Introducción

La salinización genera pérdidas millonarias anuales y se estima que cerca de un tercio de las tierras irrigadas a nivel mundial han sido afectadas por este problema (^{Schwabe et al., 2006}; ^{Shabala, 2013}). La producción agrícola tiende a ser difícil en suelos con conductividades eléctricas superiores a 4 dS m^-1, porque varias especies cultivadas como frijol o maíz son sensibles a la salinidad, debido a que esta perturba todos o algunos de los procesos bioquímicos en las plantas, lo que consecuentemente limita la productividad y la calidad de los cultivos agrícolas en todo el mundo (^{Jenks & Hasegawa, 2005}; ^{Duarte et al., 2013}). Esta situación impone desafíos nuevos para los agricultores, quienes tienen que desenvolverse en ecosistemas que varían en tipo y calidad de suelo así como en disponibilidad y calidad de recursos hídricos (^{Lamz & González, 2013}).

^{Flowers & Colmer (2008)} sugirieron como alternativa para diversificar la producción y aprovechar zonas agrícolas afectadas por salinidad, el cultivo de plantas tolerantes a esta condición denominadas halófitas, que representan como máximo el 2 % de las especies terrestres. Las halófitas han adaptado diferentes estrategias fisiológicas, bioquímicas y moleculares asociadas a su desempeño en medios salinos que les permiten sobrevivir y crecer con normalidad aun cuando en la rizosfera existan concentraciones de sales entre 5 y 20 dS m^-1 de EC (^{Parida & Das, 2005}). El interés por las plantas aromáticas y medicinales ha incrementado porque de su metabolismo se obtienen compuestos que constituyen una fuente única de productos farmacéuticos, aditivos alimentarios, saborizantes, aromas, entre otros; con propiedades antioxidantes, antivirales, antibacteriales y anticancerígenas (^{Ramakrishna & Ravishankar, 2011}). Rosmarinus officinalis L. se distingue por ser una especie bien adaptada a ambientes salinos, clasificada como una planta moderadamente tolerante a la salinidad, cuya producción y comercialización está en aumento por su importancia económica como especie aromática para uso en fresco y seco, condimento, esencia y por su contenido de principios activos (^{Westervelt, 2003}; ^{Miyamoto, 2008}).

La salinidad provoca síntomas relacionados con la inhibición irreversible del crecimiento puesto que este se vuelve lento y no llega a completarse, como consecuencia el área foliar, la talla de la planta y la acumulación de materia seca son menores (^{Campos et al., 2011}). Se reporta que el estrés salino inhibe directa o indirectamente la división celular y la elongación de las células de la radícula, tallos y hojas (^{Zidan et al., 1990}).

La reducción de biomasa se atribuye, principalmente, a que el estrés salino repercute en la tasa fotosintética debido a un potencial bajo en la solución del suelo, toxicidad por iones y desbalances nutrimentales (^{Munns, 2002}). Por otra parte, impacta en la producción y acumulación de metabolitos secundarios en plantas medicinales y aromáticas (^{Beretta et al., 2011}; ^{Jordán et al., 2013}; ^{Zaouali et al., 2013}). El ácido rosmarínico es uno de los compuestos fenólicos principales encontrado en los tejidos de especies de la familia Lamiaceae, por lo que se consideran una fuente valiosa de estos compuestos; en general todos sus extractos tienen una actividad antioxidante significativa (^{Trivellini et al., 2016}).

Aunque la salinidad en los suelos no se debe exclusivamente a NaCl, las investigaciones sobre el efecto de distintitas fuentes de iones en el desarrollo de plantas aromáticas, así como su efecto en el metabolismo secundario son escasas. Adicionalmente, en muchos de los casos el material vegetal en el que se han determinado las propiedades biológicas de los extractos de Rosmarinus officinalis L. ha sido en poblaciones de las que poco se menciona el manejo agronómico que reciben, y dada la importancia de estos compuestos tanto en la industria como por sus efectos benéficos en la salud humana, resulta importante comprender la respuesta de la acumulación de estos compuestos en condiciones controladas que puedan favorecer su producción.

Con base en lo anterior el objetivo de la presente investigación fue evaluar el crecimiento vegetativo y producción de metabolitos secundarios en Rosmarinus officinalis L. cultivado en dos ambientes protegidos y diferentes concentraciones salinas en la solución nutritiva.

