Colecta de muestras

Las muestras se maíz se colectaron en cuatro municipios: Cosoleacaque, Paso de Ovejas, Medellin y Tlalixcoyan durante el periodo de los años 2006 a 2007 (Tabla 1). Las plantaciones de maíz muestreadas estaban en la etapa fenológica de emergencia de la flor. Se colectó un total de 228 muestras de hojas de 28 genotipos identificados; de éstas, algunas mostraban síntomas virales putativos como manchas cloróticas, amarillamientos, bandeados rojizos longitudinales, necrosis y achaparramientos. A las hojas colectadas se les removió la nervadura principal central y las dos mitades longitudinales de la hoja se guardaron en una bolsa plástica, en una caja con hielo para ser almacenadas a -70 °C en un ultracongelador hasta que fueron analizadas.

Ensayos tipo DAS-ELISA

El método indirecto de inmunoabsorción con enzima ligada (DAS-ELISA) se hizo usando cartuchos comerciales que incluían todos los reactivos, así como los controles positivos y negativos (Agdia, PathoScreen, Elkhart, IN). Para estos ensayos se usaron 100 μL de extracto crudo de hojas (diluidos 1:10 w/v en solución amortiguadora de extracción). El color de la reacción de la enzima ligada se reveló usando p-nitrofenil fosfato (PNP), y la absorbancia se leyó a 405 nm usando un lector de placa de microtítulo (Ultramark Bio-Rad). Las muestras de hojas de maíz se probaron contra siete virus para encontrar las variantes mexicanas putativas de: MDMV, SCMV, MCMV, MSpV, BMV, MMV y MWLMV. El CSS también se rastreó usando el mismo procedimiento. En todas las pruebas se usaron controles positivos y negativos. Las muestras fueron consideradas como positivas cuando el valor de la absorbancia fue por lo menos tres veces más grande que la de los controles negativos.

Análisis tipo Northern

En el caso de las pruebas de ELISA para SCMV y MDMV, puede haber reacción cruzada entre los anticuerpos, tal como lo indica la compañía manufacturera (Agdia Inc) y de acuerdo a nuestra experiencia previa. Los anticuerpos contra MDMV tienen reacción cruzada contra el SCMV, pero esto no ocurre en sentido opuesto. Para soslayar esta posible ambigüedad, en los ensayos se realizaron hibridaciones tipo Northern del RNA para cada muestra de Veracruz con una sonda de proteína de cubierta (CP) de un aislamiento, previamente reportado, el SCMV-Mx (^{Espejel et al., 2006}). Las hibridaciones tipo se realizaron según lo reportado previamente (^{Lindbo & Dougherty, 1992}). Para este fin, se aisló RNA de tejido de hoja usando LiCl. Se separaron 10 μg de RNA por electroforesis usando un gel de agarosa desnaturalizante al 1.2 % con formaldehído y se transfirió a membranas de nylon tipo Hybond N+ (Amersham). Una vez finalizado el tiempo de transferencia, el RNA se fijó a la membrana mediante la exposición a luz ultravioleta. La hibridación se llevó a cabo con soluciones amortiguadoras y ribosondas marcadas con deoxi-CTP [α-32P] (sistema de transcripción In vitro de Promega), incubando la membrana de nylon a 65 °C con una serie de lavados de SSC (soluciones de 0.1 % de duodecil sulfato de sodio y NaCl con 0.015 M de solución de citrato de sodio), con astringencias crecientes. La señal de hibridación se detectó usando un equipo Storm 860 con la versión 1.1 de ImageQuant de BioRad. Se registró como positiva la presencia de virus en la muestra cuando la señal de una banda fue de 800 bp de talla. Se usaron plantas sanas como control negativo de la infección y como control positivo una planta que ya había sido previamente identificada como tal en nuestro grupo. Se hicieron secuenciaciones de nucleótidos tipo Sanger (servicio institucional de secuenciación), de la CP de muestras seleccionadas, después de haber amplificado los productos por RT-PCR.

Identificación de genotipos de maíz

La identificación de los genotipos de maíz se hizo por el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) y por el Programa Regional de Maíz de América Central que han desarrollado algunos de estos híbridos de maíces tropicales (^{Jeffers et al., 2004}), así como por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), quienes desarrollaron los híbridos H-518, H-520 and H-513 (^{Sierra et al., 2004}).

