Cultivo de microalgas y bacterias probióticas

Las microalgas evaluadas en este estudio fueron recolectadas en la Bahía de La Paz, Baja California Sur, México. Las microalgas fueron aisladas y preservadas en el depósito de cepas de la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS). Los medios de cultivo fueron enriquecidos en medios de cultivo F/2 (^{Guillard, 1975}). El cultivo de las cepas se mantuvo en tubos de ensaye y matraces en condiciones controladas e inoculando en volúmenes progresivos. Los cultivos en matraz (≥ 1 L), garrafones y tanques de policarbonato cilíndricos y translúcidos (300 L) se mantuvieron al aire libre sin luz artificial ni control de temperatura. Los tanques 300 L se mantuvieron en cultivos semicontinuos (30 % del volumen se cosechó diariamente y se completó el nivel de los tanques con agua de mar enriquecida y esterilizada). El rendimiento obtenido de cultivo se utilizó para alimentar a las larvas de camarón. Los tratamientos experimentales se compararon con Chaetoceros muelleri, utilizado como control de alimentación; éste se mantuvo a una temperatura de 21 ± 1˚C con luz continua (2,500 lux) con lámparas de luz de día y aireación constante.

Las cepas de bacterias evaluadas fueron proporcionadas por el depósito de Ciencia y Tecnología de Alimentos (BCSSU) de la UABCS. Las cepas presentaron características de morfología bacilar y no esporulante, catalasa-negativa y gram-positiva. Las bacterias probióticas se reactivaron y cultivaron en caldo MRS con una temperatura de 34 °C. Los cultivos se realizaron en un volumen de 1 L y se centrifugaron a 3,500 rpm durante 30 min; se descartó el sobrenadante y se recuperaron las bacterias para ser resuspendidas en 500 mL de agua de mar esterilizada. Después de preparar el medio, eran añadidas a los tanques de cultivo (80 mL a cada tanque con una densidad de 1x 108 UFC mL L^-1).

Condiciones experimentales para Penaeus vannamei

Se utilizaron nauplios de Penaeus vannamei (estadios 4-5) proporcionados por el criadero Granjas Marinas de Sinaloa, S. A. de C. V. GRANMAR, localizado en Baja California Sur, México. Los nauplios se mantuvieron en un garrafón de polietileno de 15 L con una corriente de aire constante y se acondicionaron a un rango de temperatura de 27-28 °C durante 3 h. Después de mezclar manualmente el contenido del tanque, se realizó un conteo volumétrico de las larvas para estimar en número de nauplios mL^-1 considerando 10 muestreos de 10 mL cada una. Después del conteo, los nauplios se distribuyeron en las unidades experimentales instaladas.

El experimento se realizó en un área de cultivo aislada en la cual se mantuvo la temperatura a 30 ± 1 °C, utilizando calentadores ambientales eléctricos. El sistema de cultivo consistió en 24 unidades de tanques de fibra de vidrio de fondo plano con una capacidad de 120 L c/u, colocados en un arreglo de 2 hileras. Todas las unidades experimentales eran suministradas con agua de mar filtrada (1 μm), además se añadió una solución de hipoclorito de sodio comercial a 35 ppt. La solución se neutralizó después de 24 horas con tiosulfato de sodio. La aeración fue continua mediante difusores de acuario. El fotoperiodo fue de 12-12 horas y sin recambios de agua. Se realizaron siete ensayos con un control de acuerdo con la siguiente descripción:

Todos los tratamientos se realizaron por triplicado (24 tanques). El cultivo se comenzó a partir del estadio Zoea I hasta Mysis I. Las larvas de camarón se distribuyeron en cada uno de los tratamientos a una densidad de 170 Nauplios L^-1 (11,900 organismos por tanque experimental). Todas las unidades experimentales se cubrieron con una lámina de polietileno para evitar la contaminación entre cada uno de los tratamientos. Diariamente se registró la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto y la salinidad con el equipo Hanna HI9828.