Material y Métodos

Esta investigación se desarrolló durante el periodo de abril a junio de 2016 en la Unidad Académica de Agricultura de la Universidad Autónoma de Nayarit, localizada a 21° 25´ 36” latitud N y 104° 53´ 28” longitud O, a 922 msnm, en un invernadero tipo gótico cenital de una nave cubierta con plástico lechoso con 30 % de sombra y en una casa sombra tipo macrotúnel con malla de 35 % de sombra. Se cultivaron plantas de romero de la variedad “Arp” de 3 meses de edad en contenedores de polietileno negro de 20 x 20 con tezontle como sustrato. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2 x 7. Los factores evaluados fueron dos ambientes de producción y siete niveles de salinidad de la solución nutritiva, generándose un total de 14 tratamientos (Tabla 1). Se realizaron cinco repeticiones por tratamiento. La unidad experimental consistió de una planta en un contenedor, la cual se regó manualmente con 250 mL cada tres días. La cosecha de material vegetativo se realizó entre 9 y 11 a.m., a los 18 y 36 días después del inicio de la aplicación de las soluciones nutritivas.

Se evaluaron dos grupos de variables, con mediciones a los 18 y 36 días después del trasplante (DAT), el primer grupo fue altura de planta (cm) y ramas⋅planta^-1, el siguiente grupo de variables se conformó por el contenido de prolina (µmol.g^-1), contenido de fenoles totales (µg CAE/100 g) y el índice de actividad antioxidante (AAI) (% de inhibición de DPPH).

La altura de planta, se midió con una regla graduada en milímetros desde el cuello de la planta y como altura máxima el ápice del tallo principal. Además se contabilizó el número de ramas⋅planta^-1 desde la base del tallo.

El contenido de prolina se determinó con la metodología de ^{Bates et al. (1973)}, para la cual se utilizaron 0.5 g de muestra liofilizada pulverizada que se maceró con 5 mL de ácido sulfosalicílico al 3 %; el extracto se filtró y después se centrifugó a 10,000 rpm durante 5 min. Se midió una alícuota de 2 mL del sobrenadante, que fueron dispuestos en un tubo de ensayo, a los cuales se les agregó 2 mL de ninhidrina ácida y 2 mL de ácido acético glacial. El blanco se preparó con 2 mL de ácido sulfosalicílico, 2 mL de ninhidrina ácida y 2 mL de ácido acético glacial. La curva estándar se preparó con diferentes concentraciones de solución estándar de prolina (20 µmoles mL^-1); de esta solución se midió una alícuota de 1 mL, la cual se depositó en un matraz y se aforó a 50 mL con ácido sulfosalicílico al 3%, dicha dilución equivale a 400 nmoles mL^-1. Cada tubo se agitó en vórtex hasta obtener una emulsión, se taparon y se colocaron a baño María durante 60 minutos, al terminar se sumergieron en agua fría durante 10 minutos. A cada tubo se le agregaron 4 mL de tolueno y se agitó en vórtex. La fase superior se colocó en un tubo nuevo y se realizó la lectura de absorbancia a 520 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific (Modelo Spectronic 200, Massachusetts, USA).

El contenido de prolina se expresa en µmol.g^-1 de prolina, con base a la siguiente ecuación:

Donde: Abs extract es la absorbancia obtenida del extracto, blank (expresado en absorbancia) y slope (expresada como absorbancia.nmol^-1) determinadas por regresión lineal, Vol extract es el total del volumen del extracto, Vol aliquot es el volumen usado en el ensayo, FW (expresado en mg) es la cantidad de material vegetal en la que se realizó la extracción. Se asume que la Abs extract está dentro del rango lineal.

El contenido total de fenoles y el AAI se evaluaron en material fresco. Las muestras se prepararon de acuerdo con el procedimiento de ^{Chizzola et al. (2008)} y ^{Nourhene et al. (2009)}; se utilizó metanol al 60 % (v/v), 2 g de material fresco se trataron con 15 mL de solvente y la extracción se realizó a 4 °C por 24 h. Después el extracto se filtró para separar las partículas de material vegetal y se refrigeró a 4 °C hasta su análisis.

