Lugar del estudio

El estudio se realizó en el mes de agosto del 2015, en el estado de Morelos, México, ubicado geográficamente a los 22°51′43″ NL, 102°36′38″ WL y 2,309 m.a.m.s.l., en huertos comerciales de lima ‘Persa’.

Las plantaciones evaluadas se ubican en los municipios de Tlaltizapán, Ayala, Coatlán del Río y Amayuca, las cuales fueron seleccionadas a partir del padrón de productores de lima ‘Persa’ del Comité Estatal de Sanidad Vegetal.

Colecta del material biológico

El muestreo en las plantaciones se realizó acorde con la propuesta de ^{Acosta-Pérez et al. (2012)}, se colectaron 46 muestras, procedentes de ramas primarias, secundarias y troncos de árboles de cinco a ocho años de edad, con exudados de goma, canceres y muerte descendente de ramas, las que fueron transportadas en bolsas de polietileno y conservadas a 6 °C, hasta su procesamiento en el laboratorio de Fitopatología de la Escuela de Estudios Superiores de Xalostoc de la UAEM, Xalostoc, Morelos, México (EESuX-UAEM).

Aislamiento del hongo

Las muestras fueron seccionadas en fracciones de 0.5 cm², incluyendo la zona de avance de la enfermedad. Los fragmentos se desinfestaron por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 % por 2 min y tres lavados con agua destilada estéril por 2 min cada uno, se secaron en papel absorbente estéril para eliminar el exceso de agua.

Posteriormente, se incubaron cuatro fragmentos de tejido por placa de Petri, que contenían medio de cultivo de agar de dextrosa de patata (PDA) bajo luz blanca a 24 °C ± durante tres días. Una vez que se produjo el crecimiento del hongo, las colonias se purificaron mediante la técnica de punta hifa, en medio de cultivo PDA para aumentar la colonia.

Los aislados monospóricos, fueron resembrados en medio de cultivo jugo de vegetales V8-Agar (^{Ortiz, 1996}), posteriormente se almacenaron en tubos de ensayo con medio PDA cubiertos con aceite (^{Crous et al., 2006}).

Identificación y caracterización morfológica de los aislados

La identificación de los aislados se realizó con la ayuda de las claves y descripciones taxonómicas de ^{Phillips et al. (2013)}, basado en los caracteres morfológicos de las ascosporas, estados conidiales, pigmentación, grosor de la pared y forma de los conidios, dimensiones, septación, presencia de parafisos en los picnidios y estriaciones. La observación se llevó a cabo con un estereoscopio de campo claro, modelo Olympus^®.

Pruebas de patogenicidad

Para comprobar la patogenicidad del hongo se realizaron los postulados de Koch y la técnica descrita por ^{Agrios (2005)}.

Se inocularon tallos de plantas certificadas de lima ‘Persa’ de un año de edad, a una altura de 15 cm del suelo, los tallos se desinfectaron con hipoclorito de sodio (NaClO) al 1.5 %. Luego, con un bisturí se realizó una incisión a la corteza del tallo, de aproximadamente 7 mm. Posteriormente se inocularon con discos de 0.5 cm de aislado del hongo. La inoculación se realizó mediante la colocación de micelio con medio de cultivo en las aberturas de los tallos, el testigo solo recibió medio de cultivo sin él patógeno. Para favorecer la infección, el área inoculada se cubrió con algodón humedecido con agua destilada estéril y se resguardó con Parafilm^®. Las plantas fueron mantenidas individualmente bajo condiciones a campo abierto. Se realizaron evaluaciones visuales cada 15 d por 3 meses, registrando la evolución de los síntomas de la enfermedad en las plantas inoculadas.

Al detectar los síntomas de la enfermedad, se procedió a hacer el reaislamiento, con el fin de verificar el hongo inoculado corresponde al hondo aislado originalmente.

Identificación molecular

La identificación molecular se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Conservación y Mejoramiento de Ecosistemas Forestales Coyoacán, Ciudad de México, México.

