Material vegetal

Se obtuvieron 200 frutos de zapote mamey de un huerto ubicado en Tuxtla Chico, Chiapas, México (14° 56’ 20” N; 92° 10’ 05” W). Los frutos se encontraban en madurez fisiológica al momento del corte, lo que se aseguró mediante el índice de cosecha, a través de la presencia de una tonalidad rosa-naranja en la pulpa, que se verificó haciendo una incisión cerca del ápice del fruto. El transporte de los frutos al sitio experimental en Texcoco, México (19 ° 29 ‹23 «N, 98 ° 53′37» W), se llevó a cabo por tierra, utilizando cajas de plástico. Dentro de las 20 h posteriores a la cosecha, los frutos se almacenaron a 12 ° C, que es una temperatura que puede prolongar la vida postcosecha del zapote mamey sin causar daños por frío (^{Alia-Tejacal et al., 2005b}).

Firmeza del fruto

Cada tercer día, se tomaron tres frutos de forma aleatoria de la cámara de almacenamiento para evaluar la firmeza de su pulpa (FF) que se midió con un analizador de textura (Stable Micro Systems, TA-XT2i, UK). Al fruto se le removió la cáscara en dos puntos de su región ecuatorial, con un elemento cónico de 2.6 cm de base redondeada y en un ángulo de 75°. Se tomaron las lecturas bajo una rutina en la que la pulpa del fruto se deformó hasta 4 mm a una velocidad de 3 mm s⁻¹. La firmeza de la pulpa (FF) se expresó en newtons (N). Posteriormente, se tomó una muestra de pulpa y se colocó en nitrógeno líquido para luego almacenarse a -20 ° C para las evaluaciones subsecuentes de compuestos fenólicos y actividad enzimática.

Extracción de compuestos fenólicos (proantocianidinas)

Una muestra de 15 g de pulpa congelada se molió en una licuadora doméstica (Man LMU 9013, México) equipada con un recipiente de volumen reducido. Se pesó 1 g de la muestra homogeneizada y se mezcló con 20 mL de solvente (acetona:agua:ácido acético, 75.0:24.5:0.5 v/v/v) en un matraz Erlenmeyer (^{Prior et al., 2010}). La mezcla se colocó en un baño de ultrasonido (Branson, Model 2510, USA) por 30 min, posteriormente se colocó en un agitador horizontal (Gyratory shaker, model G10, USA) por una hora. La muestra se centrifugó (Universal 32, Hettich Zentrifugen, Germany) a 2200 x g por 10 min a 20 °C, y el sobrenadante fue recuperado (filtrado con papel Whatman No. 1) y ajustado a un volumen de 20 mL con el solvente de extracción. Este extracto se dividió en dos volúmenes iguales; uno se concentró en un rotaevaporador (Heidolph, Laborata 4010, Germany) a 40 °C hasta 2 mL y se ajustó con agua destilada a un volumen de 10 mL para luego realizar tres extracciones líquido-líquido con 15 mL de acetato de etilo en cada caso, con recuperación de la fase orgánica. Las fases orgánicas colectadas se juntaron y se concentraron a sequedad en un rotaevaporador. El residuo se re-suspendió en 2 mL de methanol grado HPLC y se utilizó para los análisis de compuestos fenólicos por HPLC-DAD. El otro volumen de 10 mL se usó para la cuantificación de compuestos fenólicos por diversos métodos.

Cuantificación de compuestos fenólicos solubles totales por el método de Folin- Ciocalteu

Se usó el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu (^{Singleton & Rossi, 1965}) y el ácido gálico (Sigma, MN) para elaborar la curva patrón y poder expresar la concentración de fenoles solubles totales en mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100 g de peso fresco (FW).