Identificación de virus y espiroplasma

Se colectó un total de 228 muestras de maíz de los municipios muestreados (Figura 1 y Tabla 1), durante los dos años que duró este estudio. Se encontraron 11 discrepancias, en todas las muestras, entre los análisis de DAS-ELISA y la hibridación tipo Northern para el SCMV. Esto representó una variabilidad de 4.8 % entre los dos métodos. Estas discrepancias se explican por el hecho de que las dos técnicas detectan dos componentes virales diferentes (en ELISA se detecta la proteína de la cubierta (CP) y en las hibridaciones tipo Northern, el RNA genómico). La secuenciación de nucleótidos de la CP del SCMV confirmó la naturaleza de las muestras que dieron positivas por DAS-ELISA (datos no mostrados).

Figura 1 Abundancia relativa de seis virus y un espiroplasma. A) Resultados de la suma de todas las muestras positivas de todos los municipios. B) Incidencia en Cosoleacaque y Tlalixcoyan. En todos los casos, los círculos representan la distribución de las plantas infectadas y no infectadas y los tipos de infecciones mixtas. 

La identificación de los virus y su abundancia en las regiones de Veracruz mostraron que el 46 % (105/228) de las plantas probadas contenían al menos uno de los virus o espiroplasma (Figura 1A). Las pruebas de laboratorio de todas las muestras colectadas indicaron abundancias de infecciones sencillas, dobles, triples y cuádruples de 62.5, 30.8, 4.8 y 1.0 %, respectivamente (Figura 1A) del MDMV, SCMV, MCMV, MSpV, BMV y del MWLMV que se detectaron en infecciones sencillas o mezcladas. El MMV estuvo ausente mientras que el SCMV fue el virus más común, infectando al 21.9 % (50/228) de las muestras analizadas. La infección con CSS tuvo una abundancia similar al SCMV con 49/228 (21.5 %). Ambos se encontraron conjuntamente en infecciones dobles, triples y cuádruples (Tabla 2). La infección con CSS fue seguida en frecuencia por el MDMV, MCMV, MsPV, MWLMV y el BMV, presentes en un 12, 3.5, 2.6, 1.8 % y un 0.4 %, respectivamente en las muestras (Figura 1A). En los dos años que duró el estudio, MDMV+SCMV fue la combinación doble de infección más frecuente en las muestras del municipio de Cosoleacaque, como se puede ver en la Figura 1B, mientras que la infección triple más común fue MDMV+SCMV+CSS. Solamente encontramos una muestra infectada con la combinación cuádruple de MDMV+SCMV+MCMV+MWLMV (Tabla 2).

Distribución y abundancia de virus y espiroplasma

En el municipio de Cosoleacaque se analizó un total de 84 muestras (Tabla 1), el 69 % de ellas tenían infecciones sencillas dobles, triples y cuádruples, mientras que el 31 % no tenían virus ni espiroplasmas. El mayor tipo predominante de infección en esta región, representada en la gráfica de pastel, fue la infección sencilla con SCMV (48 % de abundancia), seguida por las infecciones sencillas de MDMV (30 %) y CSS (26 %), en 14 muestras (Figura 1B). Solamente una planta estuvo infectada simultáneamente con cuatro virus y las infecciones triples se detectaron en cuatro muestras (Tabla 2). En estos casos, el MDMV y el CSS prevalecieron. El espiroplamsa CSS fue detectado en infecciones sencillas o mezcladas con MDMV, SCMV y MWLMV, pero no con MCMV, MSpV ni BMV. Los virus BMV y MMV estuvieron ausentes en Cosoleacaque (Figura 1B). MCMV fue el virus con menor ocurrencia en Cosoleacaque (2.4 %), estando 20 veces menos que el SCMV. El virus más común y disperso en el área de estudio fue el SCMV. El municipio de Cosoleacaque fue el que presentó mayor incidencia de este virus. Este municipio también fue la localidad que registró los porcentajes más altos de muestras infectadas con virus y con espiroplasmas.