La extracción del DNA genómico (DNAg), se llevó a cabo empleando el método AP descrito por ^{Sambrook & Russell (2012)}, utilizando el micelio del cultivo monospórico de los aislamientos obtenidos. La calidad del mismo se evaluó por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1% (Ultrapure, Gibco, USA) y las bandas se visualizaron en un transiluminador (Gel Doc 2000, BIO RAD^®, USA). La concentración de DNA se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific^®).

Los cebadores empleados para la identificación molecular de los hongos fueron ITS5 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) e ITS4 (5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’) de los genes ribosomales (rDNA).

El análisis de las muestras fue corroborado mediante PCR según el protocolo descrito por ^{Ahrens & Seemüller (1992)}, con modificaciones en los componentes: agua ultrapura estéril (16.25 μL), solución amortiguadora TBE IX (2.5 μL), MgCl₂ a 2.5 mM (1.25 μL), dNTPs a 0.2 mM (0.5 μL), iniciadores universales ITS5 e ITS4 a 20 mol (1 μL de cada uno), DNA polimerasa (Promega^®) a 1U (0.5 μL) y 80 ng (2 μL) de DNA g extraído previamente según ^{Sambrook & Russell (2012)}.

Análisis filogenético

Los fragmentos de DNA amplificados por PCR fueron purificados empleando el kit Wizard (Promega^®, USA), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. El producto de PCR purificado fue secuenciado por Macrogen Inc. (Seoul, Korea del Sur).

Las secuencias fueron ensambladas, y editadas con la opción CAP (Contig Assembly Program) del Software BioEdit v7.0.9.1 (^{Hall, 1999}). Las secuencias de hongos fueron comparadas y depositadas en la base de datos del GenBank (^{NCBI, 2016}).

Los árboles filogenéticos fueron construidos con los datos de las terminaciones de ITS5 e ITS4, además se analizaron con el software MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analisys) versión 7.0.14 (^{Swofford, 2003}; ^{Tamura et al., 2007}), alineadas con ClustalW 1.8.1 (^{Thompson et al., 1994}) y comparados con las secuencias de genes homólogos depositados en la base de datos de la National Center for Biotechnology Information (^{NCBI, 2016)}.

Después de analizar la congruencia entre los conjuntos de datos, se hizo un análisis de máxima parsimonia (MP), se realizaron los análisis filogenéticos en PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) versión 4.0b10 (^{Swofford, 2002}). Los árboles filogenéticos se obtuvieron con la función de búsqueda heurística con 1,000 repeticiones de adición aleatoria, bisección y reconstrucción de árboles (TBR) como algoritmo de intercambio de ramas y los espacios o datos faltantes fueron considerados deleciones completas. Los niveles de confianza de los puntos de ramificación de árboles fueron determinados mediante el análisis de bootstraping con 1,000 repeticiones (^{Kimura, 1980}; ^{Felsenstein, 1985}; ^{Hillis & Bull, 1993}). La secuencia HQ231345 de Phoma tracheiphila de GenBank se utilizó como el taxón fuera de grupo.

Identificación y caracterización morfológica de los aislados

De los 46 árboles muestreados de lima ‘Persa’, se obtuvieron 16 aislados con síntomas en ramas primarias y secundarias con muerte descendente y exudados gomosos. Solo tres de ellos fueron identificados morfológicamente según las claves taxonómicas reportadas por ^{Phillips et al. (2013)}.

En la observación al microscopio estereoscópico, se identificaron colonias con crecimiento de micelio gris ahumado, luego gris olivo a gris verdoso a azul pizarra oscuro y la presencia de picnidios a los 30 d de incubación. Así como conidios producidos y formados por una sola célula, de forma ovalada, hialinos y de doble pared con 17-26 X 12 μM de tamaño en colonias inmaduras. En colonias maduras, los conidios mostraron una coloración marrón oscura, dos células y estriaciones y 18-28 X 11-16 μM de tamaño, siendo similar con estructuras reproductivas asexuales del género Lasiodiplodia, pared verruculosa <2 μM, 1-septo con estriaciones longitudinales, lo que concuerda con lo reportado por ^{Phillips et al. (2013)}.