El contenido total de fenoles se determinó con el método Folin-Ciocalteau, de acuerdo con ^{Chizzola et al. (2008)} con algunas modificaciones propuestas por ^{Juárez et al. (2011)}. Los reactivos empleados fueron: ácido cafeico, reactivo Folin-Ciocalteau, carbonato de sodio y etanol. Se midieron alícuotas de 0.5 mL de extracto etanólico, 1 mL de etanol 95 % (v/v) a los que se agregaron 5 mL de agua destilada, y 0.5 mL de reactivo Folin-Ciocalteau diluido en agua destilada 1:10. Después de 5 min, se agregó 1 mL de solución de carbonato de sodio en agua (5 %, v/v). Las muestras se agitaron y se mantuvieron 30 min en oscuridad, después se midió la absorbancia a 725 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific (Modelo Spectronic 200, Massachusetts, USA). El blanco se preparó siguiendo el mismo procedimiento con etanol. Para la curva de calibración se usaron concentraciones diferentes de ácido cafeico en etanol. El contenido total de compuestos fenólicos del extracto se expresó en µg de equivalentes de ácido cafeico (CAE) por 100 g de material vegetal fresco (FPM).

El AAI del extracto fenólico se determinó con el método DPPH descrito por ^{Chizzola et al. (2008)} y ^{Scherer & Texeira (2009)}. Por cada muestra, se midió una alícuota de 400 μL del extracto y se ajustó a 1 mL con metanol al 50 %, posteriormente se agregó 1 mL de DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidracilo) (2.43 x 10^-4 M). Las muestras se colocaron en oscuridad por 30 min a temperatura ambiente; la absorbancia contra un blanco fue medida a 517 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific (Modelo Spectronic 200, Massachusetts, USA). El blanco consistió en 500 μL de Trolox, 500 μL de metanol y 1 mL del reactivo DPPH para obtener una decoloración total del radical. Como sustancia de referencia para la curva de calibración se midieron 2.5 mM de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,8-tetrametil-chromano-2-carboxílico) en metanol; las concentraciones para la curva fueron de 0.1 a 2 mM de trolox en 1 mL de metanol. La solución estándar de Trolox se preparó bajo las mismas condiciones. Los resultados se expresan en porcentaje de inhibición de DPPH, de acuerdo con la siguiente ecuación:

Donde Absc es el valor de absorbancia del control, Absm es el valor de absorbancia de la muestra.

Se realizaron análisis de varianza de cada factor y variable con el paquete estadístico SAS (SAS, Inst., 2007). La comparación de medias fue mediante la prueba de Tukey (p<0.05).

Resultados y Discusión

El análisis de varianza indicó diferencias significativas a los 18 DAT para todas las variables. Así como en las variables prolina, fenoles totales e AAI por efecto del ambiente de producción, la solución nutritiva y la interacción entre estos a los 36 DAT (Tabla 2).

Altura. A los 18 DAT, los mayores promedios se encontraron en las plantas cultivadas en invernadero (Tabla 3); al respecto, es posible que la intensidad luminosa inicial percibida en ese ambiente haya estimulado una acumulación mayor de carbohidratos (^{Lambers et al., 2008}). Sin embargo, el cultivo siguió un mismo ritmo de crecimiento durante el experimento en ambos ambientes de producción. Al considerar el efecto de la solución nutritiva sobre la altura, el análisis de varianza permitió observar un crecimiento homogéneo a los 18 y 36 DAT, los promedios oscilaron entre 32.22 y 35.05 cm respectivamente (Tabla 3 y 4). Estos valores son superiores a los reportados por ^{Kiarostami et al. (2010)} cuando usaron NaCl en el medio de cultivo; estas diferencias podrían atribuirse a la concentración subóptima de algunos nutrientes que acompañaron a los tratamientos con NaCl en este ensayo.