Proantocianidinas mediante el método de butanol/HCl

Se utilizó el método de ^{Porter et al. (1986}) con un volumen de 500 μL de extracto que se colocó en tubos de vidrió con tapón de baquelita. El método de butanol/HCl es confirmativo de la presencia de taninos condensados o proantocianidinas (PAs), al presentarse un color rojo intenso cuando la muestra es calentada, debido a la oxidación de las leucoantocianidinas (^{Schofiel et al., 2001}). Para correr el ensayo, 3 mL de una solución concentrada de butanol/ HCl (95:5 v/v) (JT Baker S.A. de C.V., México) se mezclaron con 100 μL de reactivo férrico (sulfato férrico de amonio al 2 % en HCl 2 N). Los tubos se cerraron y se colocaron en baño de agua a 92 °C por 60 min. Posteriormente, se leyó la absorbancia de las muestras a 550 nm en un espectrofotometro (Perkin Elmer, Lambda 25, USA) el cual se ajustó a cero de absorbancia con un blanco preparado con todos los reactivos, pero sustituyendo el extracto por solvente de extracción. Harinas de sorgo (^{Dykes & Rooney, 2006}) y de cálices de jamaica se usaron como controles positivo y negativo, respectivamente en la prueba. En ambos casos la extracción de PAs se realizó de la misma forma que en el caso de la pulpa del zapote mamey. Debido a que no existe en el mercado un estándar químico de taninos condensados adecuado para zapote mamey, los resultados se expresan como valores de absorbancia.

Método de DMAC (4 - (dimetilamino cinamaldheído)

El método colorimétrico DMAC (^{Wallace & Giusti, 2010}) se utilizó para lo cual se colocaron 2380 μL de metanol grado HPLC en tubos de ensayo que contenían una alícuota de 20 μL de extracto y 100 μL del reactivo DMAC preparado al 2 % en ácido sulfúrico al 6 N en metanol. Se utilizó metanol grado HPLC como blanco. Se elaboró una curva estándar con catequina (Sigma, MN) solubilizada en el mismo solvente usado para la extracción de PAs. La concentración de PAs se expresó en mg equivalentes de catequina (CE) por 100 g de peso fresco (FW).

Método de vainillina

Se utilizó el método propuesto por ^{Sun et al. (1998)}. Un volumen de 2500 μL de vainillina al 1 % se colocó en tubos de vidrio con 1000 μL de extracto. Posteriormente, se agregaron 2500 μL de HCl al 8 % y se agitaron en vórtex por 20 s para luego centrifugarlos a 2200 x g por 10 min. La reacción se dejó estabilizar por 10 min en oscuridad. Se preparó una curva estándar de proantocianidina B2 (Fluka, MN) solubilizada en el solvente utilizado en la extracción de PAs. La concentración de PAs fue expresada como mg equivalentes de proantocianidina B2 (PB2E) por 100 g de peso fresco (FW).

Análisis de proantocianidinas por HPLC-DAD

Se utilizó un cromatógrafo de líquidos (HPLC; PerkinElmer Series 200, USA) con un detector de UV con arreglo de diodos, controlados por una computadora mediante el programa TotalChrom™. Para el análisis de la fracción de acetato de etilo se empleó una columna analítica Phenomenex Luna C₁₈ (250 x 4.6 mm, 5 mm), bajo el protocolo descrito por ^{Cabrera et al. (2003)}. Las fases móviles fueron: ácido acético al 0.1 % en agua (A) y metanol (B) con una velocidad de flujo de 1 mL min^-1. La composición de la fase móvil inició con 100 % de A por 1 min, que incrementó linealmente a 63 % de B en 27 min, regresando a las condiciones iniciales en 5 min. La detección se realizó a 280 nm para catequinas y a 360 nm para flavanoles. La temperatura de la columna se mantuvo en 25 °C. Se usó un volumen de inyección de 10 μL. Las muestras se filtraron a través de membranas de nylon de 0.45 μm (Millipore™) antes de inyectarse al equipo. Todos los solventes fueron grado HPLC. Se prepararon curvas estándar de ácido gálico, catequina, epicatequina, galocatequina y epigalocatequina 3-galato (Sigma-Aldrich, MN) en concentraciones entre 5 a 20 ppm. Las curvas se corrieron a una longitud de onda de 280 nm y presentaron valores de R² mayores de 0.997. La identidad de los picos se efectuó mediante la comparación de los tiempos de retención y espectros de UV con estándares comerciales.