En el municipio de Medellín, solamente colectamos cinco muestras de los campos de maíz. No se detectaron virus, y solamente una planta fue positiva para infección con CSS. En Paso de Ovejas, se analizaron 21 muestras de cuatro regiones con resultados similares a los de Medellín. No se detectaron virus, y solamente una muestra presentaba infección por CSS. En el municipio de Tlalixcoyan se colectaron 118 muestras (Tabla 1). En este municipio el 63 % de las plantas analizadas no presentaban virus o CSS; sin embargo, el 37 % de ellas (44/118) estaban infectadas (Figura 1B). De estas, las infecciones sencillas fueron predominantes (81.8 %), y CSS prevaleció. El SCMV estuvo presente en 10 muestras que dieron positivas para este virus (8.5 % de abundancia en la Figura 1B) y fue por lo tanto el virus más común en este municipio. En infecciones triples, el SCMV fue el virus más abundante, y las infecciones con el espiroplasma estuvieron presentes en el 23 % de las muestras. En Tlalixcoyan, el CSS estuvo presente en infecciones sencillas o mezcladas con diversos virus como el MDMV, SCMV, MCMV y el MSpV pero estuvieron ausentes el BMV, MMV y el MWLMV (Tabla 2). Sin embargo, se detectaron plantas en infecciones sencillas o mezcladas con el BMV, a diferencia de los encontrado en Cosoleacaque, Medellín o Paso de Ovejas. El MMV no se detectó en ninguna de las muestras analizadas. El MCMV tuvo una abundancia del 5 % seguido por el MDMV y el MSpV con un 2.5 %. Por otro lado, los virus con menor ocurrencia en Tlalixcoyan fueron el BMV y el MWLMV con un 0.8 % (Figura 1B). La ausencia de MMV y la menor ocurrencia del MSpV se puede explicar en términos de la baja presencia de la chicharrita (Peregrinus maidis) que es vector de este virus. De hecho, solamente encontramos un reporte de la presencia de MMV y de su vector en Tabasco en 1984 (^{Rocha-Pena et al., 1984}). Cabe mencionar que en este estudio no se buscaba la distribución de este vector en nuestras áreas de estudio. La alta incidencia de SCMV y de MDMV podría ser debida a diferencias de temperatura entre los municipios de Cosoleacaque y Tlalixcoyan, registrados por los servicios de Conagua (Servicios Meteorológicos en México), (^{Conagua, 2018}). Es sabido que los cambios en temperatura favorecen las poblaciones de insectos vectores como son los áfidos (^{Yañez-Morales & Peña-Martinez, 1991}). Por el contrario, podríamos asumir que las poblaciones de cicadélidos no fluctuarían tanto como las de los áfidos ya que tienen amplios rangos de temperaturas de oviposición que están en el rango de 15 a 40 °C (^{Van Nieuwenhove et al., 2016}). Esto garantizaría niveles poblacionales similares con la prevalencia concomitante de CSS en ambas localidades. Los resultados de nuestras búsquedas sugirieron que MDMV, SCMV, MCMV, MSpV, BMV y MWLMV son virus que infectan plantas de maíz crecidas en la región de estudio en Veracruz. En México, el SCMV se reportó en 2006 por primera vez. Este virus puede infectar diferentes cultivos (por ejemplo, maíz, sorgo y caña de azúcar), causando síntomas como clorosis, mosaicos y achaparramientos (^{Espejel et al., 2006}). Los resultados reportados en este estudio, indican que las plantas de maíz presentan síntomas característicos de una infección con SCMV y con los ensayos de diagnóstico confirmamos la prevalencia de este virus. En las fases tempranas de una epidemia, un individuo se infecta con un tipo de virus; cuando la epidemia continúa hay un incremento en la densidad de las poblaciones virales y esto aumenta la posibilidad de infecciones mezcladas (^{Lamichhane & Venturi, 2015}; ^{Xia et al., 2016}). El SCMV y los demás virus analizados en este estudio se encontraron en infecciones sencillas y mezcladas. Durante nuestros análisis detectamos la ocurrencia del MCMV coinfectando plantas de maíz con SCMV y MWMLV, en infección triple, y en una cuádruple con el MDMV, SCMV y el MWLMV. El MCMV se encontró, no solamente en infecciones mezcladas con otros virus, sino también con el CSS. Hasta ahora, no hemos encontrado otro estudio dirigido a buscar interacciones de virus con CSS y su efecto en la severidad de la enfermedad. En este estudio el MDMV se encontró en las áreas rastreadas con una abundancia del 12 %. Las infecciones mezcladas con la participación del MDMV y MRFV, SCMV o MCMV ya había sido reportada previamente (^{Redinbaugh & Pratt, 2009}), pero no con el MWLMV, como lo reporta este estudio, o con SCMV, MCMV y MWLMV en infecciones dobles, triples y cuádruples. Durante nuestro estudio detectamos al MSpV, BMV y al MWLMV en infecciones sencillas o mezcladas. Estos virus ya han sido reportados en varios países (^{Sharma & Misra, 2011}); sin embargo, en México no se había descrito su presencia. En este trabajo se reporta la presencia de estos virus infectando los campos de maíz en infecciones sencillas y en combinación con otros virus y con espiroplasma.