Resultados similares fueron obtenidos por ^{Slippers et al. (2004)} y ^{Alves et al. (2008)}, logrando colonias en medio de cultivo moderadamente densas, con micelio aéreo que inicialmente fueron blancas tornándose gris-olivo a los 7 d hasta llegar a un color azul pizarra oscuro.

^{Damm et al. (2007)} y ^{Netto et al. (2014)} confirmaron que la principal característica que distingue al género Lasiodiplodia de otros géneros cercanamente relacionados es la presencia de picnidios, parafisos y estriaciones longitudinales en conidios maduros, lo cual coincide con lo observado en este estudio.

Las dimensiones de los conidios y los parafisos, concuerdan con las planteadas por ^{Pitt & Hocking (2009)}, ^{Phillips et al. (2013)} y ^{Muñoz et al. (2015)} para este género.

^{Varela et al. (2013)} lo describen como el agente causal de la muerte de plantas de naranjo agrio injertadas con diferentes especies de cítricos en viveros, así como la muerte de ramas en árboles de limón mexicano y de la pudrición del pedúnculo en frutos de naranja.

La confusión en el diagnóstico del agente patógeno se debe a que produce síntomas muy similares a los que provoca Phytophthora parasitica, como la formación de gomosis, manchas foliares, pudriciones de frutas, muerte regresiva, canceres perennes y la muerte de árboles, todos estos asociados a diversas especies de hongos de la familia Botryosphaeriaceae (^{Muñoz et al., 2015}).

Debe señalarse que hasta la fecha no había sido informada esta enfermedad para el estado de Morelos sobre lima ‘Persa’, razones que justificarían la inefectividad de su manejo en campo.

Se identificaron y caracterizaron morfológicamente tres especies dentro del género Lasiodiplodia. La primera mostró colonias con conidióforos ausentes, células conidiógenas holoblásticas, discretas, hialinas, lisas, de pared delgada, cilíndricas, proliferando recurrentemente con 1-2 anillos, 11-16 X 3-5 μM. Conidio inicialmente hialino, aséptico, elipsoide a ovoide, con contenido granular, ambos extremos redondeados ampliamente, pared <2 μM, pigmentada, verruculosa, ovoide, 1-septado con estriaciones longitudinales, correspondientes a la especie L. citricola (Figura 1).

Figura 1 Rama enferma en cámara húmeda (A), cepa aislada de cinco días de edad (B), formación de picnidios después de 7 días en rama bajo cámara húmeda (C), picnidio y conidios de L. citricola bajo microscopio compuesto a 10X y (D) corte de picnidio donde se observan parafisos, conidio en crecimiento e inmaduro (E). 

Otra de las especies identificada y caracterizada fue L. pseudotheobromae, observándose conidios elipsoidales, ápices y bases redondeadas, más anchas en su medio a dos tercios superiores, de paredes gruesas, hialinas y sin septos.

La tercera especie correspondió a L. theobromae (Pat.) Griffon and Maubl., observándose células conidiógenas hialinas, de pared delgada, lisas, cilíndricas a sub-obpiriformes, holoblásticas, discretas, determinadas o indeterminadas y proliferantes por una o dos anillos distintos, o proliferando al mismo nivel, dando lugar a espesamientos periclinales, el conidia es subovoide a elipsoide ovoide, ápice redondeado ampliamente, afilando a la base truncada, más ancho en el tercio medio a tercero superior, paredes gruesas, contenido granular, inicialmente hialino y aceptado, permaneciendo hialina, llegando a ser marrón oscuro y 1-septado solamente. Luego produce la descarga de los conidiomas, con depósitos de melanina en la superficie interior de la pared dispuesta longitudinalmente dando una apariencia estriada a los conidios.