Número de ramas. Las plantas cultivadas en casa sombra obtuvieron los mayores valores a los 18 DAT. (Tabla 3). Esta respuesta inicial pudo haber sido influenciada por las condiciones de luz permitida por la malla de la cubierta y su efecto sobre la tasa de crecimiento, ya que la formación de hojas nuevas permite interceptar un mayor porcentaje de radiación (^{Silber & Bar-Tal, 2008}). No obstante, a los 36 DAT no se observaron diferencias por efecto del ambiente (Tabla 4). Los resultados de esta variable fueron parecidos a la tendencia observada para la variable altura de planta. En este trabajo se demuestra parcialmente que Rosmarinus officinalis L. es una planta moderadamente tolerante a la salinidad como lo indicaron ^{Miyamoto (2008)} y ^{Tounekti et al., (2008)}, ya que el estrés salino promovido por soluciones nutritivas adicionadas con NaCl con alta EC por 36 días de tratamiento, no redujeron el crecimiento.

Prolina. El contenido de prolina resultó diferente en las fechas de muestreo en ambos ambientes de producción. Las plantas de romero cultivadas en invernadero obtuvieron los mayores valores a los 36 con 2.067 µmol/g (Tabla 4). Lo que difiere de lo reportado para Thymus vulgaris donde se observó un incremento en condiciones de campo, en comparación con las condiciones de malla sombra, lo cual sugirió que las condiciones en el invernadero de alguna manera intensificaron el estrés inducido lo que estimuló una mayor síntesis de este metabolito (^{Zrig et al., 2016}). En diversas condiciones de estrés abiótico, además de actuar como osmolito, funciona como un chaperón molecular que conserva la integridad de proteínas y membranas, estabiliza el pH del citosol y neutraliza especies reactivas al oxígeno (^{Kishor et al., 2005}; ^{Hayat et al., 2012}).

Por efecto de la solución nutritiva se observaron diferencias estadísticas a los 18 y 36 DAT en el contenido de prolina (Tabla 3 y 4). Durante el período del experimento, los valores menores en contenido de prolina se obtuvieron en el tratamiento 1 mientras que los valores mayores se encontraron en el tratamiento 3 y 4 a los 36 DAT (Tabla 4). Lo anterior indica que el efecto osmótico que puede ocasionar el NaCl, es diferente del originado por una concentración excesiva de todos los nutrientes. Aunque la tendencia observada de la prolina a incrementarse a medida que la salinidad aumentó coincidió con otras especies medicinales cuando se trabajó con altas concentraciones de NaCl; los valores de prolina obtenidos en esta investigación son superiores a los reportados en Mentha piperita, pero inferiores a los de Satureja hortensis y Matricaria chamomilla (^{Roodbari et al., 2013}; ^{Akbari et al., 2013}; ^{Afzali et al., 2009}).

En condiciones de salinidad, las plantas necesitan estrategias para sobrevivir en ambientes hostiles, uno de los mecanismos fisiológicos más eficientes para sobrevivir a condiciones de estrés, es el ajuste osmótico en el que los tejidos reducen su potencial osmótico mediante la acumulación de una variedad de metabolitos de tal manera que éstos les ayuden a conservar la turgencia (^{Hayat et al., 2012}; ^{Wu et al., 2013}; ^{Zrig et al., 2016}). Al inicio del experimento se observó un incremento progresivo del contenido de prolina conforme la concentración de la solución nutritiva aumentó, adicionalmente, la disminución observada a través del tiempo permite inferir que la edad de la planta influyó en su capacidad de sintetizar y regular la concentración de este aminoácido durante el tiempo que dura el estrés (^{Xu et al., 2014}).

Contenido total de fenoles. Esta variable resultó diferente entre los ambientes de producción, donde las plantas de romero cultivadas en invernadero obtuvieron los valores mayores en los muestreos (163.996 - 178.244 µg CAE/100 g) (Tabla 3 y 4). Estos valores difieren de los señalados por ^{Zrig et al. (2016)}, quienes reportaron un promedio de 6.46 mg ácido gálico g^-1 PF en Thymus vulgaris L. cultivado en casa sombra, con un aporte de 500-700 mM m^-2 s^-1 PAR, éstas últimas condiciones de luminosidad son similares a las registradas en condiciones de invernadero en este trabajo, lo que sugirió que el contenido de fenoles totales podría ser sensible a la luz. Al respecto, ^{Ghasemzadeh et al. (2010)} observaron que la variación de los niveles de radiación influyen en la acumulación y distribución de compuestos fenólicos en Zingiber officinale en el que se obtuvieron mayores resultados con 460 - 790 µmol m^-2s^-1 (34.16 - 39.06 mg ácido gálico g^-1 PS).