La enfermedad severa del achaparramiento (CSD) o “complejo del achaparramiento”, es considerada como una de las enfermedades económicamente más impactantes en los Estados Unidos de Norteamérica, México, América Central y América del Sur. Esta enfermedad severa de achaparramiento puede ser causada por la infección de tres patógenos: el MRFV, el CSS o el fitoplasma arbustivo del Maíz (MBS) (^{Bradfute, et al., 1981}). Estudios previos sobre la presencia del CSS mostraron su alta prevalencia y amplia distribución en México y confirmaron que las plantas de maíz están frecuentemente infectadas con este fitopatógeno (^{Alcántara-Mendoza et al., 2010}; ^{Gordon et al., 1985}) y se identificó en algunas de las muestras de todas las áreas analizadas. Este espiroplasma CSS se encontró en co-infecciones con el MDMV, SCMV, MCMV, MSpV y el MWLMV en infecciones dobles, triples y cuádruples (Tabla 2).

Genotipos de maíz e incidencia de virus

En este estudio tratamos de correlacionar los genotipos de las muestras de maíz con la incidencia de la infección. Encontramos que las muestras analizadas pertenecían 28 genotipos de maíz (Tabla 3), y 22 de ellas mostraron infecciones sencillas o mezcladas con virus y/o espiroplasmas. Solamente uno de los genotipos, el 24, 1/33 A-7573 /Tornado mostró una infección cuádruple, pero, no por ello, lo podemos asignar como susceptible a infecciones virales múltiples. El genotipo más frecuentemente colectado fue el A-7573 que incluyó 117 muestras y que estuvo distribuido en Cosoleacaque, Paso de Ovejas y Tlalixcoyan. De todos los genotipos colectados, el 38 % (44/117) tenía por lo menos un virus o espiroplasma. Los genotipos Criollo y VS-536 se identificaron en 13 y 11 muestras respectivamente (Tabla 3). En ambos casos, 9 muestras fueron positivas para el diagnóstico de virus y/o espiroplasma. Cuarenta y nueve muestras pertenecieron a diferentes genotipos distribuidos en todas las comunidades. Treinta y ocho muestras no correspondieron a los genotipos analizados. Estos genotipos desconocidos se distribuyeron en todas las comunidades muestreadas y el 29 % de ellos mostró infecciones sencillas o mezcladas por virus y/o espiroplasma. El genotipo prevalente en este estudio fue el A-7573 que había sido identificado anteriormente como susceptible al achaparramiento del maíz. (^{Sierra-Macías et al., 2010}). Por otro lado, cuatro muestras fueron identificadas como H520. Se ha reportado que los genotipos H-520, H-513, H-518 y C343 tienen mayor tolerancia a la enfermedad del achaparramiento y por lo tanto representan una estrategia alternativa comercial de siembra para la producción de maíz en el estado de Veracruz, con una posible resistencia a la enfermedad del achaparramiento del maíz (^{Sierra-Macías et al., 2010}).

No podemos descartar la presencia de vectores estacionales que representan un aumento en la presión de virus al hospedero (maíz), en las diferentes regiones del estado y estaciones del año. Por ejemplo, de entre los diferentes vectores de los virus detectados en este reporte, como lo son áfidos, chicharritas, nemátodos y plasmidióforos, el primer grupo aumenta sus poblaciones durante el otoño, sin embargo en invierno fue el periodo durante el cual se colectaron la mayoría de las muestras. Sin duda alguna, se requiere hacer más trabajos de identificación, ocurrencia y distribución de virus en los campos mexicanos de maíz.