Aislamiento y purificación de microalgas

Fueron colectadas muestras de agua en La Playa Las Salinas (26° 4’13.58”N, 109°23’58.67”O), al Noroeste del municipio de Ahome en Sinaloa, y en la Bahía de La Paz (24°16’7.66”N, 110°19’29.53”O) México, a un metro de profundidad y de la columna de agua, ya que lo que se pretendía era obtener especies planctónicas. Las muestra de agua que contenían las microalgas fueron trasportadas al Laboratorio Experimental de Acuacultura Unidad Pichillingue.

Localizado en el kilómetro 17 de la carretera a Pichillingue en La Paz Baja California Sur; posteriormente las muestras se tamizaron con un filtro WHATMAN® (1 µm), después se realizó un lavado con agua marina estéril para disminuir la carga bacteriana que pudieran contener, una vez teniendo la muestra se resembraron en tubos de ensaye con agua marina estéril y medio F/2 (^{Guillard, 1973}) como fuente de nutrientes. Las cepas se aislaron mediante el desarrollo de diferentes métodos, como diluciones seriadas y siembra en placa empleando medio en agar marino (DB-2216). Una vez obtenidas cepas unialgales se procedió a la aplicación de baños por 24 h con una solución a partir de antibiótico (Gentamicina 240 mg 3 mL^-1), a concentraciones de 10 µL de antibiótico en 300 µL de cultivo, realizando posteriormente siembras estriadas en placa en medio agar marino para verificar la ausencia de bacterias. Para poder identificar las microalgas aisladas se tomaron mediciones y fotografías con ayuda de un microscopio Nikon (Optiphot-2) con cámara (Sight Ds-L1) e identificaron los géneros siguiendo las claves descritas en ^{Tomas (1997)} y ^{O’sullivan & Reynolds (2004)} obteniendo tres géneros de microalgas y una de cianobacterias procedentes de la boca del estero la Chicura, Ahome Sinaloa, y otra especie de microalga de Bahía de La Paz B.C.S. Posteriormente las cepas fueron cultivadas en condiciones controlada de iluminación constante (33.7 a µmol fotón m^-2 s^-1), aireación continua, y temperatura promedio de 22 ± 2°C., las microalgas fueron medidas e identificadas morfológicamente como: Chaetoceros sp.(clave interna de laboratorio LPU-1), Chaetoceros sp. (clave interna LPU-3), Synechococcus sp. (clave interna LPU-10) y Dicrateria sp. (clave interna LPU-8).

Una vez identificadas las microalgas, se cultivaron en medio F/2 (^{Guillard, 1973}) hasta con 17 L C/U, la curva de crecimiento se estimó en este volumen mediante conteos diarios con la ayuda de una cámara Neubauer. Los cultivos se mantuvieron de manera semicontinua con una tasa de dilución del 25 % por día, utilizando el volumen de cosecha para alimentación diaria de los tratamientos experimentales con B. plicatilis.

Evaluación de la dieta en Brachionus plicatilis

La evaluación del alimento vivo en B. plicatilis se realizó en garrafones de propileno de 19 L. Se inició a una concentración de 6.3 ± 0.4 rot mL^-1, evaluando diariamente el alimento residual y concentración de los rotíferos antes de su alimentación con ayuda de un hematocitómetro y con una cámara Reuter respectivamente. La concentración de alimento para B. plicatilis fue la misma en todos los tratamientos, manteniendo una concentración algal constante de 80 000-100 000 células mL^-1. Se utilizó la microalga Isochrysis galbana (T-ISO) como alimento control debido a que es una de las especies de mayor uso en alimentación de B. plicatilis, y que forma parte del cepario del laboratorio de microalgas de la UABCS. Los cultivos se mantuvieron por triplicado durante siete días, posteriormente se cosecharon en su totalidad, tanto el cultivo de las microalgas como el cultivo de los rotíferos, para esto se utilizó un tamiz de luz de malla de 40 µm para el caso de los rotíferos y mediante centrifugación a 4000 rpm por 30 min (IEC, modelo GP8R) para las microalgas, finalmente en ambos casos se realizó un lavado con una solución de formiato de amonio al 5 % para reducir las sales. Una vez obtenido el concentrado de microalgas y rotíferos, las muestras fueron congeladas a -40 °C y se liofilizaron por 48 h (Virtis Co, mod 12525) para su posterior análisis bromatológico.

La composición bromatológica en microalgas y rotíferos fue determinada por triplicado siguiendo técnicas espectrofotométricas (Beckman modelo DU® 640). El contenido de proteínas fue determinado con el método de ^{Lowry et al. (1952)}, se utilizó albumina (99 % de pureza) de leche para realizar la curva de calibración. Para la determinación de carbohidratos se siguió el método de ^{White (1987)} y se utilizó glucosa anhidrica (99 % de pureza) para la curva de calibración. La terminación de lípidos totales se realizó mediante el método de ^{Bligh & Dyer (1959)} y se utilizó tripalmina (99 % de pureza) para la elaboración de la curva de calibración. Para la determinación de cenizas se utilizó el método de calcinación a 480ºC por 24 horas con la mufla marca Thermolyne y por diferencia de pesos se terminó el contenido de cenizas.

Análisis estadístico

Los datos de los porcentajes obtenidos en los constituyentes bromatológicos: proteínas, carbohidratos y lípidos en microalgas, y rotíferos alimentados con las diferentes dietas, fueron transformados a valores angulares (ángulo = arco seno) para acercar los datos a la distribución normal. Para determinar diferencias significativas en los constituyentes bromatológicos, se realizaron pruebas de análisis de varianza de una vía (ANOVA), posteriormente se realizó una prueba Tukey que permitiera establecer las comparaciones estadísticas entre los tratamientos. Para estos análisis estadísticos se utilizó el programa STADISTICA 7.