Actividad enzimática

Una muestra de 40 g de pulpa de zapote mamey se mezcló con 50 mL de acetona helada (15 °C). La mezcla se homogenizó en una licuadora doméstica por un minuto y se filtró con bomba de vacío para separar la fase sólida que se denominó polvo de acetona. Este procedimiento se repitió hasta que el polvo tomó un color blanco. Finalmente, el polvo de acetona se dejó secar a temperatura ambiente y se almacenó a 20 °C para su posterior evaluación. Los métodos de ^{Lamikanra (1995)} y ^{Flurkey & Jen (1978)} fueron aplicados para evaluar las actividades enzimáticas de la polifenol oxidasa (PPO; EC. 1.14.18.1) y la peroxidasa (POD; EC. 1.11.1.7). Para ambas enzimas, 0.2 g del polvo de acetona se mezclaron con 5 mL de Tris-HCl (TH) 100 mM de pH 7.1 que contenía polivinil pilirridona al 1 %. La muestra se homogenizó con un equipo Ultra Turrax T25 (IKA Labortechnik, Staufen, Germany) por 30 s y se centrifugó (Sorvall centrifuge RC-5B, GMI, USA) por 20 min a 10,000 x g y a 4°C. Para evaluar la actividad enzimática de la PPO, se corrió un ensayo con 2 mL del sobrenadante que se mezcló con 3 mL de catecol 60 mM disuelto en TH. El cambio en la absorbancia se evaluó a 420 nm en un espectrofotómetro Genesys 10 (Thermo Fisher Scientific Remel Inc., USA) empleando TH como blanco y celdas de cuarzo. En el caso de la POD, 0.05 mL del sobrenadante se mezclaron con 2.6 mL de TH, 0.25 mL de guayacol 0.1 M, y 0.1 mL de peróxido de hidrógeno al 0.25 %. El cambio de absorbancia se midió a 470 nm por 3 min. Los ensayos se condujeron a 20 °C y la actividad enzimática fue reportada como U g1, donde una unidad enzimática (U) se definió como 1 μmol de benzoquinona formada por min para la PPO o 1 μmol de tetraguayacol min1 para la POD.

Además de la actividad enzimática, se midió el color de la pulpa fresca del zapote mamey en cada fecha de muestreo de los frutos almacenados a 12 °C con el fin de detectar oscurecimiento enzimático. El equipo usado fue un colorímetro MiniScan XE Plus (Hunter-Lab, model 45/0-L) en la escala CieLab con el que se obtuvieron los parámetros de color L*, a* y b*. Se analizaron tres frutos por cada fecha de muestreo.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente al azar para realizar un análisis de varianza y pruebas rutinarias de comparación de medias (Tukey, ≤ 0.05), con los datos de firmeza de fruto y compuestos fenólicos, con el fin de identificar diferencias entre los dos estados de madurez de los frutos (pre-climaterio y madurez hortícola). La unidad experimental constó de tres frutos que fueron tomados de manera aleatoria en cada fecha de muestreo, durante el almacenamiento. Con los datos de las diferentes variables analizadas se realizaron pruebas de correlación de Pearson. Para los análisis estadísticos se utilizó el paquete estadístico SAS (^{SAS, 2002}).