El régimen de alimentación consistió en la adición de microalgas y dietas mixtas de microalgas y probióticos (ensayos de alimentación de A-H). Las microalgas presentaron una densidad celular de 80,000 a 120,000 células mL^-1 en los cultivos larvales, además se añadieron tres cepas de bacterias probióticas a proporciones iguales (1:1:1) y se sembraron a una densidad final de 114x103 UFC mL^-1. Para la evaluación del efecto de las dietas en los parámetros zootécnicos de larvas de Penaeus vannamei, se llevó a cabo un seguimiento de la supervivencia y el tamaño de etapas de Zoea I a Mysis I. Considerando todas las unidades experimentales, la supervivencia de los organismos se estimó con base en el porcentaje de organismos vivos registrados en cada etapa; el tamaño se determinó con base en la longitud de 50 organismos al inicio del experimento y 20 al final. La identificación de cada una de las primeras etapas del desarrollo de P. vannamei se realizó con base en las características morfológicas (^{Kitani, 1986}). La longitud total se midió con un estereoscopio con un micrómetro manual (Reichert).

Para evaluar el efecto sobre la composición de la larva, se colectó una muestra de éstas en estadio Zoea I mediante el uso de un tamiz de 30 μm de luz de malla al iniciar el experimento, el resto de las larvas se recolectó al finalizarlo. Las larvas se lavaron con agua destilada y se colocaron en tubos Falcon con 55 mL de capacidad, se liofilizaron y almacenaron a -40 °C hasta la realización de los análisis bromatológicos, los cuales consistieron en cenizas, proteínas (^{Bradford, 1976}), carbohidratos totales (^{Whyte, 1987}) y lípidos totales (^{Bligh & Dyer, 1959}) éste último también se realizó en las microalgas.

Para determinar la presencia de probióticos de Lactobacillus sp. en los tanques experimentales, se tomaron muestras de 2 mL de muestra. La muestra se diseminó (20 μL) en cajas Pretri preparadas con un medio de cultivo MRS, posteriormente se incubaron durante 24 h a una temperatura constante de 34 °C. Después de la incubación se realizó el recuento de colonias. Las muestras se recolectaron al iniciar y al finalizar el experimento.

Análisis estadístico

Se realizaron pruebas de normalidad y homogeneidad de la varianza de los datos previo a la realización de los análisis estadísticos. El porcentaje de supervivencia, el contenido de proteínas, lípidos y carbohidratos para microalgas y larvas, se transformaron en arco seno; posteriormente se realizó un análisis de varianza de una vía para cada caso. Para la evaluación de las dietas sobre el crecimiento de Zoea I y Mysis I se realizó un análisis de varianza de una vía para todos los ensayos. Para los casos donde se encontraron diferencias estadísticas significativas se realizó el análisis de la prueba a posteriori de Tukey. Para los análisis estadísticos se utilizó el software STATISTICA 7.0 para Windows (Statsoft, USA; α=0.05).

Desarrollo de P. vannamei en cultivo

La densidad celular de las microalgas varió entre las cepas. Los cultivos no axénicos se mantuvieron en condiciones semi-continuas a partir del día 4 de cultivo (Figura 1). Se observaron fases de retraso en todas las curvas, este comportamiento se hace evidente en las diferentes tasas de crecimiento de cada especie de microalgas al ser comparadas con el experimento control (C. muelleri), el cual se encontraba en condiciones de luz y temperatura definidas. Se observó que a partir del día, 4 la densidad celular fue afectada en el 30 % de los cultivos, donde se encontraron las concentraciones más altas fue en C. muelleri. El potencial de crecimiento y concentración de biomasa en Grammatophora sp., Schizochytrium sp. y Navicula sp., se observó en los cultivos semicontinuos. La concentración máxima se detectó hasta el día 9 en el experimento control, el cultivo masivo al exterior de microalgas ofrece la ventaja de generar un alimento vivo a bajo costo. De manera adicional, el uso de microalgas endémicas en la producción de larvas de camarón disminuye los riesgos ambientales que ocurren si se introducen especies ajenas a la región donde se localizó el cultivo. En este sentido, el uso de este tipo de investigaciones permite reforzar varios de los retos propuestos en la actualidad para generar una acuacultura económicamente sustentable; ya que por un lado se lleva a cabo una integración de los sistemas de cultivo ya existentes (microalgas y larvas de camarón), y por el otro, presenta una alternativa de alimentación con calidad nutricional rica en lípidos (^{Crab et al., 2012}).