L. theobromae (Pat.) Griffon y Maubl., es cosmopolita y tiene un amplio rango de hospederos (aproximadamente 500), incluidos monocotiledóneas, dicotiledóneas y gimnospermas, es un hongo pleomórfico y ubicuo, el cual ha tenido más de un sinónimo (^{Abdollahzadeh et al., 2010}; Wang et al., 2011, citados por ^{Picos-Muñoz et al., 2015}). Aunque tiene una amplia distribución geográfica, es común en los trópicos y subtrópicos. Este patógeno de plantas no especializado ha sido reportado causando numerosas enfermedades, incluida la muerte regresiva, pudrición de raíz, pudrición de frutos, mancha foliar y escoba de bruja entre muchos otros. También llega a ser un endófito (^{Mohali et al., 2005}). En vista de su ocurrencia generalizada, gran cantidad de hospederos y su conocida morfología y variabilidad, es posible que L. theobromae se componga de una cantidad de especies crípticas (^{Punithalingam, 1980}).

Lasiodiplodia pseudotheobromae es una especie emparentada con L. theobromae y se ha descrito recientemente en cultivares de Acacia, Citrus aurantium, Coffea, Gmelina y Rosa (^{Alves et al., 2008}). Se ha reportado en diferentes especies del género Citrus, pero hasta el momento no se había reportado en lima ‘Persa’. ^{Slippers & Wingfield (2007)}, reportaron a estos fitopatógenos como especies endófitas de huertos comerciales de cítricos en México.

Pruebas de patogenicidad

Las pruebas de patogenicidad realizadas en las plantas certificadas de lima ‘Persa’, revelaron que los hongos aislados en este estudio son patógenos para este cultivo, observándose los primeros síntomas a los 22 días después de la inoculación (DAI), confirmándose que las especies del género Lasiodiplodia identificadas están asociadas a esta enfermedad y que son capaces de ocasionar clorosis en hojas, muerte descendente de ramas primarias y secundarias, la formación de canceres y exudados gomosos.

Las hojas de las plantas enfermas se tornaron cloróticas, a diferencia de las del testigo. Esta sintomatología se hizo más notoria en algunas plantas, además los tallos mostraron heridas de color café. En las plantas inoculadas, no se observaron daños característicos en tallos.

A los 29 DAI, las plantas mostraron hojas con clorosis marcada en el nervio central, mientras que en las plantas sanas los tallos y hojas no mostraron daño.

A los 36 DAI se apreció una clorosis marcada con respecto a las demás observaciones, encontrándose hojas amarillentas, pero poco enrolladas, y la formación de una herida en la base del tallo (pudrición) de algunas plantas.

A los 42 DAI, algunos árboles mostraron la formación de un cáncer bien definido en la base del tallo. Los árboles testigo (sin inocular), no evidenciaron síntomas de ninguna enfermedad y se mantuvieron sanos hasta el final de las evaluaciones. ^{Moriwaki et al. (2003)} reportaron que las pruebas de patogenicidad y caracteres morfológicos permiten separar taxonómicamente las especies del género Lasiodiplodia. Estos resultados demuestran la importancia y actual vigencia de las herramientas tradicionales en la separación de especies en la taxonomía de hongos. Siendo importante para los productores de lima ‘Persa’, que exportan en gran parte esta fruta. Los caracteres morfológicos y moleculares mostraron a las mismas especies de Lasiodiplodia inoculadas.

Identificación molecular

Los estudios realizados por PCR empleando los cebadores ITS5/ITS4 mostraron la amplificación de fragmentos de DNA de 500 pb a partir de micelio fúngico de las muestras para todos los aislados.

El análisis de secuencia mostró que los hongos corresponden a las especies Lasiodiplodia citricola, L. pseudotheobromae y L. theobromae. Sin embargo, 13 de los aislamientos obtenidos, no se lograron alinear a ninguna especie del género Lasiodiplodia.