Compuestos fenólicos solubles totales y proantocianidinas durante la maduración del fruto

La maduración del fruto de zapote mamey almacenado a 12 ̊ C fue monitoreada como una función de la firmeza de la pulpa. La primera etapa dentro del proceso de maduración (estado 1) tuvo una duración de 15 días, y se caracterizó por presentar valores de firmeza entre 49.3 y 39.6 N. El estado 1 es equivalente a la fase de preclimaterio mencionada por ^{Watada et al. (1984)}. La segunda etapa (estado 2), tuvo una duración de seis días; en esta etapa, la firmeza del fruto decreció drásticamente a valores de 2.7-1.2 N entre los días 15 y 16 (Figura 1). Aunque la tasa respiratoria del fruto no se midió en este estudio, ^{Torres-Rodríguez et al. (2011)} señalan que la fuerte caída de la firmeza del fruto coincide con el pico climatérico, en el cual se alcanza la más alta tasa respiratoria. En la etapa 2 el fruto se encontraba en madurez hortícola, de acuerdo con lo descrito por ^{Watada et al. (1984)}. El perfil de firmeza del fruto fue similar a lo descrito por ^{Alia-Tejacal et al. (2002)} para fruto almacenado a 15 °C. El contenido de compuestos fenólicos solubles totales (TSP) varió desde 2,195.5 hasta 1,017.6 mg GAE 100 g^-1 de peso fresco (FW) respectivamente, entre los días 1 y 15 de almacenamiento (estado 1) (Figura 1). Al alcanzarse 16 días de almacenamiento (DS) los TSP cayeron a 395.3 mg GAE 100 g^-1 FW. Este cambio equivale a una reducción de 2.1 veces, en relación al contenido al inicio del almacenamiento, que es inferior a la reportada por ^{Alia-Tejacal et al. (2002)} en frutos de zapote mamey almacenados a temperatura ambiente (20 °C y 50-60 % de humedad relativa) que fue de 3.2 veces.

Figura 1 Firmeza de la pulpa y compuestos fenólicos solubles totales (TSP) de fruto de zapote mamey durante su maduración a 12 °C. Las barras representan la desviación estándar de la media de tres frutos. 

Los valores promedio de los TSP en la etapa de preclimaterio (estado 1) y madurez hortícola (estado 2) fueron similares a los encontrados por ^{Saucedo-Veloz et al. (2001)} quienes reportaron 1.53 % para frutos en estado 1 y 0.21 % para el estado 2, pero fueron a su vez menores que los valores de 1653 y 646 mg GAE kg^-1 FW informados por ^{Alia-Tejacal et al. (2005a)} para los mismos estados de maduración del fruto. En este sentido, se ha reportado que los TSP en el fruto de zapote mamey son afectados por la temperatura de almacenamiento (^{Alia-Tejacal et al., 2002}), el grado de madurez (^{Saucedo-Veloz et al., 2001}), origen geográfico del fruto (^{Torres-Rodríguez et al., 2011}; ^{Ma et al., 2004}), y el proceso de extracción de estos compuestos, así como el tipo de solvente empleado (^{Yahia et al., 2011}).

El zapote mamey es un fruto que presenta valores de sólidos solubles totales de entre 20 y 30 °Brix. La acumulación de azúcares en el fruto ocurre en las dos primeras semanas después de ser cosechado (^{Torres-Rodríguez et al., 2011}) así que, los TSP cuantificados por el método de Folin-Ciocalteu podrían tener una alta interferencia por azúcares, que pueden tener reacción en el ensayo (^{Singleton et al., 1999}). En tejido vegetal con elevado contenido de azúcares reductores, conviene removerlos, antes de correr el ensayo de Folin-Ciocalteu (^{Stratil et al., 2007}).

Con la aplicación del método de butanol/HCl en el extracto de acetona del fruto de zapote mamey se pudo comprobar la presencia de proantocianidinas polímericas o taninos condensados en el fruto, y cuyo patrón durante el proceso de maduración fue similar al mostrado por los TSP (Figura 2).

Figura 2 Firmeza de la pulpa y contenido de taninos condensados (absorbancia) en fruto de zapote mamey durante su maduración a 12 °C. Las barras representan la desviación estándar de la media de tres frutos. 

Los frutos inmaduros presentan comúnmente elevadas cantidades de taninos condensados, pues constituye un mecanismo de las plantas para salvaguardar la preservación de la especie. El contenido de estos compuestos fenólicos decrece con la madurez del fruto. Sin embargo, algunos frutos mantienen elevadas cantidades de algún tipo de taninos condensados cuando el fruto alcanza su madurez de consumo hortícola, los que contribuyen a su sabor particular.