Figura 1 Incremento de densidad celular en cultivos masivos de cuatro especies de microalgas bajo condiciones semicontroladas (Chaetoceros muelleri) y cultivadas al exterior (Grammatophora sp., Schizochytrium sp. y Navicula sp.). 

En cuanto a los valores de supervivencia obtenidos en las etapas de Nauplio a Mysis I alimentadas con distintas especies de microalgas (A, B, E y F), probióticos y algas mixtas, éstos mostraron diferencias significativas (p<0.05) entre los tratamientos. Los tratamientos en los que se observó mayor supervivencia fueron los tratamientos donde las larvas se mantuvieron con la mezcla de microalgas de Grammatophora sp. + Schizochytrium sp. (Gr + Sk), Grammatophora sp. + Schizochytrium sp. + Probiótico (Gr + Sk + Prob) y Chaetoceros muelleri (control). El tratamiento donde se alimentaron las larvas con Navicula sp. presentó una mortalidad cercana del 100 % (Figura 2). En publicaciones anteriores, se ha reportado una buena composición bromatológica al alimentar a los organismos con dietas que incluyen estas microalgas (Navicula sp.), inclusive se ha considerado para la formulación de gránulos para alimentar peces como la especie Spaurus aurata (^{Reyes-Becerril et al., 2013}; ^{Pacheco-Vega et al., 2015a)}. La composición bromatológica de Navicula sp. La reportó ^{Curbelo et al. (2004)} y debido a su buena composición, propusieron un alimento vivo para larvas de camarón que incluía una combinación de esta cepa con Artemia salina. En este trabajo las células de Navicula sp. se depositaron en el fondo formando una película que dificultó su consumo por las larvas, esto debido a que los camarones tienen un comportamiento planctónico en sus primeros estadios no se alimentan de microalgas sedimentadas. En este trabajo las larvas del tratamiento que contenía Navícula sp. no fueron consumidas por la razón antes mencionada.

Figura 2 Supervivencia larval de Zoea I de Penaeus vannamei alimentadas con Chaetoceros muelleri (A), Grammatophora sp. (B), Grammatophora sp.+ Schizochytrium sp. (C), Grammatophora sp.+ Schizochytrium sp. + probiotico (D), Navicula sp. (E), Schizochytrium sp. (F), Navicula sp. + Schizochytrium sp. (G), Navicula sp. + Schizochytrium sp. + probiotico (H). 

El tamaño de las larvas mostró diferencias entre los tratamientos, en el tratamiento control fue donde se alcanzó la mayor talla (3.0 mm) y presentó una diferencia significativa (p<0.05) comparada con el resto de los tratamientos (Figura 3). Cabe señalar que tanto el tratamiento control como los que incluyen el tratamiento con Grammatophora sp., Grammatophora sp. + Schizochytrium sp., y Grammatophora sp. + probióticos, alcanzó la etapa de Mysis I en el día 9, mientras que los tratamientos con Schizochytrium sp., en combinación con Navicula sp. y con los probióticos, se alcanzó la misma etapa hasta el día 11. Con base en este resultado, es posible que los tamaños alcanzados hayan tenido influencia de los factores tales como la calidad del agua y las características intrínsecas de los géneros y especies de cepas de las algas seleccionadas.