Composición bromatológica de microalgas y rotiferos

Las microalgas utilizadas para alimento acuícola deben tener una adecuada composición química, tamaño, aceptabilidad y digestibilidad para ser consideradas de buena calidad alimenticia, paralelamente las diferentes especies deben tener facilidad de manejo bajo condiciones de cultivo. La composición bromatológica de las microalgas evaluadas fue diferente (p>0.05), variando sus constituyentes en función del genero de microalga (Figura 3). Dentro de los constituyentes bromatológicos, el contenido de proteínas en microalgas fueron las que representaron la mayor proporción, siendo en la Chaetoceros sp. (LPU-2) estadísticamente similar a I. galbana, con un promedio de 31.7 % y 31.8 % respectivamente. Estos porcentajes son cercanos a los reportados por ^{Jamali et al. (2015)} con concentraciones de proteína de 39.8 % en Chaetoceros muelleri y de 30.3 % en I. galbana, pudiendo tener variaciones de estos constituyentes en función de las condiciones y edad del cultivo. Las concentraciones de esos constituyentes favorecieron el crecimiento poblacional del rotífero B. plicatilis.

Figura 3 Composición bromatológica de diferentes microalgas: Isochyrisis galbana (Iso), Synechococcus sp. (LPU-10), Dicrateria sp. (LPU-8), Chaetoceros sp. (LPU-2), Chaetoceros sp. (LPU-4), Chaetoceros sp. (LPU-3). Letras diferentes en los renglones representan diferencias significativas (prueba de Tukey). Los resultados representan la media ± SDs. 

La concentración de carbohidratos en las microalgas mostró similitud entre la microalga control (I. galbana) y la microalga Chaetoceros sp.-LPU-2, sin embargo la mayor concentración de carbohidratos se obtuvo en la cianobacterias Synechococcus sp. (LPU-10) con un promedio de 35 %, esto coincide con lo reportado por ^{Brown et al., (1997)} quien menciona que en microalgas las clorofitas son ricas en carbohidratos. En la alimentación de los rotíferos, es importante la composición de estos constituyentes alimenticios (microalgas) y especialmente la proporción proteína:carbohidratos, ya que se ha encontrado que entre mayor sea esta (alto contenido de proteína y bajo porcentaje de carbohidratos), se logra extender el periodo de vida en el rotífero Brachionus manjavacas (^{Snell, 2014}), incrementándose las reproducciones en rotíferos. En los resultados aquí obtenidos, las mayores proporciones proteínas:carbohidratos se presentaron en las dietas con Chaetocetos sp. (LPU-2) e I. galbana (control), razón por lo cual se le atribuye las más altas poblaciones de B. plicatilis con estas dietas.

El contenido de cenizas de microalgas varió entre especies, estos resultados reafirman que las Chaetoceros spp. (LPU-2, LPU-3 y LPU-4) al ser diatomeas, resentan mayor cantidad de cenizas debido a su esqueleto de sílice que presentan este género, coincidiendo con lo reportado por ^{Martínez-Córdova et al. (2012)}, quienes reportan para la microalga Chaetoceros muelleri concentraciones de cenizas entre un 34 hasta un 46 %, mientras que en este trabajo se obtuvieron para este mismo género concentraciones de 34 a 42.3 %.

Los lípidos tienen función específica en el desarrollo de los rotíferos, deficiencias de estos puede ocasionar problemas en los procesos reproductivos, disminución de visión, anemia y mortalidad durante su cultivo, principalmente derivado de disminución de las funciones de fosfolípidos en el sistema nervioso central y en el cerebro (^{Glencross, 2009}). Por estas razones, se busca que tanto el alimento suministrado como los rotíferos cultivados en laboratorio, además del contenido de proteínas contengan alta concentración de lípidos. En resumen, este contenido lipídico, proteínas y carbohidratos en B. plicatilis está influenciado directamente por el alimento consumido (^{Cabrera et al., 2005}). Esto coincide con los resultados obtenidos en este estudio, en donde se muestra que la máxima cantidad de lípidos registrada en B. plicatilis fue de 26 %, usando como alimento la diatomea Chaetoceros sp. (LPU-3) que también es una de las diatomeas que mayor cantidad de lípidos presentó (Figura 4). Estos resultados son muy próximos a los reportados por ^{Campaña-Torres et al. (2012)} con B. rotundiformis con un 21 % de lípidos alimentados con Nannochloropsis oculata. Por otra parte, resultados obtenidos por ^{Melo Costa et al. (2009)} con una dieta de Chaetoceros calcitrans para B. plicatilis mostraron un crecimiento poblacional similar a los reportados en este trabajo (día 7 de cultivo). Esto se le atribuye a que la micoalga Chaetoceros sp. (LPU-2) presenta similutudes a C. calcitrans en contenido de proteínas y lípidos, ya que un alimento algal con bajo contenido de lípidos impediría un aumento en la densidad poblacional de los rotíferos debido a la disminución de su tasa eclosión, siendo constituyentes esenciales en funciones estructurales de las celula, transporte de nutrientes, entre otras funciones.

Figura 4 Composición bromatológica en rotiferos B. plicatilis alimentados por 8 días con diferentes microalgas: Isochyrisis galbana (Iso), Synechococcus sp. (LPU-10), Dicrateria sp. (LPU-8), Chaetoceros sp. (LPU-2), Chaetoceros sp. (LPU-4), Chaetoceros sp. (LPU-3). Letras diferentes en los renglones representan diferencias significativas (prueba de Tukey). Los resultados representan la media ± SDs.