El comportamiento de las PAs cuantificadas por los métodos de vainillina y DMAC mostró el mismo patrón que los TSP, cuando los frutos pasaron del estado de pre-climaterio (estado 1) a madurez hortícola (estado 2) durante su maduración. Sin embargo, los valores de PAs fueron más bajos y en general, menos variables que los TSP, particularmente en el periodo comprendido entre el día 1 y 15 de almacenamiento. Los valores de PAs por el método de vainillina fueron más altos y más variables que los obtenidos con el método DMAC (Figura 3).

Figura 3 Contenido de proantocianidinas con los métodos de vainillina (izquierda) y DMAC (derecha) en fruto de zapote mamey durante su maduración a 12 °C. Las barras representan la desviación estándar de la media de tres frutos. 

Las diferencias en el contenido de PAs entre los dos métodos podrían deberse a la predominancia de diferentes tipos de PAs en cada etapa de maduración y a la afinidad particular de cada método por un tipo específico de PAs. El método DMAC es más específico para monómeros de flavan-3-ols, y reacciona solamente con unidades terminales, por lo que no discrimina entre monómeros, dímeros o trímeros (^{Hummer & Schreier, 2008}). La catequina y epicatequina reaccionan fácilmente con el reactivo del método DMAC en comparación a cómo lo hacen las PAs oligoméricas (^{Li et al., 1996}), las que tienen mucho mayor afinidad por el reactivo del método de vainillina, especialmente aquellas con grupos hidroxilo m-orientados. (^{Hageman et al., 1997}).

Ninguno de estos dos métodos es específico para taninos condensados (proantocianidinas poliméricas), dado que cualquier monómero de flavanol reacciona en el ensayo (^{Dykes & Rooney, 2006}). Los valores de PAs obtenidos con el método DMAC son similares a los reportados para manzana “Red Delicious” (162 ± 10 mg 100 g^-1 de fruta fresca) y uva roja (54 ± 4.2 mg 100 g^-1 de fruta fresca) (^{Hellström & Mattila, 2008}). De acuerdo con los valores de PAs obtenidos con el método de vainillina, el fruto de zapote mamey contiene más PAs que los frutos antes mencionados. Además, los valores de PAs encontrados en zapote mamey son similares a los reportados en el fruto de persimonio, que varían desde 61.2 hasta 91.5 mg equivalentes de catequina por gramo de peso seco (DW) con el método DMAC, y desde 3.15 hasta 4.03 mg equivalentes de catequina por gramo de DW, con el método de vainillina (^{Zou et al., 2012}). Cabe destacar que, en zapote mamey el contenido de PAs determinado con el método de la vainillina es mucho mayor que con el método DMAC, en la etapa de maduración 2. Este patrón es contrario a lo que se ha informado para persimonio. Estos resultados sugieren que el zapote mamey podría representar una fuente rica de PAs oligoméricas, las cuales se asocian con diversos beneficios para la salud (^{Gorinstein et al., 2011}; ^{Zou et al., 2012}), y que no son comunes en la mayoría de los frutos, ya que aún en el persimonio las que predominan son las PAs monoméricas.

En la Tabla 1 se resumen los resultados promedio sobre materia seca, firmeza de fruto y compuestos fenólicos para los dos estados de maduración del fruto estudiados. La materia seca de la pulpa del zapote mamey se incrementa ligeramente con la maduración del fruto. En el estado 1, el fruto de zapote mamey presentó altos valores de TSP y PAs, pero en madurez hortícola (estado 2), estos valores decrecieron de forma significativa. Como se mencionó en párrafos anteriores, del estado 1 al 2, los TSP se redujeron 2.1 veces; el contenido de PAs determinado por DMAC fue reducido 2.8 veces, mientras que las PAs obtenidas con el método de vainillina fueron reducidas 1.6 veces. Considerando la especificidad de los métodos de DMAC y vainillina hacia un tipo particular de PAs, estos resultados significan que en madurez hortícola (estado 2), en el fruto de zapote mamey predominan PAs oligoméricas. Sin embargo, es necesario realizar nuevos estudios para determinar la estructura química de estos compuestos, y más aún, evaluar sus actividades biológicas.