Estos resultados sugieren que estas especies que prevalecen en las huertas de cítricos constituyen una amenaza a la sanidad de las plantaciones (^{Timmer et al., 2002}), por lo que se deben implementar tratamientos de control adecuados, ya que está siendo un problema de importancia económica en la región, debido a la alta susceptibilidad de la lima ‘Persa’ a esta enfermedad.

^{Bautista-Cruz et al. (2018)} reportaron estudios sobre la filogenia, distribución y patogenicidad de especies de Lasiodiplodia asociadas con canceres y síntomas de muerte regresiva de lima ‘Persa’ en los estados de Veracruz y Puebla, México, donde aislaron especies de Lasiodiplodia pseudotheobromae, y L. theobromae, lo cual coincide con los resultados obtenidos, lo que sugiere que ambas especies se están propagando en las plantaciones citrícolas del México, lo que constituye una amenaza para la producción a nivel nacional.

^{Guajardo et al. (2018)} reportan a L. theobromae por primera vez en Chile causando gomosis en limón. El monitoreo constante de este patógeno es importante para que no se extienda su diseminación en los principales huertos comerciales de cítricos en México. ^{Adesemoye et al. (2014)} reportaron otras especies de la familia Botryosphaeriaceae en lima ‘Persa’ en California, Estados Unidos, tales como Diplodia seriata y Dothiorella viticola.

Otros estudios de diversidad genética afirman que las dos especies crípticas de Lasiodiplodia (L. theobromae y L. pseudotheobromae), no han sido encontradas y estudiadas en el mismo hospedero, por lo que se desconoce de alguna posible hibridación entre ambas (^{Begoude et al., 2010}). Por otro lado, ^{Al-Sadi et al. (2013)} encontraron un moderado nivel de diversidad genética en poblaciones de tres especies de Lasiodiplodia provenientes de distintos hospederos y orígenes geográficos, y un alto número de genotipos no especificados.

Los marcadores moleculares se han empleado recientemente para examinar genes y genotipos, modos reproductivos y especiación de un número de hongos, incluyendo Botryosphaeria spp. y sus anamorfos (^{Burgess et al., 2006}).

Las 15 secuencias obtenidas fueron depositadas en GenBank con números de accesos para: Lasiodiplodia citricola (KY271187), Lasiodiplodia pseudotheobromae (KY284596), Lasiodiplodia theobromae (KY284589, KY284587) y Lasiodiplodia spp. (KY284584, KY284595, KY284594, KY290890, KY284592, KY284593, KY284588, KY284591, KY284586, KY284585 y KY284590), respectivamente.

Análisis filogenético

El árbol filogenético obtenido del análisis del DNA de los 16 aislamientos del género Lasiodiplodia se muestra en la Figura 2.

Figura 2 Árbol filogenético basado en el análisis bayesiano y máxima parsimonia utilizando los primer ITS 5 e ITS 4. 

Los agrupamientos de las especies no cambiaron, manteniendo una topología similar de los cladogramas. En el análisis bayesiano, la posición de los clado (agrupamientos) de las especies de Lasiodiplodia en relación entre sí fueron diferentes, pero dentro de cada especie la topología fue similar al árbol de máxima parsimonia (TreeBASE 11035). En este estudio se identificaron cuatro clados, estos fueron: Clado 1 (Lasiodiplodia spp.), Clado 2 (L. citricola), Clado 3 (L. pseudotheobromae) y Clado 4 (L. theobromae). Las especies Dothiorella viticola (EF445360) y Phoma tracheiphila (HQ231345) se encontraron representadas fuera de grupo.

Diferentes estudios consideran que un soporte superior o igual al 70 % brinda una información confiable sobre el posicionamiento de cada especie en el cladograma (^{Arnold et al., 2007}), lo cual coincide con los resultados obtenidos en el presente estudio.

En consecuencia, la formación del árbol permitió la conformación de agrupaciones, las cuales confirman la presencia de tres nuevas especies del género Lasiodiplodia afectando las plantaciones de lima ‘Persa’ en el estado de Morelos, México.