Figura 3 Tallas de Penaeus vannamei en estadio larval Misis I alimentadas con Chaetoceros muelleri (A), Grammatophora sp. (B), Grammatophora sp.+ Schizochytrium sp. (C), Grammatophora sp.+ Schizochytrium sp.+ Probiótico (D), Navicula sp. (E), Schizochytrium sp. (F), Navicula sp. + Schizochytrium sp. (G), Navicula sp. + Schizochytrium sp. + Probiótico (H). 

En los últimos años se ha reportado que además de los componentes bromatológicos, se conocen alrededor de 10,000 metabolitos secundarios (^{Fusetani, 2000}) que son específicas de un taxón (géneros y especies) de microalgas y pueden influir en los organismos alimentados con estos (^{Roy & Pal, 2015}; Van Durme et al., 2013). Cabe resaltar que los tratamientos en combinación de Grammatophora sp. y Schizochytrium sp. utilizados para alimentar las larvas de P. vannamei, presentaron alta supervivencia. Las dietas que contienen dos especies de microalgas tienen mejor resultado en la supervivencia, esto se refleja subsecuentemente en beneficios en la supervivencia de las larvas debido al suministro de diversas microalgas con diferente valor nutrimental, en contraste a los resultados observados en dietas con una sola microalga (^{Jamali et al., 2015}). Por otro lado, se observó que es factible el cultivo al exterior de las especies de microalgas estudiadas en este trabajo, sin importar la temperatura o el control de la luz. En este sentido, la calidad del agua se mantuvo homogénea entre todos los tratamientos y en rangos aceptables para las condiciones de cultivo (^{Boyd & Tucker, 1998}). La supervivencia, el crecimiento y el tiempo transcurrido para la metamorfosis en las larvas, se atribuyen a la composición bioquímica de las microalgas, dado que los nutrientes de las células pueden variar (proteínas, lípidos y carbohidratos).

Composición bromatológica en larvas de camarón

Las características físicas de la membrana de las microalgas están directamente relacionadas con la actividad de los carbohidratos altamente digestivos. Específicamente los tratamientos en los que se encontraba Schizochytrium sp., ya que presentan paredes celulares flexibles y digeribles con un alto contenido de polisacáridos (^{Darley et al., 1973}). En este trabajo las características físicas y químicas de los alimentos (microalgas) presentaron un efecto directo sobre la digestión y absorción de nutrientes por las larvas de camarón (Tabla 2).

El porcentaje de proteína total en el estadio Zoea I se reportó en un rango de 55.7-66.9 %, en donde los valores más bajos se presentaron en las dietas con Navicula sp. + Schizochytrium sp. + Probiótico; el contenido más alto fue en Grammatophora sp.

Los requerimientos de proteína para el desarrollo del camarón son de gran importancia en términos de nutrición. En este experimento, se detectó un alto contenido de proteína cruda en los análisis bromatológicos en microalgas. Estos resultados indican una combinación favorable, ya que es posible que no sólo sea un alto contenido proteico, sino que además ésta sea fácil de digerir por las larvas de P. vannamei. Adicionalmente, ^{Pacheco-Vega et al., (2015a)} mencionan que estas especies de microalgas presentan concentraciones bajas de proteínas; si se pretende analizar el contenido proteico por sí solo, este valor no es relevante, pero al combinar las distintas fuentes de proteína (ya sean de origen vegetal o animal) o por la presencia de bacterias (^{Ziaei-Nejad et al., 2006}), se sustenta el contenido de proteína cruda. Existen otros factores que influyen el proceso de digestión de los alimentos en las larvas, por un lado, los factores exógenos, como son la temperatura, el tránsito de los alimentos, el pH de las larvas y oxígeno disuelto, y por otro los factores endógenos, tales como el tamaño de la larva y la ubicación de los órganos digestivos, los cuales complementan la información para realizar un análisis exhaustivo del aprovechamiento del alimento en las larvas (^{McGaw & Curtis, 2013}). Por ejemplo, al conocer los factores endógenos, nos permitirá conocer el desarrollo del tracto digestivo de la larva de camarón hasta convertirse en un camarón adulto. ^{Sainz-Hernández & Córdoba, (2009)} mencionan que los hábitos alimenticios de los camarones en estado larvario se basan en el consumo de microalgas, al llegar a su estadio juvenil estos hábitos se modifican, ya que empiezan a desarrollar enzimas digestivas como tripsina y quimotripsina (enzimas proteolíticas), lo cual se debe al consumo de animales pequeños, con lo cual se incrementa su consumo de proteína en la dieta.