Análisis de proantocianidinas por HPLC-DAD

En la fracción de etil acetato (EAF) los compuestos fenólicos identificados fueron: ácido gálico (GA), catequina (CAT), epicatequina (EPC), y epicatequina 3-galato (EPCG). Los contenidos de estos compuestos fenólicos (GA, CAT, EPC y EPCG) no fueron estadísticamente diferentes (p<0.05) entre los estados de preclimaterio (estado 1) y la madurez hortícola (estado 2) (Tabla 2). Sin embargo, un compuesto de baja polaridad y por tanto con un elevado tiempo de retención, se observó en proporción elevada con relación a los compuestos fenólicos identificados. Este compuesto, denominado como P6, mostró un incremento gradual a través del proceso de maduración, con valores en el estado 2 que fueron casi el doble de lo observado en el estado 1 (Tabla 2). El compuesto (P6) fue tentativamente identificado como un dímero de epicatequina/catequina, de acuerdo con su espectro de UV y su tiempo de retención (26.5 min). Previamente, ^{Yahia et al. (2011)}, mediante la técnica de espectroscopía de masas, identificaron un dímero de epicatequina en el fruto maduro de zapote mamey, el cual podría corresponder al compuesto P6 observado en el presente estudio.

En ninguna de las muestras analizadas se presentó galocatequina, compuesto fenólico observado en grandes cantidades en la pulpa de zapote mamey cultivar ^{Magaña por Ma et al. (2004)}. La falta de información sobre el cultivar o el genotipo utilizado en la mayoría de los estudios sobre el fruto de sapote mamey dificulta la comparación de resultados.

Debe notarse qué, con excepción del GA, los compuestos CAT, EPC y EPGC, cuantificados por HPLC, son Pas monoméricas, determinadas con el método DMAC. El hecho de que las PAs totales cuantificadas con el método DMAC decrecieran de manera significativa durante la transición del estado 1 al 2, podría sugerir que otras PAs no cuantificadas en el presente trabajo podrían ser las responsables de los cambios observados.

Actividad enzimática

La actividad enzimática de la PPO mostró un incremento continuo durante el almacenamiento y maduración del fruto, y cambió de 61.6 (±27.2) U g¹ en estado preclimatérico (estado 1) a 182.2 (±59.4) U g¹ en madurez hortícola (estado 2). En el caso de la POD, la actividad permaneció en bajos niveles durante el estado 1, pero con un notable incremento durante el estado 2, al cambiar de 633.6 (±183.9) U g¹ en estado de preclimaterio a 7235 (±1139.3) U g¹ en madurez hortícola (Figura 4). La PPO cataliza la conversión de fenoles a o-difenoles a través de la hidroxilación y conversión de o-hidroxifenoles a o-quinonas por medio de la oxidación, lo que resulta en oscurecimiento del tejido vegetal (^{Aydemir, 2004}). La POD es otra enzima oxido-reductasa involucrada en el pardeamiento de tejido vegetal, ya que también oxida difenoles como sustrato (^{Mdluli, 2005}), y podría actuar sinérgicamente con la PPO debido a la formación de peróxido de hidrógeno durante la actividad oxidativa de la PPO (^{Luo & Xie, 2012}).

Figura 4 Variación de la actividad de las enzimas polifenoloxidasa (PPO) y peroxidasa (POD) durante el proceso de maduración de fruto de zapote mamey almacenado a 12 °C. Las barras representan la desviación estándar de la media de tres frutos. 

De los parámetros de color, medidos durante el proceso de maduración de los frutos de zapote mamey almacenados, únicamente la luminosidad mostró cambios. Esta variable mostró una reducción a partir del día 15 de almacenamiento (datos no mostrados), que coincide con el incremento de la actividad de la POD.