Por efecto de la solución nutritiva en el contenido total de fenoles en plantas de romero se observaron diferencias significativas a partir de los 36 DAT, donde el valor máximo se reportó en la solución nutritiva al 75 % (173.789 µg CAE/100 g) (Tabla 4). Los valores registrados en este trabajo son mayores a los reportados por ^{Chizzola et al. (2008)} y ^{Juárez et al. (2011)} en Thymus vulgaris (65.1 y 68.05 µg CAE/100 g, respectivamente); lo cual sugirió que no se requiere manipular la solución nutritiva con exceso de sales para obtener un contenido mayor de compuestos fenólicos en cultivo de romero.

AAI. Esta variable se mostró diferente a partir de los 36 DAT cuando las plantas de romero cultivadas en ambiente invernadero registraron los valores mayores (69.02 %) (Tabla 4). Es posible que esta respuesta estuviera en función de la radiación fotosintéticamente activa percibida en el ambiente. Esta tendencia es contraria a la reportada por ^{Ghasemzadeh et al. (2010)} en extractos de Zingiber officinale donde se observó una disminución de la actividad antioxidante al aumentar la intensidad luminosa. Dada la importancia biológica de este tipo de compuestos y su papel como antioxidantes en la nutrición humana, debe considerarse el uso de diferentes ambientes controlados para su producción.

Por efecto de la solución nutritiva se observaron diferencias estadísticas sobre el AAI de plantas de romero durante el tiempo que duró el experimento. A los 36 DAT se presentaron diferencias estadísticamente significativas al utilizar las soluciones nutritivas al 640 y 870 % con respecto a los demás tratamientos, lo cuales obtuvieron los valores menores (44.9 y 41.4 %) (Tabla 4); al respecto, está documentado que la salinidad acelera la oxidación de un sistema biológico mientras que los antioxidantes disminuyen los efectos adversos. Es posible que estos valores se encontraran debido al estrés oxidativo inducido por las concentraciones altas de todos los nutrientes presentes en la solución del sustrato, lo que estimuló una producción mayor de especies reactivas de oxígeno (^{Miller et al., 2010}).

En esta investigación, las plantas de Rosmarinus officinalis mostraron una disminución en el AAI conforme incrementó la salinidad del medio de cultivo, tendencia similar a la reportada por ^{Kiarostami et al. (2010)} y ^{Oueslati et al. (2010)}. La cual tiende a cambiar de manera significativa a medida que incrementa la concentración de la solución nutritiva y tiene una respuesta diferencial en cuanto a la sal que la ocasiona, el tratamiento 1 se mantuvo con los mayores porcentajes de inhibición el cual fue una condición sin estrés, mientras que los valores menores se registraron en los tratamientos 3 y 4 con 44.94 y 41.47 %, respectivamente (Tabla 3 y 4). Sin embargo, los porcentajes de inhibición del DPPH observados en este experimento son superiores a los reportados por ^{Chizzola et al. (2008)} (22-55 %) y ^{Juárez et al. (2011)} (43.88 %) en Thymus vulgaris. Debido a sus propiedades y estructura, los compuestos fenólicos son extractos complejos que presentan una importante actividad antioxidante, la cual está determinada por cada uno de sus componentes, de la interacción entre ellos y del ambiente en el que se encuentran; eventualmente pueden producirse efectos potenciadores o inhibidores (^{Frankel & Meyer, 2000}). Los resultados obtenidos permiten sugerir que no es recomendable inducir el estrés salino en plantas de romero para producir compuestos antioxidantes de origen natural.

Conclusiones

El ambiente de producción, casa sombra o invernadero y la formulación de la solución nutritiva no tienen efecto en la altura de planta y el número de ramas de romero. La acumulación de prolina en plantas de romero, el contenido total de fenoles y el índice de actividad antioxidante fueron mayores en invernadero.

La acumulación de prolina fue mayor con la solución nutritiva de Steiner al 640 y 870 %. Mientras que el contenido total de fenoles y el índice de actividad antioxidante fueron mayores con la solución nutritiva de Steiner al 75 %.