En el caso de los parámetros de la calidad de agua (oxígeno disuelto, temperatura y salinidad), estos se mantuvieron dentro del rango óptimo para el cultivo de camarón, por lo que no se tuvo afectación de estas variables en los resultados aquí obtenidos. Es deseable que se conserve la calidad de agua para el desarrollo de una acuacultura sustentable en donde se pretende evitar la afectación del medio ambiente (^{Crab et al., 2012}).

El contenido total de lípidos observado en los resultados es menor en larvas alimentadas con Navicula sp. + Schizochytrium sp. Las concentraciones más altas fueron en la dieta control con C. muelleri y en el trabamiento con Navicula sp. + Schizochytrium sp. + el probiótico. De acuerdo con ^{Pacheco-Vega et al. (2015b)}, las diatomeas Grammatophora sp., proporcionan una serie de ácidos grasos poliinsaturados, los cuales pueden favorecer la digestibilidad de los lípidos.

El contenido de carbohidratos se presentó en un rango de 1.76 a 6.75 %. El valor más bajo se obtuvo en el estadio de Mysis I con el tratamiento de Grammatophora sp. y el porcentaje más alto en larvas alimentadas con Schizochytrium sp. Los resultados obtenidos describen que esta especie de microalga contiene un alto contenido de carbohidratos, sin embargo, no se presentó evidencia que éstos hayan podido ser digeridos por las larvas de P. vannamei. Lo anterior es atribuible a los camarones, como ya se ha comentado en el párrafo anterior, que presentan una adaptación enzimática de la etapa tardía Zoea, provocada por el cambio de hábitos alimenticios (^{Sainz-Hernández & Cordova, 2009}) y aunque no se tenga evidencia de que los carbohidratos representan una necesidad alimentaria básica para los camarones (^{Jamali et al., 2015}), es posible que el contenido de carbohidratos en larvas haya variado por la presencia de las microalgas, ya que estas contienen carbohidratos en las membranas celulares (^{Sørensen et al., 2016}).

El aporte nutricional suministrado por las microalgas y la presencia de bacterias probióticas en los cultivos de larva de camarón mejoran la actividad de los carbohidratos, ya que, al momento de romper las membranas celulares de las microalgas, quedan disponibles sus componentes en calidad de sustratos, lo que permite llevar a cabo la digestión de proteínas y lípidos intracelulares. En este estudio, es posible que, al igual que para lípidos, haya sido posible la digestión de carbohidratos por la estimulación de bacterias probióticas presentes en el ambiente del cultivo. Hay que recordar, que estas bacterias son del género Bacillus, las cuales contribuyen con enzimas exógenas para mejorar la digestión de los nutrientes (^{Ziaei-Nejad et al., 2006}). Conforme se desarrolla el tracto digestivo de los camarones desde larvas hasta juveniles, los camarones son capaces de procesar alimentos con un mayor contenido de proteína, es posible que el alimento mixto (microalgas y/o bacterias probióticas ácido lácticas) promuevan la digestión de los nutrientes en la dieta. En este trabajo el alimento mixto de especies nativas balanceó el rendimiento del crecimiento y redujo los costos de producción, al compararlo con C. muelleri, especie no nativa de la región.