Rodríguez & Veneros 2011}; ^{Sanmartín et al., 2012}; ^{Vargas et al., 2012}). ^{Peláez et al. (2016)} reportaron un 91 % de inhibición in vitro del crecimiento de C. gloeosporioides por T. asperellum, ellos también observaron un sobrecrecimiento en el fitopatógeno. Además, los mismos autores encontraron un efecto sinérgico en el uso integrado de T. asperellum y una dosis baja del fungicida captan 50^® (0.1 g L^-1) lo que condujo a la inhibición del crecimiento in vitro de C. gloeosporioides en un 99 %. El potencial antifúngico (inhibición in vitro >80 %) de nuestros aislados de Trichoderma, superan hasta cuatro veces los valores reportados por ^{De la Cruz et al. (2018)}, quienes encontraron inhibiciones in vitro de 9.5, 22.5 y 21.9 % por cepas de T. harzianum, T. asperellum y T. longibrachiatum, respectivamente. ^{Ghosh & Chakraborty (2012)} demostraron el potencial in vitro de cepas de T. viride como agente de control biológico de C. gloeosporioides, ellos encontraron que las esporas de Trichoderma se adhieren a las paredes de C. gloeosporioides y las contraen. Al respecto, ^{Vargas et al. (2012)} al evaluar la actividad antagónica in vitro de cepas de T. longibrachiatum, T. asperellum y T. harzianum contra Colletotrichum sp., encontraron que el 33.33 % de sus cepas mostraron un porcentaje de inhibición superior al 70 %, destacando las cepas de T. asperellum. Mientras que ^{Sanmartín et al. (2012)} encontraron cepas de T. asperellum con inhibiciones in vitro contra C. gloeosporioides superiores al 55.5 pero menores al 66.8 %, esta actividad antagónica fue correlacionada con la producción de enzimas quitinolíticas y celulolíticas. En un estudio realizado por ^{Rodríguez & Veneros (2011)}, encontraron que las hifas de T. harzianum cubrieron y degradaron (micoparasitismo) las hifas de los patógenos R. nigricans, C. gloeosporioides, A. alternata, S. lycopersici, F. oxysporum y L. thebromae.

Evaluación in vitro de fungicidas

La susceptibilidad de C. theobromicola a los siete fungicidas evaluados fue variable, ya que Canelys^®, Hidrocu^® PH y SCORE^® 250 EC inhibieron el 100 % del crecimiento del hongo con sus tres dosis; Pull75WG^® inhibió el 100 % con la D2 y D3; Switch^® 62.5 WG de 93.1 a 98.67 %; Excitri^® de 47, 77 y 98 % con las dosis D1, D2 y D3, respectivamente; Maxtrobyn^® mostró los valores de inhibición más bajos (68.44, 71.60 y 65.05 %) con las dosis D1, D2 y D3, respectivamente. Las tres dosis de Canelys^®, Hidrocu^® PH, SCORE^® 250 EC y Pull75WG^®, así como las dosis altas de Switch^® 62.5 WG y Excitri^® no mostraron diferencias significativas de acuerdo la prueba de Tukey (α = 0.05) (Figura 2). Con base a los resultados, se puede interpretar que 5 fungicidas evaluados mostraron alto potencial de control in vitro contra C. theobromicola (Canelys^®, Hidrocu^® PH, SCORE^® 250 EC, Pull75WG^® y Switch^®). Sin embargo, considerando que guanábana es un cultivo emergente donde se busca el manejo de las enfermedades a bajo costo, los fungicidas Canelys^® e Hidrocu^® PH, podrían ser una alternativa viable para el control de antracnosis en condiciones de campo, debido a que son considerados amigables con el ambiente y de bajo costo.

Figura 2 Inhibición in vitro del crecimiento radial de C. theobromicola por fungicidas comerciales. Las barras con mismas letras no son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05). 

^{Gaviria et al. (2013)} obtuvieron resultados similares con Score 250^® EC (difenoconazol 100 ppm) y Kocide^® 101 (hidróxido de cobre 2460 ppm) con el 100 % de inhibición in vitro de C. gloeosporioides y C. acutatum. Mientras que los valores obtenidos con Amistar^® 50 WG (azoxystrobin 63 ppm) no fueron diferentes ya que fluctuó de 38.75 a 70 %. Al respecto, ^{Linu & Jisha, (2017)} evaluaron tres fungicidas (carbendazim 0.05 %, mancozeb 0.2 % y azoxystrobin 0.1 %) in vitro contra C. capsici y obtuvieron porcentajes de inhibición de 64.12, 73.47 y 62.21 %, respectivamente, donde la inhibición de azoxystrobin fue similar al obtenido en esta investigación. ^{Zavala et al. (2005)}, al evaluar el efecto in vitro de azoxystrobin contra C. gloeosporioides reportaron una inhibición menor (59.8 %) a la encontrada en nuestro estudio, mientras que al evaluarlo in vivo en el control de C. gloeosporioides solo redujo la severidad de antracnosis en papaya en un 20.35 %. Por otra parte, en estudios in vivo de algunos de estos fungicidas como azoxistrobina en mezcla con ciproconazole a una dosis de 50 g/100 L^-1 se ha reducido la incidencia (por debajo del 25 %) de antracnosis en frutos de mango poscosecha causada por C. gloeosporioides (^{Arias & Carrizales, 2007}). En otro estudio realizado por ^{Pérez-León et al. (2015)} reportaron un 100 % de protección de las hojas Sansevieria trifasciata var. Hahnii de la antracnosis causada por C. sansevieriae, al aplicar azoxistrobin. Mientras que en frutos de papaya maradol, azoxystrobin mostró un 87.5 % de efectividad en la reducción de la severidad de C. gloeosporioides (^{Santamaría et al., 2011}).